CN112746124B - 一种用于花椰菜杂交种子纯度鉴定的ssr引物及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于花椰菜杂交种子纯度鉴定的SSR引物及方法，本发明中的两对SSR引物均能产生父本特异性标记和母本特异性标记，特异性强；本发明的方法可将“津品56”花椰菜杂交种子与其它杂种以及父母本区分开来，快速检测出杂交种子的纯度；本发明的检测方法具有快速、准确、低成本、操作方便等优势，能够代替传统杂交种子纯度鉴定的方法，具有较高的商业应用价值。

Description

一种用于花椰菜杂交种子纯度鉴定的SSR引物及方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种鉴定花椰菜杂交种子纯度的SSR引物及其应用。

背景技术

花椰菜(Brassica oleracea var.botrytis)是十字花科芸薹属甘蓝种中以花球为产品的一个变种，其营养丰富、味道鲜美，并且含有多种吲哚衍生物，具有一定的抗癌作用，在世界上被广泛栽培和食用。据联合国粮食与农业组织(FAO)统计，2018年，我国种植面积、年总产量分别为54.7万公顷、1073.7万吨，是世界上花椰菜种植面积最大、总产量最高的国家。我国花椰菜育种以传统方式为主，侧重杂种优势利用，而杂种优势的充分表现与种子遗传纯度有着密切的联系。因此，种子纯度是衡量花椰菜杂交种子质量的重要指标，建立准确、高效、快速的花椰菜种子纯度鉴定体系有利于花椰菜种子高效准确的质量控制，具有重要的商业价值和现实意义。

SSR(Simple sequence repeat)分子标记技术具有数量丰富，覆盖整个基因组，揭示的多态性高，以孟德尔方式遗传、呈共显性且扩增结果稳定、成本低、方法简单等特点，被广泛应用于作物遗传图谱、指纹图谱构建及种子纯度鉴定等研究中。现有技术中，已有利用SSR引物鉴定花椰菜种子纯度的报道，但全部是基于甘蓝等其它花椰菜近缘物种的基因组设计SSR引物，效率低且结果稳定性较差。至今，未见基于花椰菜基因组设计的SSR引物应用于花椰菜杂交种子纯度鉴定的报道。

另外，相比传统的聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，近年来发展成熟的毛细管电泳检测技术，是一种准确、快速、高效的SSR分子标记检测技术，它可以分离和识别最小1bp差异的DNA片段，为SSR分子标记的基因分型提供了有效的检测手段。

传统的种子纯度鉴定方法是以播种后植株的田间形态观察为依据，其周期长、工作量大，且易受环境、季节因素影响，导致结果存在偏差。因此，开发快速、准确的种子纯度鉴定方法已成为种子科研单位和企业共同关注的课题。随着分子生物学的迅速发展，使从DNA分子水平上对品种纯度进行基因鉴定和分析成为可能。采用分子标记技术进行种子纯度鉴定是一种快速、便捷、准确、有效的方法。目前利用SSR分子标记技术鉴定花椰菜杂交种子纯度的技术还未见报道。

“津品56”由天津市农业科学院蔬菜研究所育成，为秋陆地早熟花椰菜雄性不育新品种，成熟期55天左右。株型直立紧凑，内叶叠抱护球性好，适合密植。商品性状良好，生长势强，抗病性较好；单球质量约0.84kg，每亩产量2770kg，是理想的秋陆地栽培品种，已在全国范围内连续推广7年，市场反应良好，累计种植面积达2000hm²以上。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种用于花椰菜杂交种子纯度鉴定的SSR引物，所述引物能产生父本特异性标记和母本特异性标记，特异性强。

本发明的目的之二还在于提供一种花椰菜杂交种子纯度的鉴定方法，该方法利用上述SSR引物，能快速、便捷、准确、有效的鉴定花椰菜杂交种子纯度。

为实现以上目的，采用以下技术方案：

一种用于花椰菜杂交种子纯度鉴定的SSR引物组，包括2对SSR引物，分别为BoSSR01和/或BoSSR02；所述2对SSR引物序列如表1：

表1用于花椰菜杂交种子纯度鉴定的SSR引物组

其中，所述花椰菜的品种为“津品56”。

一种花椰菜杂交种子纯度鉴定的方法，包含以下步骤：

(1)提取花椰菜父母本和杂交种子的DNA；

(2)以花椰菜基因组DNA为模板，使用表1所述的2对SSR引物分别进行PCR扩增反应；

(3)对扩增产物进行毛细管凝胶电泳检测；

(4)对电泳检测结果数据进行分析，同时具有父母本共显性特征条带的杂交种子鉴定为真正的杂交种，缺少父本或母本任意一个特征带的均记为假杂种，并计算种子纯度。其中，种子纯度的计算方法为：种子纯度＝检测到的真正杂交种个数/种子检测总数×100％。

所述步骤(1)中提取花椰菜父母本和杂交种子的DNA的方法为CTAB法。

其中，所述步骤(2)中PCR扩增反应具体使用的是10μL反应体系：10×buffer1.0μL，25mM MgCL₂1.0μL，2mMdNTPs1.0μL，10μM正向引物与反向引物各1.0μL，0.5单位的TaqDNA聚合酶0.2μL，模板50ng，加ddH₂O至10μL；扩增程序为：95℃3min，95℃15s、58℃15s、72℃30s循环35次，72℃7min。

其中，所述步骤(2)中PCR扩增反应使用的96孔PCR板在扩增前只在1～95孔中加入扩增反应体系，最后H12孔不加任何试剂。具体地，1～95孔中加入的扩增反应体系为10μLPCR产物与1×15μL TE缓冲液的混合液；最后H12孔加入25μL DNA Ladder。

具体地，步骤(3)中毛细管电泳检测步骤如下：

(1)准备仪器：调整Agilent 5300Fragment Analyzer System：安装毛细管，其他参数按照系统默认值；试剂根据产品说明配制，加载Gel和Condition，更换Inlet Buffer、Marker，然后排空废液抽取组件和废液瓶。

(2)上样：稀释后的PCR产物放置于机身对应的“1～3”位置。

(3)样品分析：从下拉菜单中选择方法，并输入待测样品及SSR引物信息，运行电泳程序；

(4)数据分析：使用Prosize3.0数据分析软件处理目的片段分离数据。

步骤(3)电泳检测的进样电压2.0kV，时间30s；分离电压5.0kV，时间68min。

利用本发明的引物组，其中，引物BoSSR01可扩增到172bp的母本共显性特征条带以及145bp的父本共显性特征条带；引物BoSSR02可扩增到145bp的母本共显性特征条带以及126bp的父本共显性特征条带。

本发明的优点：

该申请是依托2019年成功破译花椰菜基因组数据，利用生物信息学手段，全基因组范围内鉴定得到19126个SSR分子标记，随机挑选出均匀分布在染色体上的64个SSR分子标记并设计引物，以“津品56”及其父母本为材料，最终筛选出适用于花椰菜品种“津品56”中2对可扩增出共显性条带的SSR引物组，并与毛细管电泳技术相结合，能够有效的鉴定出“津品56”花椰菜杂交种子纯度。

本发明中的两对SSR引物均能产生父本特异性标记和母本特异性标记，特异性强；本发明的方法可将“津品56”花椰菜杂交种子与其它杂种以及父母本区分开来，快速检测出杂交种子的纯度；本发明的检测方法具有快速、准确、低成本、操作方便等优势，能够代替传统杂交种子纯度鉴定的方法，具有较高的商业应用价值。

附图说明

图1为以BoSSR01为引物，杂交种子津品56杂交种子毛细管电泳检测结果；图中，泳道1为母本，泳道2为父本，泳道3～52为待检测F1代杂交种，泳道M为35-500bp ladder；

图2为以BoSSR02为引物，杂交种子津品56杂交种子毛细管电泳检测结果；图中，泳道1为父本，泳道2为母本，泳道3～52为待检测F1代杂交种，泳道M为35-500bp ladder；

具体实施方式

下面将通过具体实施例对本发明进行详细的描述。提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。

如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。

实施例1杂交种花椰菜种子纯度检测方法的建立

该申请是依托2019年成功破译花椰菜基因组数据，利用生物信息学手段，全基因组范围内鉴定得到19126个SSR分子标记，随机挑选出均匀分布在染色体上的64个SSR分子标记并设计引物，，以“津品56”及其父母本为材料，最终筛选出适用于花椰菜品种“津品56”中2对可扩增出共显性条带的SSR引物组(BoSSR01和BoSSR02)，并与毛细管电泳技术相结合，能够有效的鉴定出“津品56”花椰菜杂交种子纯度。得到的标记带型清晰、重复性好，BoSSR01的正、反向引物序列如下所示：

BoSSR01-F：5’-AGGGAGGCGAAGGAGTGTAT-3’(SEQ ID NO.1所示)

BoSSR01-R：5’-ACCAGACCAAGAGAAAAGTCGA-3’(SEQ ID NO.2所示)；

BoSSR02的正、反向引物序列如下所示：

BoSSR02-F：5’-ATACGAGCGTGCTTGGGAAA-3’(SEQ ID NO.3所示)

BoSSR02-R：5’-GTGGGATGTGGAGGATGACG-3’(SEQ ID NO.4所示)；

以“津品56”花椰菜基因组DNA为模板，分别使用上述SSR组BoSSR01和BoSSR02进行PCR扩增，对扩增产物进行毛细管电泳，电泳结果显示，引物BoSSR01可扩增到172bp的母本共显性特征条带以及145bp的父本共显性特征条带；引物BoSSR02可扩增到145 bp的母本共显性特征条带以及126bp的父本共显性特征条带。

实施例2以SSR分子标记引物BoSSR01检测杂交种“津品56”的种子纯度

在培育花椰菜新品种“津品56”的过程中，使用本发明的SSR分子标记引物BoSSR01检测杂种的种子纯度：

(1)使用CTAB法提取花椰菜父母本和杂交种子“津品56”的DNA；

(2)以步骤(1)提取的DNA为模板，以SSR分子标记引物BoSSR01进行PCR扩增反应。PCR扩增反应体系为10μL：10buffer1.0μL，25mM MgCL21.0μL，2mM dNTPs1.0μL，10μM正向引物与反向引物各1.0μL，0.5单位的Taq DNA聚合酶0.2μL，模板50ng，加ddH2O至10μL；扩增程序为：95℃3min，(95℃15s,58℃15s,72℃30s)循环35次，72℃7min。

(3)毛细管凝胶电泳检测，方法如下：

①准备仪器：调整Agilent5300Fragment Analyzer System：安装毛细管，其他参数按照系统默认值；试剂根据产品说明配制，加载Gel和Condition，更换Inlet Buffer、Marker，然后排空废液抽取组件和废液瓶。

②上样：PCR96孔板1～95孔中为10μL PCR产物与115μL TE缓冲液的混合液；最后H12孔为25μL DNA Ladder，稀释后的PCR产物放置于机身对应的“1”位置。

③样品分析：从下拉菜单中选择方法，Run Entire Tray-Add toqueue-DNF-900-330-DNA 35-500bp mthds并输入待测样品及SSR引物信息，运行电泳程序Tray1；无限制机器人手臂将执行毛细管管路冲洗，充胶，Buffer、markers、扩增样品、DNA ladder等溶液吸入，电泳开始运行时，配以每个样品的实时动态RFU峰值图。

④数据分析：使用Prosize3.0数据分析软件处理目的片段分离数据。打开ProSize3.0软件，在File中选定待分析的文件，根据H12DNA Ladder峰值出现时间调整1～95孔的RFU峰值图，在参数设置中选择Flag模块，按照说明在Tag、Value、Range中输入引物名称、共显性条带频段大小值以及允许波动范围：2bp，保存读取结果(1，0)列表，并导出。

(4)电泳检测结果数据分析，BoSSR01在津品56杂交种子种检测到2条共显性条带(一条来自母本172bp，一条来自父本145bp)的鉴定为真正的杂交种，缺少任意一个特征带的均记为假杂种，并按照如下方法计算种子纯度：

种子纯度＝检测到的真正杂交种个数/种子检测总数×100％。

(5)结果分析

图1为杂交种子津品56毛细管电泳检测结果，由图1可以看出，50号样品为假杂种，缺乏父母本共显性标记条带，杂交种子纯度为98％，与田间鉴定结果一致。实施例3以SSR分子标记引物BoSSR02检测杂交种“津品56”的种子纯度

在培育花椰菜新品种“津品56”的过程中，使用本发明的SSR分子标记引物BoSSR02检测杂种的种子纯度：

(1)使用CTAB法提取花椰菜父母本和杂交种子“津品56”的DNA；

(2)以步骤(1)提取的DNA为模板，以SSR分子标记引物BoSSR02进行PCR扩增反应。PCR扩增反应体系为10μL：10×buffer1.0μL，25mM MgCL₂1.0μL，2mMdNTPs1.0μL，10μM正向引物与反向引物各1.0μL，0.5单位的Taq DNA聚合酶0.2μL，模板50ng，加ddH₂O至10μL；扩增程序为：95℃3min，(95℃15s,58℃15s,72℃30s)循环35次，72℃7min。

(3)毛细管凝胶电泳检测，方法如下：

①准备仪器：调整Agilent5300Fragment Analyzer System：安装毛细管，其他参数按照系统默认值；试剂根据产品说明配制，加载Gel和Condition，更换Inlet Buffer、Marker，然后排空废液抽取组件和废液瓶。

②上样：PCR96孔板1～95孔中为10μL PCR产物与1×15μL TE缓冲液的混合液；最后H12孔为25μL DNA Ladder，稀释后的PCR产物放置于机身对应的“2”位置。

③样品分析：从下拉菜单中选择方法，Run Entire Tray-Add toqueue-DNF-900-330-DNA 35-500bp mthds并输入待测样品及SSR引物信息，运行电泳程序Tray1；无限制机器人手臂将执行毛细管管路冲洗，充胶，Buffer、markers、扩增样品、DNA ladder等溶液吸入，电泳开始运行时，配以每个样品的实时动态RFU峰值图。

④数据分析：使用Prosize3.0数据分析软件处理目的片段分离数据。打开ProSize3.0软件，在File中选定待分析的文件，根据H12DNA Ladder峰值出现时间调整1～95孔的RFU峰值图，在参数设置中选择Flag模块，按照说明在Tag、Value、Range中输入引物名称、共显性条带频段大小值以及允许波动范围：2bp，保存读取结果(1，0)列表，并导出。

(4)电泳检测结果数据分析，BoSSR02在津品56杂交种子种检测到2条共显性条带(一条来自母本145bp，一条来自父本126bp)的鉴定为真正的杂交种，缺少任意一个特征带的均记为假杂种，并按照如下方法计算种子纯度：

种子纯度＝检测到的真正杂交种个数/种子检测总数×100％。

(5)结果分析

图2为杂交种子“津品56”毛细管电泳检测结果，由图中可以看出，13号样品为假杂种，缺乏父母本共显性标记条带，杂交种子纯度为98％，与田间鉴定结果一致。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 天津市农业科学院

<120> 一种用于花椰菜杂交种子纯度鉴定的SSR引物及方法

<130> 2020

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Brassica oleracea L. var. botrytis

<400> 1

agggaggcga aggagtgtat 20

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> Brassica oleracea L. var. botrytis

<400> 2

accagaccaa gagaaaagtc ga 22

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Brassica oleracea L. var. botrytis

<400> 3

atacgagcgt gcttgggaaa 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Brassica oleracea L. var. botrytis

<400> 4

gtgggatgtg gaggatgacg 20

Claims (9)

1.SSR引物在鉴定“津品56”花椰菜杂交种子纯度中的应用，其特征在于：所述SSR引物分别为BoSSR01和/或BoSSR02；所述SSR引物序列如下：

。

2.一种“津品56”花椰菜杂交种子纯度鉴定的方法，其特征在于：包含以下步骤：

(1)提取花椰菜父母本和杂交种子的DNA；

(2)以花椰菜基因组DNA为模板，使用权利要求1中所述的SSR引物进行PCR扩增反应；

(3)对扩增产物进行毛细管凝胶电泳检测；

(4)对电泳检测结果数据进行分析，同时具有父母本共显性特征条带的杂交种子鉴定为真正的杂交种，缺少父本或母本任意一个特征带的均记为假杂种，并计算种子纯度。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中提取花椰菜父母本和杂交种子的DNA的方法为CTAB法。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中PCR扩增反应具体使用的是10μL反应体系：10×buffer 1.0μL，25mM MgCL₂1.0μL，2mM dNTPs 1.0μL，10μM正向引物与反向引物各1.0μL，0.5单位的Taq DNA聚合酶0.2μL，模板50ng，加ddH₂O至10μL；扩增程序为：95℃3min，95℃15s、58℃15s、72℃30s循环35次，72℃7min。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中PCR扩增反应使用的96孔PCR板在扩增前只在1～95孔中加入扩增反应体系，最后H12孔不加任何试剂。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：1～95孔中加入的扩增反应体系为10μLPCR产物与1×15μL TE缓冲液的混合液；PCR反应结束后H12孔加入25μL DNALadder。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述电泳检测的进样电压2.0kV，时间30s；分离电压5.0kV，时间68min。

8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：种子纯度的计算方法为：种子纯度＝检测到的真正杂交种个数/种子检测总数×100％。

9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：引物BoSSR01可扩增出172bp的母本共显性特征条带以及145bp的父本共显性特征条带；引物BoSSR02可扩增出145bp的母本共显性特征条带以及126bp的父本共显性特征条带。

Images