CN105368935A - 用于辣椒品种汇丰2号种子纯度鉴定的ssr引物组及方法 - Google Patents

用于辣椒品种汇丰2号种子纯度鉴定的ssr引物组及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于辣椒品种汇丰2号种子纯度鉴定的SSR引物组及方法。包括SSR分子标记L0143和L0622，以及它们对应的引物对。利用上述任一引物对，可将‘汇丰2号’辣椒杂交种与其母本、父本区分开来，快速检测出杂交种子的纯度。此外，该引物组还可用于辣椒品种‘粤红1号’、‘汇丰1号’、和‘汇丰5号’种子真伪性鉴定。本方法具有快速、准确、低成本和操作简单等优点，能够替代传统杂交种子纯度鉴定的方法，具有较高的商业应用价值。

Description

用于辣椒品种汇丰2号种子纯度鉴定的SSR引物组及方法
技术领域
本发明涉及分子标记技术，具体涉及利用SSR分子标记检测辣椒品种‘汇丰2号’种子纯度的引物组及方法。
背景技术
‘汇丰2号’是一个杂交一代辣椒品种，中早熟，具有耐贮运，品质佳等特性，同时抗疫病并且耐热、耐寒、耐涝和耐旱能力强，深受消费者和户喜爱（王恒明,李颖,郭汉权,等.早中熟优质辣椒新品种‘汇丰2号’[J].园艺学报,2010,02期:337-338.）。由于辣椒是一种常见的异花授粉作物，以自交为主，同时存在一定的天然杂交（<50%）。因此在F1制种时即使是其他方法制种（如雄性不育的利用），也需要人工辅助授粉。在F1代杂交种制种过程中由于生物学混杂和人工操作混杂等原因造成杂交种纯度降低的现象时有发生，给种子生产者、经营者和农户造成巨大经济损失。因此，在制种后和销售前对辣椒F1代杂种子进行纯度鉴定是必不可少的。
目前辣椒种子纯度鉴定通常采用田间小区种植，以形态观察的办法，但由于辣椒生育期长，形态学鉴定通常需要60-120天，周期长，受环境影响大，准确性较低且耗费人力、财力，所以其应用受到限制。随着分子生物技术的迅猛发展，使从DNA水平准确、可靠地对种子纯度进行鉴定成为现实。简单序列重复（SimpleSequenceRepeat，SSR）是一类广泛分布于基因组上的DNA序列，根据其在不同材料间产生不同的重复次数从而产生多态SSR标记。SSR标记是一种共显性标记，具有多态性好、重复性高、操作简便等优点，被认为是一种发展前景看好的DNA指纹技术，目前已广泛运用于水稻、玉米等作物种子纯度鉴定，随着其它小作物基因组学的迅速发展，利用SSR分子标记检测种子纯度的方法也在黄瓜、甘蓝等蔬菜作物中得以应用。
发明内容
本发明的目的在于提供用于鉴定辣椒品种‘汇丰2号’种子纯度的SSR分子标记、SSR引物组及方法。
本发明所采取的技术方案是：
一种用于鉴定辣椒品种‘汇丰2号’种子纯度的SSR分子标记L0143，其定位于辣椒第1号染色体上，包括母本L0143-1和父本L0143-2，其大小分别为141bp和149bp。
优选的，所述SSR分子标记L0143，其母本L0143-1的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，父本L0143-2的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。
用于PCR扩增上述SSR分子标记L0143的引物对。
优选的，用于PCR扩增SSR分子标记L0143的引物对，其序列如下所示：
L0143F：ATGGAGCACCATACTCAAACAACC（SEQIDNO.3）；
L0143R：GTTTACATCTCCCGACTGAAACTCCG（SEQIDNO.4）。
一种用于鉴定辣椒品种‘汇丰2号’种子纯度的SSR分子标记L0622，其定位于辣椒第6号染色体上，包括母本L0622-1和父本L0622-2，其大小分别为196bp和208bp。
优选的，所述SSR分子标记L0622，其母本L0622-1的核苷酸序列如SEQIDNO：5所示，父本L0622-2的核苷酸序列如SEQIDNO：6所示。
用于PCR扩增上述SSR分子标记L0622的引物对。
优选的，用于PCR扩增SSR分子标记L0622的引物对，其序列如下所示：
L0622F：GCTCATCAACCCACCTTCATCA（SEQIDNO.7）；
L0622R：ATGCGTTGTCCGAGTAGGGAAG（SEQIDNO.8）。
一种利用SSR引物组鉴定辣椒品种‘汇丰2号’种子纯度的方法，包括如下步骤：
（1）以待检测辣椒幼苗基因组DNA为模板，使用上述L0143和/或L0622的SSR引物对进行PCR扩增；
（2）对PCR产物进行凝胶电泳检测；如果产物中同时含有SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示的条带，或者同时含有SEQIDNO：5和SEQIDNO：6所示的条带，则该辣椒样品为‘汇丰2号’真杂种。
本发明的有益效果是：
本发明的SSR标记、引物组以及方法可将‘汇丰2号’杂交种与其母本、父本区分开来，快速检测出杂交种子的纯度。本方法具有快速、准确、低成本和操作简单等优点，能够替代传统杂交种子纯度鉴定的方法，具有较高的商业应用价值。
本发明引物组还可以用于辣椒品种‘粤红1号’、‘汇丰1号’、和‘汇丰5号’种子真伪性的鉴定。
附图说明
图1为L0143引物对鉴定辣椒品种‘汇丰2号’种子纯度的部分PCR产物电泳图，其中P1、P2分别为母本和父本泳道，其特征带型分别长141bp和149bp；编号1-20为‘汇丰2号’杂交种泳道，除编号17的单株为父本特征带型外，其它都同时具有母本和父本特征条带；
图2为L0622引物对鉴定辣椒品种‘汇丰2号’种子纯度的部分PCR产物电泳图，其中P1、P2分别为母本和父本泳道，其特征带型分别长196bp和208bp；编号1-20为‘汇丰2号’杂交种泳道，除编号17的单株为父本特征带型外，其它都同时具有母本和父本特征条带；
图3为L0143和L0622的引物对同时扩增‘粤红1号’、‘汇丰1号’、‘汇丰2号’和‘汇丰5号’4个辣椒品种的电泳图，其中第1、2泳道分别为L0143和L0622的引物对扩增‘粤红1号’的带型；第3、4泳道分别为L0143和L0622的引物对扩增‘汇丰1号’的带型；第5、6泳道分别为L0143和L0622的引物对扩增‘汇丰2号’的带型；第7、8泳道分别为L0143和L0622的引物对扩增‘汇丰5号’的带型，每个品种都有其特异的带型组合，能与其它3个品种区分。
具体实施方式
一种用于鉴定辣椒品种‘汇丰2号’种子纯度的SSR分子标记L0143，其定位于辣椒第1号染色体上，包括母本L0143-1和父本L0143-2，其大小分别为141bp和149bp。
优选的，所述SSR分子标记L0143，其母本L0143-1的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，父本L0143-2的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。
用于PCR扩增上述SSR分子标记L0143的引物对。
优选的，用于PCR扩增SSR分子标记L0143的引物对，其序列如下所示：
L0143F：ATGGAGCACCATACTCAAACAACC（SEQIDNO.3）；
L0143R：GTTTACATCTCCCGACTGAAACTCCG（SEQIDNO.4）。
一种用于鉴定辣椒品种‘汇丰2号’种子纯度的SSR分子标记L0622，其定位于辣椒第6号染色体上，包括母本L0622-1和父本L0622-2，其大小分别为196bp和208bp。
优选的，所述SSR分子标记L0622，其母本L0622-1的核苷酸序列如SEQIDNO：5所示，父本L0622-2的核苷酸序列如SEQIDNO：6所示。
用于PCR扩增上述SSR分子标记L0622的引物对。
优选的，用于PCR扩增SSR分子标记L0622的引物对，其序列如下所示：
L0622F：GCTCATCAACCCACCTTCATCA（SEQIDNO.7）；
L0622R：ATGCGTTGTCCGAGTAGGGAAG（SEQIDNO.8）。
一种利用SSR引物组鉴定辣椒品种‘汇丰2号’种子纯度的方法，包括如下步骤：
（1）以待检测辣椒幼苗基因组DNA为模板，使用上述L0143和/或L0622的SSR引物对进行PCR扩增；
（2）对PCR产物进行凝胶电泳检测；如果产物中同时含有SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示的条带，或者同时含有SEQIDNO：5和SEQIDNO：6所示的条带，则该辣椒样品为‘汇丰2号’真杂种。
优选的，步骤（1）中提取辣椒幼苗基因组DNA的方法为TPS法，步骤如下：
①将约200mg辣椒幼苗叶片放入2.0ml离心管中，每个管中插一根塑料研磨棒，用长柄镊子夹住在液氮中速冻约30s后快速研磨成粉末，后加入800μlTPS抽提液；
②72℃水浴30min；
③常温下12000rpm离心10min-15min；
④取上清，转入1.5ml离心管中，加入等体积异丙醇，12000rpm离心5min；
⑤弃上清，晾干后加入100μl双蒸水溶解，于4℃冰箱保存待用。
优选的，TPS抽提液配制如下：Tris-HCl（pH8.0）终浓度为0.1M，EDTA（pH8.0）为0.01M，KCl为0.5M。
优选的，步骤（1）中PCR扩增反应体系为：
10×PCRbuffer2μl，
2.5mMdNTPs1.5μl，
10μM正向引物1μl，
10μM反向引物1μl，
模板DNA1μl，
Taq酶1U，
加双蒸水补足至20μl。
优选的，步骤（1）中PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环，72℃保持7min。
优选的，步骤（2）的凝胶电泳为8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。
优选的，步骤（2）中以电泳读带结果计算种子纯度，计算公式如下：待检种子种子纯度（%）=待检种子中兼有母本和父本特征带型种子数/待检种子总数×100。
以下结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
实施例1
2015年4-7月在广州钟落潭实验基地内种植的96株‘汇丰2号’杂交一代进行形态鉴定，同时对每个单株编号并取样，在实验室内以本发明进行纯度鉴定，具体操作如下：
（1）以TPS法提取96株辣椒幼苗基因组DNA：
①将约200mg辣椒幼苗叶片放入2.0ml离心管中，每个管中插一根塑料研磨棒，用长柄镊子夹住在液氮中速冻约30s后快速研磨成粉末，后加入800μlTPS抽提液；
②72℃水浴30min；
③常温下12000rpm离心10min-15min；
④取上清，转入1.5ml离心管中，加入等体积异丙醇，12000rpm离心5min；
⑤弃上清，晾干后加入100μl双蒸水溶解，于4℃冰箱保存待用。
（2）以提取的辣椒基因组DNA为模板，选用L0143或L0622的引物对进行PCR扩增。PCR反应体系为：2μl10×PCRbuffer，1.5μldNTPs（浓度为2.5mM），正、反向引物各1μl（浓度为10μM），1μl模板DNA（浓度为40ng/μl），Taq酶1U，加双蒸水补足至20μl。
反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环，72℃保持7min，后置于4℃冰箱保存待检测。
（3）扩增产物在浓度为8%双垂直非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，120V稳压电泳2小时，电泳结束后进行0.1%AgNO3银染10min；后在NaOH溶液（2%NaOH、0.4%甲醛和0.04%Na2CO3）中显色10min，然后在灯箱上辨识条带（读带）并分析。
（4）电泳结果显示有95个单株同时检测出长141bp和149bp的特征条带（见图1），并且这95个单株也同时检测出长196bp和208bp的特征条带（见图2），表明这95个单株为真杂种，纯度为：95/96*100%≈99.0%，该结果与田间形态调查结果完全吻合，准确率为100%。
实施例2
2015年3月广东科农蔬菜种业有限公司在销售‘汇丰2号’杂交种之前委托本实验室做种子纯度鉴定，随机选用300粒种子于育苗杯中育苗，出苗10天左右后编号并取样，共取样292株，以实例1的方法对292株待检单株进行DNA提取、PCR扩增、电泳检测，结果分析表明共有288个单株同时检测出长141bp和149bp的特征条带，并且这288个单株也同时检测出长196bp和208bp的特征条带，表明这288个单株为真杂种，纯度为：288/292*100%≈98.6%。除去育苗时间，整个鉴定过程由1个人2天时间完成，每个样品的检测成本约0.15元。
实施例3
从广东科农蔬菜种业有限公司购买其另外主推的辣椒品种‘粤红1号’、‘汇丰1号’和‘汇丰5号’的种子，以育苗杯育苗，10天左右单株提取植株DNA，根据实施例1的方法和步骤，利用2对引物组同时扩增‘粤红1号’、‘汇丰1号’、‘汇丰2号’和‘汇丰5号’4个辣椒品种，结果表明2对引物组同时扩增时，每个品种都有其特异的条带组合，能与其它3个品种区分（见图3），因此，2对引物组不但可以鉴定辣椒品种‘汇丰2号’种子纯度，还可以同时鉴别上述4个辣椒品种的真伪性。
以上实施例表明本发明的方法可准确、可靠区分辣椒品种‘汇丰2号’杂交种与其母本和父本，且在一定范围内能用于鉴别辣椒品种真伪性，且实施过程快速、简单，成本低。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
<110>广东省农业科学院蔬菜研究所
<120>用于辣椒品种‘汇丰2号'种子纯度鉴定的SSR引物组及方法
<130>
<160>8
<170>PatentInversion3.5
<210>1
<211>141
<212>DNA
<213>CapsicumannuumL.
<400>1
atggagcaccatactcaaacaacctcaaatttgttggttattttttgtcacagttgatgt60
tcttaatgtgtgtgtgtgatgtattggtgttgctgggttgatgtgttatatgtcgcggag120
tttcagtcgggagatgtaaac141
<210>2
<211>149
<212>DNA
<213>CapsicumannuumL.
<400>2
atggagcaccatactcaaacaacctcaaatttgttggttattttttgtcacagttgatgt60
tcttaatgtgtgtgtgtgtgtgtgtgatgtattggtgttgctgggttgatgtgttatatg120
tcgcggagtttcagtcgggagatgtaaac149
<210>3
<211>24
<212>DNA
<213>人工组合序列
<400>3
atggagcaccatactcaaacaacc24
<210>4
<211>26
<212>DNA
<213>人工组合序列
<400>4
gtttacatctcccgactgaaactccg26
<210>5
<211>196
<212>DNA
<213>CapsicumannuumL.
<400>5
gctcatcaacccaccttcatcaagtctcatgtggcagccacataagaaatagtttataaa60
cttgtatttccatagatctcatctatataaagctccattacgtgacctcttattattatt120
attattattaacgcaattcattaatttgttacatttccttgatctccaagagagcttccc180
tactcggacaacgcat196
<210>6
<211>208
<212>DNA
<213>CapsicumannuumL.
<400>6
gctcatcaacccaccttcatcaagtctcatgtggcagccacataagaaatagtttataaa60
cttgtatttccatagatctcatctatataaagctccattacgtgacctcttattattatt120
attattattattattattattaacgcaattcattaatttgttacatttccttgatctcca180
agagagcttccctactcggacaacgcat208
<210>7
<211>22
<212>DNA
<213>人工组合序列
<400>7
gctcatcaacccaccttcatca22
<210>8
<211>22
<212>DNA
<213>人工组合序列
<400>8
atgcgttgtccgagtagggaag22

Claims (9)

1.一种用于鉴定辣椒品种‘汇丰2号’种子纯度的SSR分子标记L0143，其定位于辣椒第1号染色体上，包括母本L0143-1和父本L0143-2，其大小分别为141bp和149bp。
2.根据权利要求1所述的SSR分子标记L0143，其母本L0143-1的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，父本L0143-2的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。
3.用于PCR扩增权利要求1或2所述的SSR分子标记L0143的引物对。
4.根据权利要求3所述的引物对，其序列如下所示：
L0143F：ATGGAGCACCATACTCAAACAACC（SEQIDNO.3）；
L0143R：GTTTACATCTCCCGACTGAAACTCCG（SEQIDNO.4）。
5.一种用于鉴定辣椒品种‘汇丰2号’种子纯度的SSR分子标记L0622，其定位于辣椒第6号染色体上，包括母本L0622-1和父本L0622-2，其大小分别为196bp和208bp。
6.根据权利要求5所述的SSR分子标记L0622，其母本L0622-1的核苷酸序列如SEQIDNO：5所示，父本L0622-2的核苷酸序列如SEQIDNO：6所示。
7.用于PCR扩增权利要求5或6所述的SSR分子标记L0622的引物对。
8.根据权利要求7所述的引物对，其序列如下所示：
L0622F：GCTCATCAACCCACCTTCATCA（SEQIDNO.7）；
L0622R：ATGCGTTGTCCGAGTAGGGAAG（SEQIDNO.8）。
9.一种利用SSR引物组鉴定辣椒品种‘汇丰2号’种子纯度的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）以待检测辣椒幼苗基因组DNA为模板，使用权利要求4和/或8所述的SSR引物对进行PCR扩增；
（2）对PCR产物进行凝胶电泳检测；如果产物中同时含有SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示的条带，或者同时含有SEQIDNO：5和SEQIDNO：6所示的条带，则该待检样品为‘汇丰2号’真杂种。
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