CN104846081A - 羽衣甘蓝红叶基因Re的SSR标记及应用 - Google Patents

羽衣甘蓝红叶基因Re的SSR标记及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了位于羽衣甘蓝红叶基因Re两侧，并与其紧密连锁的两个SSR标记，C9Z90和C9Z94。这两个标记与Re基因之间的遗传距离分别为0.3cM和2.0cM。根据二者的核苷酸序列分别设计了两对特异扩增引物，用于羽衣甘蓝白叶基因的分子辅助选择。在辅助选择过程中可以同时使用这两个标记，这两个标记重复性好，可靠性高，检测成本低，省时省力。

Description

羽衣甘蓝红叶基因Re的SSR标记及应用
技术领域
本发明涉及与羽衣甘蓝红叶基因Re紧密连锁的简单重复序列(Simple Sequence Repeats , SSR)标记及其获得方法。
背景技术
羽衣甘蓝是十字花科芸薹属甘蓝种的一个变种，为二年生草本植物。原产地中海沿岸至小亚西亚一带，现广泛作为观赏植物栽培，主要分布于温带地区。
我国引种栽培历史不长，但已成为冬春季应用最为广泛的观赏植株。本课题组构建了成熟的羽衣甘蓝小孢子培养技术体系，并创制出了系列DH系。为了加快育种进程，有必要开发出羽衣甘蓝重要观赏性状-红叶性状的分子标记。
目前，还没有获得羽衣甘蓝红叶基因的分子标记，也就无法应用于分子标记辅助选择育种。鉴于SSR标记具有稳定、廉价、方法简便、重复性好等优点，我们开展了筛选与羽衣甘蓝红叶基因Re紧密连锁的SSR标记的研究工作。
发明内容
本发明的目的：提供与羽衣甘蓝红叶基因Re连锁的2个SSR标记；提供由所述SSR标记的PCR引物序列；提供在对羽衣甘蓝红叶基因进行辅助选择的过程中，对上述SSR标记进行应用的方法。
本发明提供的技术方案如下：
1.位于羽衣甘蓝红叶基因基因Re两侧，并与其紧密连锁的SSR标记C9Z90与 C9Z94，其特征在于，这两个SSR标记分别具有如下核苷酸序列：
(1) C9Z90
5’-TAAATCATGTGTTTTAATCTATAAACTGAATAAAAACTTTTAAAATCTCATCTAATTTA AGTCTAATAGAATTGATTTCAAGTTATACAACCAATAACACCTCCTAAAGTGTGAGCTGGCTGAGTTTGATAGATTTCTTAATTTCTCTTATATATATATATATATATATATCTAATAACTTTTTGGAATATTACGCATAATAAAATAACGAAAGAAACTAAAT-3’
(2) C9Z94
5’-GCAATAAGAAGAGAAGCCCCAAAATAAGCATGGTTGGCACTTATCATAAGAATACA AATTCTATTCATGACCCATCGCTATATATCATCACATGTCGCCTCTCTTTTTTCACGGCTAATTTATATTGGGTTTACTATAAGTATGTATATATATATATATATATATATATATATACAACCATGGTCTGAAAGTTTAATATATACTAAATTTTTTGATCCATGCACCAGTGCGGATGTTATTAATT-3’
2.上述SSR标记C9Z90与C9Z94的特异性扩增引物分别具有如下序列：
(1) C9Z90
C9Z90-L: 5’-TAAATCATGTGTTTTAATCTATAAACTGAA-3’
C9Z90-R: 5’- ATTTAGTTTCTTTCGTTATTTTATTATGC-3’
(2)C9Z94
C9Z94-L: 5’-GCAATAAGAAGAGAAGCCCCA-3’
C9Z94-R: 5’-AATTAATAACATCCGCACTGGTG-3’
3.上述SSR标记C9Z90与C9Z94在辅助选择中的应用方法为：
(1)用CTAB法对待测材料进行基因组DNA的提取；
(2)PCR扩增
a.反应体系：10uL体系，各组分物质的含量分别为20ng 两种羽衣甘蓝DH系的 DNA；0.8 μL 2.5 mM dNTP, 1.0 μL 10× Taq PCR buffer 含 Mg2+, 0.8 μL 0.4 μM primers 和 0.25 U Taq polymerase. ddH2O补齐 10uL，混匀，离心；
b.扩增程序：预变性95℃/2min，95℃/30s、58℃/30s、72℃/60s，35个循环后，72℃ 延伸3min；
c.电泳：①C9Z90：将10uL扩增产物与5uL的变性Buffer(980ml/L去离子甲酰胺, 3.72g/L乙二胺四乙酸, 2.5g/L溴酚蓝, 2.5g/L二甲苯腈)混匀，95℃变性5min，取5 uL点入5％变性聚丙烯酰胺凝胶（420.42g/L尿素, 47.5g/L丙烯酰胺, 2.5g/L甲叉丙烯酰胺, 10×TBE 100 ml）电泳中，在2000V，75W条件下电泳1h20min，经银染后观察拍照。②C9Z94：将10uL扩增产物与5uL的变性Buffer(980ml/L去离子甲酰胺, 3.72g/L乙二胺四乙酸, 2.5g/L溴酚蓝, 2.5g/L二甲苯腈)混匀，95℃变性5min，取5 uL点入5％变性聚丙烯酰胺凝胶（420.42g/L尿素, 47.5g/L丙烯酰胺, 2.5g/L甲叉丙烯酰胺, 10×TBE 100 ml）电泳中，在2000V，75W条件下电泳1h20min，经银染后观察拍照。
其中银染步骤分为：首先放入1L蒸馏水+100ml无水乙醇+5ml冰醋酸中固定7min，然后放入1L蒸馏水+2g硝酸银+2ml甲醛中染色10min，用1L蒸馏水漂洗3-4秒，最后转入1L蒸馏水+16g氢氧化钠+2ml甲醛中显影10min。
本发明的有益效果：
上述SSR标记C9Z90与C9Z94距离羽衣甘蓝红叶基因Re的遗传距离分别为0.3cM和2.0cM，可广泛应用于羽衣甘蓝红叶基因Re的分子标记辅助选择育种。本发明通过特异引物PCR扩增可对待测植株进行苗期鉴定，提高育种效率。
附图说明
图1：C9Z90在亲本及部分F2代个体上的扩增结果。
图2：C9Z94在亲本及部分F2代个体上的扩增结果。
图1、2中符号分别表示为：
P1：红叶亲本；
P2：白叶亲本；
*：F2代群体中在羽衣甘蓝红叶基因位点和SSR标记间发生交换的单株；
M：D2000 DNA ladder。
具体实施方式
实施例1：与羽衣甘蓝红叶基因Re连锁的简单重复序列(SSR)标记的获得
一、分离群体的构建
母本欧系列红羽衣甘蓝与名古屋系列白羽衣甘蓝均购自我国的郑州金世纪园艺资材有限公司，以欧系列红羽衣甘蓝经游离小孢子培养获得的红叶羽衣甘蓝DH系作为母本与名古屋系列白羽衣甘蓝经游离小孢子培养获得的白叶羽衣甘蓝DH系作为父本杂交，所获F1代植株全部表现为红叶。之后F1自交，构建F2代分离群体。在播种的全部4,284株F2代个体中，3,234株为红叶，1,050株表现为白叶。叶色基因分离比符合孟德尔遗传定律3∶1。
其中，两亲本的获得是通过游离小孢子培养的方法，从F1商品种欧系列红和名古屋系列白中获得的。游离小孢子培养的方法及步骤可参见发表于2015年12月植物生理学通讯上的第41卷第六期725-727页的《羽衣甘蓝的小孢子胚诱导和植株再生》。
二、DNA的提取
a.将0.2 g羽衣甘蓝红叶和白叶材料的幼嫩叶片加入已灭菌的1.5 ml离心管中，液氮速冻同时，研磨棒研磨至粉末；
b.加入700 ul CTAB裂解液(30g/L CTAB，100mmol/L Tris-HCl， 20mmol/L EDTA，1.4mol/LNaCl，)以及14uL β-巯基乙醇，摇匀，放入65 ℃水浴锅中一小时，每隔20分钟反转摇匀一次；
c.冷却10分钟后再加入与CTAB等体积的700 ul体积比为24:1的氯仿：异戊醇，充分颠倒3分钟，300下；
d.常温离心（21-24 ℃），12000 rpm，5分钟；
e.事先先把无水乙醇放到-20℃冰箱里；
f.移上清液400ul入1.5ml已灭菌的离心管，加入2倍体积800ul预先在-20℃冰箱里存放的无水乙醇，-20℃静置0.5-1小时或-80℃静置8-10分钟；
g.常温离心，12000rpm，10分钟；
h.弃上清液，在滤纸上吸一下，加入1 ml 70%乙醇（700ul 无水乙醇+300ul超纯水）；
i.常温离心，12000rpm，1分钟；
j.弃上清，置于50℃培养箱10-20分钟或室温放置至完全晾干；
k.加入50ul，1倍TE溶解或用100ul灭菌超纯水溶解；
三、DNA浓度的检测
a.琼脂糖0.2 g，TAE（硼酸缓冲液）2 ml，蒸馏水20 ml，于三角瓶中混匀。b.用封口膜封口，加热20秒，充分溶解。
c.在溶解后的混合液中加入2 ul 1mg/ml的EB。
d.将混合液放入胶盒中，置于室温凝结。
e.取2-3 ul Loading Buffer 指示剂，与5 ul DNA样混合，将混合液点入做好的胶孔中。
f.110V电压电泳20分钟，带的走向是负极向正极。
g.将 DNA 原液在生物光度计（Eppendorf  Biophotometer，Germany）上测定浓度及OD260/OD280，OD260/OD280 不足 1.8 或超过 2.0 的进行重新纯化，将纯化后的 DNA稀释到 30 ng/μL 备用。
四、SSR体系
a.反应体系：10uL体系，各组分物质的含量分别为20ng两种羽衣甘蓝DH系的DNA；0.8 μL 2.5 mM dNTP, 1.0 μL 10× Taq PCR buffer 含 Mg2+, 0.8 μL 0.4 μM primers 和 0.25 U Taq polymerase. ddH2O补齐 10uL，混匀，离心；
b.扩增程序：预变性95℃/2min，95℃/30s、58℃/30s、72℃/60s，35个循环后，72℃ 延伸3min；
c.电泳：①C9Z90：将10uL扩增产物与5uL的变性Buffer(980ml/L去离子甲酰胺, 3.72g/L乙二胺四乙酸, 2.5g/L溴酚蓝, 2.5g/L二甲苯腈)混匀，95℃变性5min，取5 uL点入5％变性聚丙烯酰胺凝胶（420.42g/L尿素, 47.5g/L丙烯酰胺, 2.5g/L甲叉丙烯酰胺, 10×TBE 100 ml）电泳中，在2000V，75W条件下电泳1h20min，经银染后观察拍照。②C9Z94：将10uL扩增产物与5uL的变性Buffer(980ml/L去离子甲酰胺, 3.72g/L乙二胺四乙酸, 2.5g/L溴酚蓝, 2.5g/L二甲苯腈)混匀，95℃变性5min，取5 uL点入5％变性聚丙烯酰胺凝胶（420.42g/L尿素, 47.5g/L丙烯酰胺, 2.5g/L甲叉丙烯酰胺, 10×TBE 100 ml）电泳中，在2000V，75W条件下电泳1h20min，经银染后观察拍照。
其中银染步骤分为：首先放入1L蒸馏水+100ml无水乙醇+5ml冰醋酸中固定7min，然后放入1L蒸馏水+2g硝酸银+2ml甲醛中染色10min，用1L蒸馏水漂洗3-4秒，最后转入1L蒸馏水+16g氢氧化钠+2ml甲醛中显影10min。
五、多态性SSR引物组合的筛选
1.对98对SSR引物组合进行多态性筛选。在双亲间可扩增出多态性条带的组合占总数的15％。在F2个体验证中，C9Z90与C9Z94表现出与目标基因具有稳定的连锁关系:
(1)C9Z90
5’-TAAATCATGTGTTTTAATCTATAAACTGAATAAAAACTTTTAAAATCTCATCTAATTTA AGTCTAATAGAATTGATTTCAAGTTATACAACCAATAACACCTCCTAAAGTGTGAGCTGGCTGAGTTTGATAGATTTCTTAATTTCTCTTATATATATATATATATATATATCTAATAACTTTTTGGAATATTACGCATAATAAAATAACGAAAGAAACTAAAT-3’
(2)C9Z94
5’-GCAATAAGAAGAGAAGCCCCAAAATAAGCATGGTTGGCACTTATCATAAGAATACA AATTCTATTCATGACCCATCGCTATATATCATCACATGTCGCCTCTCTTTTTTCACGGCTAATTTATATTGGGTTTACTATAAGTATGTATATATATATATATATATATATATATATACAACCATGGTCTGAAAGTTTAATATATACTAAATTTTTTGATCCATGCACCAGTGCGGATGTTATTAATT-3’
2.上述SSR标记C9Z90与C9Z94的特异性扩增引物分别具有如下序列：
(1)C9Z90
C9Z90-L: 5’-TAAATCATGTGTTTTAATCTATAAACTGAA-3’
C9Z90-R: 5’- ATTTAGTTTCTTTCGTTATTTTATTATGC-3’
(2)C9Z94
C9Z94-L: 5’-GCAATAAGAAGAGAAGCCCCA-3’
C9Z94-R: 5’-AATTAATAACATCCGCACTGGTG-3’。
SEQUENCE LISTING
 
<110>沈阳农业大学
<120>羽衣甘蓝红叶基因Re的SSR标记及应用
<130>
<160>6
 
<210>1
<211>222
<212>DNA
<213>羽衣甘蓝(Brassica oleracea L. var. acephala)
 
<400>1
      taaatcatgt gttttaatct ataaactgaa taaaaacttt taaaatctca tctaatttaa      1
gtctaataga attgatttca agttatacaa ccaataacac ctcctaaagt gtgagctggc     61
tgagtttgat agatttctta atttctctta tatatatata tatatatatat ctaataact    121
ttttggaata ttacgcataa taaaataacg aaagaaactaa at                       222
 
<210>2
<211>244
<212>DNA
<213>羽衣甘蓝(Brassica oleracea L. var. acephala)
 
<400>2
gcaataagaa gagaagcccc aaaataagca tggttggcac ttatcataag aatacaaatt      1
ctattcatga cccatcgcta tatatcatca catgtcgcct ctcttttttc acggctaatt     61
tatattgggt ttactataag tatgtatata tatatatata tatatatata tatacaacca    121
tggtctgaaa gtttaatata tactaaattt tttgatccat gcaccagtgc ggatgttatt    181
aatt                                                             184
 
<210>3
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
 
<400>3
     taaatcatgtgttttaatctataaactgaa                                        30
 
<210>4
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
 
<400>4
atttagtttctttcgttattttattatgc                                       29          
 
<210>5
<211> 21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
 
<400>5
gcaataagaagagaagcccca                                              21
 
<210>6
<211> 23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
 
<400>6
aattaataacatccgcactggtg                                           23
 
 

Claims (3)

1.位于羽衣甘蓝红叶基因基因Re两侧，并与其紧密连锁的SSR标记C9Z90与 C9Z94，其特征是：这两个SSR标记分别具有如下核苷酸序列：
(1) C9Z90
5’-TAAATCATGTGTTTTAATCTATAAACTGAATAAAAACTTTTAAAATCTCATCTAATTTA AGTCTAATAGAATTGATTTCAAGTTATACAACCAATAACACCTCCTAAAGTGTGAGCTGGCTGAGTTTGATAGATTTCTTAATTTCTCTTATATATATATATATATATATATCTAATAACTTTTTGGAATATTACGCATAATAAAATAACGAAAGAAACTAAAT-3’
(2) C9Z94
5’-GCAATAAGAAGAGAAGCCCCAAAATAAGCATGGTTGGCACTTATCATAAGAATACA AATTCTATTCATGACCCATCGCTATATATCATCACATGTCGCCTCTCTTTTTTCACGGCTAATTTATATTGGGTTTACTATAAGTATGTATATATATATATATATATATATATATATACAACCATGGTCTGAAAGTTTAATATATACTAAATTTTTTGATCCATGCACCAGTGCGGATGTTATTAATT-3’。
2.根据权利要求1所述的位于羽衣甘蓝红叶基因Re两侧，并与其紧密连锁的 SSR标记C9Z90与C9Z94，其特征是：两对PCR特异性扩增引物分别具有如下序列：
(1) C9Z90
C9Z90-L: 5’-TAAATCATGTGTTTTAATCTATAAACTGAA-3’
C9Z90-R: 5’- ATTTAGTTTCTTTCGTTATTTTATTATGC-3’
(2)C9Z94
C9Z94-L: 5’-GCAATAAGAAGAGAAGCCCCA-3’
C9Z94-R: 5’-AATTAATAACATCCGCACTGGTG-3’。
3.根据权利要求1所述的位于羽衣甘蓝红叶基因Re两侧，并与其紧密连锁的 SSR标记C9Z90与C9Z94，其特征是在辅助选择中的应用方法：
(1) 用CTAB法对待测材料进行基因组DNA的提取
(2) PCR扩增
a. 反应体系：10uL体系，各组分物质的含量分别为20ng两种羽衣甘蓝DH系的DNA；0.8 μL 2.5 mM dNTP, 1.0 μL 10× Taq PCR buffer 含 Mg2+, 0.8 μL 0.4 μM primers 和 0.25 U Taq polymerase. ddH2O补齐 10uL，混匀，离心；
b. 扩增程序：预变性95℃/2min，95℃/30s、58℃/30s、72℃/60s，35个循环后，72℃ 延伸3min；
c. 电泳：① C9Z90：将10uL扩增产物与5uL的变性Buffer(980ml/L去离子甲酰胺， 3.72g/L乙二胺四乙酸， 2.5g/L溴酚蓝， 2.5g/L二甲苯腈)混匀，95℃变性5min，取5 uL点入5％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中，在2000V，75W条件下电泳1h20min，经银染后观察拍照；② C9Z94：将10uL扩增产物与5uL的变性Buffer(980ml/L去离子甲酰胺， 3.72g/L乙二胺四乙酸， 2.5g/L溴酚蓝， 2.5g/L二甲苯腈)混匀，95℃变性5min，取5 uL点入5％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中，在2000V，75W条件下电泳1h20min，经银染后观察拍照；
其中银染步骤分为：首先放入1L蒸馏水+100ml无水乙醇+5ml冰醋酸中固定7min，然后放入1L蒸馏水+2g硝酸银+2ml甲醛中染色10min，用1L蒸馏水漂洗3-4秒，最后转入1L蒸馏水+16g氢氧化钠+2ml甲醛中显影10min。
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