CN108546774A - 一种用于紫色辣椒杂交品种纯度鉴定的ssr引物及鉴定方法 - Google Patents

一种用于紫色辣椒杂交品种纯度鉴定的ssr引物及鉴定方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于紫色辣椒杂交品种纯度鉴定的SSR引物及鉴定方法。其中SSR引物命名为PZJ01，其正向序列为PZJ01‑F，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；反向序列为PZJ01‑R，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。鉴定方法以紫色辣椒杂交品种的叶片基因组DNA为模板进行扩增，通过对扩增结果的特异谱带对待检测紫色辣椒杂交品种的纯度进行检测。本发明所采用SSR引物和鉴定方法可以在紫色辣椒杂交品种植株生长的任何时期进行鉴定，能够将杂交种与母本自交种、父本自交种区分开来；对DNA质量要求不高且需要量少；成本较低、操作简单；重复性和稳定性较好，快速高效；准确性高，应用推广前景广阔，为开展辣椒制种和良种的及时销售提供科学依据。

Description

一种用于紫色辣椒杂交品种纯度鉴定的SSR引物及鉴定方法
技术领域
本发明涉及分子标记领域，尤其涉及一种用于紫色辣椒杂交品种纯度鉴定的SSR引物及鉴定方法。
背景技术
辣椒，属于茄科，辣椒属。原产于墨西哥、中南美洲的冈底斯山的热带地区，现在被全世界广泛栽培。是重要的蔬菜作物之一和运用非常广泛的调味品，营养价值和实用价值高。我国辣椒种植面积及产量都占世界首位，其经济总产值也居我国蔬菜作物的首位，是我国很多地区的经济支柱作物。我国90％以上的辣椒种子为杂交品种，纯度是鉴定种子质量的重要指标之一。
作物品种鉴定的常用方法主要包括种子形态鉴定、田间种植形态鉴定和同工酶电泳技术鉴定等。种子形态易受环境条件影响，鉴定结果准确性较差；田间种植形态鉴定存在周期较长，成本较高，工作量较大，并且表型易受栽培措施和环境条件的影响，严重影响品种鉴定的效率及准确性，越来越不能满足育种工作和生产经营的需要；利用同工酶技术鉴定作物品种纯度虽然准确、可靠，但同工酶标记具有组织和器官特异性，信息量非常有限，多态性不够丰富。辣椒种子纯度鉴定技术也从传统的依赖形态学的鉴定方法逐步发展形成分子标记鉴定。分子标记技术能够从DNA水平上揭示子代与亲本间的遗传差异，不受环境条件和栽培措施的影响，无组织、器官及发育特异性，能够检测微小的变异，不受植株生长季节的限制，多态性丰富、稳定性高，可以大大缩短鉴定时间。DNA分子标记技术的迅速发展，使得从基因组水平上检测辣椒杂交种真伪和纯度成为可能。
SSR(Simple Sequence Repeats)标记也称微卫星DNA(Microsatellite DNA)，是近年来发展起来的一种以特异引物PCR为基础的分子标记技术。与其他分子标记(AFLP、RAPD、RFLP等)相比，SSR标记具有以下优点：①多态性高，覆盖整个基因组；②具有多等位基因的特性，提供的信息量高；③以孟德尔方式遗传，通常呈共显性标记，具有很好的稳定性，可以鉴别纯合体和杂合体；④所需DNA量少等。SSR标记技术广泛应用于遗传多样性的研究、亲缘关系的研究以及构建遗传连锁图谱和基因定位。急需建立SSR分子标记体系对辣椒杂交品种进行纯度鉴定，为辣椒的纯度快速鉴定提供技术支持。
发明内容
本发明要解决的一个技术问题是提供一种用于紫色辣椒杂交品种纯度鉴定的SSR引物。
本发明要解决的另外一个技术问题是提供一种用于紫色辣椒杂交品种纯度的鉴定方法。
对于用于紫色辣椒种子纯度鉴定的SSR引物，本发明采用的技术方案是，SSR引物命名为PZJ01，其正向序列为PZJ01-F，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；反向序列为PZJ01-R，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
对于用于紫色辣椒杂交品种纯度的鉴定方法，本发明采用的技术方案是，包括以下步骤：
(1)提取紫色辣椒杂交品种的种子及其亲本叶片基因组DNA：采用改良的CTAB法提取亲本及F1各单株的基因组DNA；
(2)检测步骤(1)提取DNA的纯度和完整性：采用紫外吸收法测量DNA的OD值，检测DNA的浓度，将OD值进行数据统计分析；当OD260/OD280＜1.8，表示蛋白质含量较高；当OD260/OD280＞2.0，表示RNA含量较高；当OD260/OD280＝1.8～2.0，表示DNA较纯因每个DNA的浓度不一样，用1×TE将DNA的浓度都稀释为100ng/ul；用0.8％琼脂糖凝胶检测DNA的纯度和完整性；
(3)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，用所述SSR引物PZJ01进行PCR扩增：
PCR反应体系为10μL，其中包括：
10×Taq Buffer(Mg2+free)1μL
MgCl2(25mM)1μL
NTPs(2.5mM each)1μL
正反向引物Primer(10uM)各0.5μL
0.5U Taq DNA聚合酶
模板20ng
无菌超纯水补齐至10μL；
扩增程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃终延伸10min；PCR产物保存于10℃；
(4)扩增产物检测：步骤(3)扩增完成后，取3μL扩增产物与1μL上样缓冲液混合，采用8％聚丙烯酰胺胶电泳，预电泳的电压为100V，电流为150mA，时间为15min；电泳的电压150V，电流300mA，时间为1h40min，检测PCR的扩增产物，银染显色进行带型统计；
(5)根据特异谱带的扩增结果鉴定紫色辣椒杂交品种的纯度，判定标准为：
母本具有197bp特异谱带；父本具有215bp特异谱带；杂交种具有197bp、215bp特异谱带；
根据上述鉴定结果，按下式换算出紫色辣椒杂交品种的纯度：
纯度(％)＝(1-n/N)×100％
式中，N为待测紫色辣椒种子数目，n为单独具有父本谱带特征或单独具有母本谱带特征或既不同于紫色辣椒杂交品种的谱带特征也不同于父母本谱带特征的植株数目。
作为优选，在步骤(1)中，CTAB法采用以下的2％CTAB提取液来提取亲本及F1各单株的基因组DNA；
2％CTAB提取液的配制：
定容到500ml。
作为另一个优选，步骤(4)中所采用的上样缓冲液选自10×甘油凝胶上样液。
本发明的有益效果是：
采用本发明的SSR引物PZJ01和鉴定方法，可以在紫色辣椒杂交品种的任何时期进行鉴定，能够将杂交种与母本自交种、父本自交种区分开来；对DNA质量要求不高且需要量少；成本较低、操作简单；重复性和稳定性较好；快速高效；准确性高，应用推广前景广阔，为开展辣椒制种和良种的及时销售提供科学依据。
具体实施方式
以下各实施例所针对的紫色辣椒杂交品种为紫晶1号，紫晶1号是安徽省农业科学院园艺研究所经多年研究选育出中等辣味型一代杂种彩色辣椒。该品种中早熟，从定植至采收紫色商品椒约50d；抗性强，耐低温弱光；果实耙齿形，鲜果紫色，生物学成熟果深红色，辣味中等，商品率高；鲜椒产量37500～45000kg/hm2。该品种适于秋延保护地栽培，最适合休闲观光农场、旅游观光景区应用。
实施例1“紫晶1号”品种叶片基因组DNA的获取
具体操作方法如下：
(1)将“紫晶1号”亲本与F1种子将种子放入温水中浸泡3～5小时。种子浸入水后，去除浮子，并搓干净种子表面的污染物，更换清水浸泡达预定时间。浸种结束后，捞出种子，沥干水分，用湿纱布或毛巾包好，置于盆中，放在30℃左右的恒温箱催芽。3天后，大部分种子露白时，将“紫晶1号”亲本与F1种子放入铺有潮湿滤纸的培养皿中，光照强度20001x，光照周期16h光/8h暗，28℃光照培养3d后取叶片。
(2)每个离心管中放入一个辣椒幼叶，加入60～65℃预热的500μL提取缓冲液，放入钢珠4粒，于组织破碎机上将材料打碎，60～65℃水浴20～30min；
其中提取缓冲液为2％CTAB提取液，其配比如下：
定容到500ml高温灭菌，冷却至室温，加2mL巯基乙醇，室温保存。
(3)将步骤(2)获得的液体经10000rpm/min离心10min，取上清于另一离心管，加入等体积(500μL)苯酚：氯仿：异戊醇(体积比为25∶24∶1)混合液；
(4)将步骤(3)得到的混合液经10000rpm/min离心10min，取上清液于另一离心管中，加入等体积的氯仿：异戊醇(体积比为24∶1)混合溶液；
(5)将步骤(4)得到的混合液经10000rpm/min离心10min，取上清溶液于另一离心管中，加入400μL异丙醇混匀；
(6)将步骤(5)得到的混合液经12000rpm/min离心15min，弃上清，固体物质用70％乙醇洗涤，晾干；
(7)向步骤(6)得到的固体中加入200μL ddH20回溶，加入1μLRNA酶37℃水浴30min，-20℃；备用。
实施例2PCR扩增
以实施例1获得的RNA酶解混合物为模板，利用SSR引物PZJ01进行PCR扩增：
PCR反应体系为10μL，其中包括：
10×Taq Buffer(Mg2+free)1μL
MgCl2(25mM)1μL
NTPs(2.5mM each)1μL
正反向引物Primer(10uM)各0.5μL
0.5U Taq DNA聚合酶
模板20ng
无菌超纯水补齐至10μL；
扩增程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃终延伸10min；PCR产物保存于10℃。
实施例3扩增产物检测
扩增产物检测：实施例2扩增完成后，将3μL扩增产物与1μL上样缓冲液混合，采用8％聚丙烯酰胺胶电泳，预电泳(100V，I＝150mA)时间为15min，电泳(150V，I＝300mA)时间为1h40min检测PCR的扩增产物，银染显色进行带型统计。
电泳缓冲液为1×TBE，电泳结束后，凝胶显色采用银染方法，具体过程如下：
1、固定：加入含有5％乙酸、10％无水乙醇的200mL固定液，摇床上轻轻摇晃固定15min；
2、水洗：ddH20水洗2次，每次1min；
3、染色：加入200mL含有0.2％AgNO3的染色液，摇床上轻轻摇晃15min(避光)；
4、水洗：先用去离子水漂洗30～60s，再用含有0.2％Na2S203的200mL去离子水漂洗60s；
5、显色：用含有1.5％NaOH、1％HCHO的200mL显影液显影，至条带清晰为止，最后用相机照相保存。
实施例4鉴定“紫晶1号”杂交种的纯度
根据特异谱带的电泳结果鉴定“紫晶1号”杂交种的纯度，判定标准为：
母本具有197bp特异谱带；父本具有215bp特异谱带；杂交种具有197bp、215bp特异谱带；
根据上述鉴定结果，按下式换算“紫晶1号”品种纯度
纯度(％)＝(1-n/N)×100％
式中，N为待测辣椒种子数目，n为单独具有父本谱带特征或单独具有母本谱带特征或既不同于“紫晶1号”谱带特征也不同于父母本谱带特征的植株数目。
实验例
以2016年某农场生产的紫色辣椒杂交品种“紫晶1号”种子为例，一种是采用实施例1～4所记载的SSR分子标记方法进行纯度鉴定，具体过程如下：
8月份收获F1代种子后马上将F1代种子萌发，大约四天后取幼嫩组织提取辣椒DNA，利用实施例1～4所记载的SSR分子标记方法进行纯度鉴定，一周后获得的种子纯度结果为100％。
另一种是采用常规方法进行纯度鉴定，具体过程如下：
利用常规鉴定方法即田间种植形态鉴定：等全部辣椒品种收获后，一起到海南加代鉴定纯度，生长周期为100天左右，且受到多种恶劣天气影响，需重复播种鉴定，最终鉴定纯度结果也为100％。
结论：与常规鉴定方法相比较，利用实施例1～4的分子标记法鉴定紫色辣椒杂交品种纯度，具有快速高效、操作简单、重复性和稳定性较好、成本较低的特点。
以上所述的本发明实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何在本发明的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的权利要求保护范围之内。
序列表
<110> 安徽省农业科学院园艺研究所
<120> 一种用于紫色辣椒杂交品种纯度鉴定的SSR引物及鉴定方法
<130> NO
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2

Claims (4)

1.一种用于紫色辣椒杂交品种纯度鉴定的SSR引物，其特征在于，所述SSR引物命名为PZJ01，其正向序列为PZJ01-F，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；反向序列为PZJ01-R，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.一种紫色辣椒杂交品种纯度的鉴定方法，包括以下步骤：
(1)提取紫色辣椒杂交种子及其亲本叶片基因组DNA：采用改良的CTAB法提取亲本及F1各单株的基因组DNA；
(2)检测步骤(1)提取DNA的纯度和完整性：采用紫外吸收法测量DNA的OD值，检测DNA的浓度，将OD值进行数据统计分析；当OD260/OD280＜1.8，表示蛋白质含量较高；当OD260/OD280＞2.0，表示RNA含量较高；当OD260/OD280＝1.8～2.0，表示DNA较纯因每个DNA的浓度不一样，用1×TE将DNA的浓度都稀释为100ng/u1；用0.8％琼脂糖凝胶检测DNA的纯度和完整性；
(3)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，用所述SSR引物PZJ01进行PCR扩增：
PCR反应体系为10μL，其中包括：
10×Taq Buffer(Mg2+free)1μL
MgC12(25mM)1μL
NTPs(2.5mM each)1μL
正反向引物Primer(10uM)各0.5μL
0.5U Taq DNA聚合酶
模板20ng
无菌超纯水补齐至10μL；
扩增程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃终延伸10min；PCR产物保存于10℃；
(4)扩增产物检测：步骤(3)扩增完成后，取3μL扩增产物与1μL上样缓冲液混合，采用8％聚丙烯酰胺胶电泳，预电泳的电压为100V，电流为150mA，时间为15min；电泳的电压150V，电流300mA，时间为1h40min，检测PCR的扩增产物，银染显色进行带型统计；
(5)根据特异谱带的扩增结果鉴定紫色辣椒杂交品种的纯度，判定标准为：
母本具有197bp特异谱带；父本具有215bp特异谱带；杂交种具有197bp、215bp特异谱带；
根据上述鉴定结果，按下式换算出紫色辣椒杂交品种的纯度：
纯度(％)＝(1-n/N)×100％
式中，N为待测紫色辣椒种子数目，n为单独具有父本谱带特征或单独具有母本谱带特征或既不同于紫色辣椒杂交品种的谱带特征也不同于父母本谱带特征的植株数目。
3.根据权利要求2所述的鉴定方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述CTAB法采用以下的2％CTAB提取液来提取亲本及F1各单株的基因组DNA；
2％CTAB提取液的配制：
定容到500ml。
4.根据权利要求2所述的鉴定方法，其特征在于，步骤(4)中所采用的上样缓冲液选自10×甘油凝胶上样液。
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