CN112425389A - 一种用于辣椒亲缘关系分析的ssr分子标记引物对及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于辣椒亲缘关系分析的SSR分子标记引物对及其应用，属于蔬菜育苗及分子辅助选择领域，SSR分子标记引物对具体为43对引物对，对应的核苷酸序列为SEQ ID NO 1～86所示核苷酸序列，还包括构建待选辣椒品种之间的亲缘关系树状图，选取亲缘关系经的接穗和砧木，砧木比接穗提前3‑5天播种，在接穗2叶1心期进行嫁接，嫁接时，先去除砧木心叶，用刀片沿垂直砧木叶片展开方向劈开砧木胚轴，深度0.6‑0.8cm，保留其中一侧表皮，不要将茎秆完全劈开，然后切取接穗，沿真叶下部1cm处向下斜切，切口长0.5cm左右，背侧再斜切一刀，形成楔形，插入砧木劈缝中，用嫁接夹固定；本发明的方法可有效提高辣椒嫁接成活率，实现接穗和砧木的快速筛选。
Description
技术领域
本发明涉及属于蔬菜育苗及分子辅助选择领域，具体为一种提高辣椒嫁接成活率的方法。
背景技术
辣椒在我国普遍种植，其中800余万亩为设施栽培，在辣椒的设施栽培中，连作障碍给生产带来诸多困扰，选择抗性强的砧木进行辣椒嫁接育苗，能够有效克服辣椒的连作障碍。目前我国辣椒嫁接育苗发展相对缓慢，嫁接育苗相关技术有待进一步提升。嫁接育苗中，一个关键点就是选择抗性强并且与接穗亲和性高的砧木品种。虽然目前市场上有不少辣椒砧木品种，但与目标接穗的亲和性尚不清楚，通过人工嫁接后观察嫁接成活情况是判断亲和性的方法之一，但工作量大，费时费力。近年来，分子标记技术快速发展，应用分子标记技术进行亲和性判断，可有更加快速有效，但具体方法尚不清晰。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种用于辣椒亲缘关系分析的SSR分子标记引物对及其应用，以解决现有技术中提高嫁接成活率的方法时间成本高的技术问题。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明提供了一种用于辣椒亲缘关系分析的SSR分子标记引物对，所述SSR分子标记引物对具体为43对引物对，对应的核苷酸序列为SEQ ID NO 1～86所示核苷酸序列，其中按顺序每两个核苷酸序列构成一个引物对。
本发明还提供一种利用上述SSR分子标记引物对提高辣椒嫁接成活率的方法，该方法包括：
步骤1、利用权利要求1所述SSR分子标记引物对构建待选辣椒品种之间的亲缘关系树状图；
步骤2、根据步骤1构建的亲缘关系树状图，选取亲缘关系经的接穗和砧木。
进一步，该方法还包括选取好接穗和砧木后采用以下方法嫁接：
S1、砧木比接穗提前3-5天播种，在接穗2叶1心期进行嫁接；
S2、嫁接时，先去除砧木心叶，用刀片沿垂直砧木叶片展开方向劈开砧木胚轴，深度0.6-0.8cm，保留其中一侧表皮，不要将茎秆完全劈开，然后切取接穗，沿真叶下部1cm处向下斜切，切口长0.5cm左右，背侧再斜切一刀，形成楔形，插入砧木劈缝中，用嫁接夹固定。
进一步，该方法还包括在嫁接完成后第2天喷施0.03mg/L的油菜素内酯。
进一步，喷施的油菜素内酯溶液中还包括6g/L的葡萄糖。
进一步，步骤1中亲缘关系树状图具体由以下方法获得：
步骤a、提取各待选辣椒品种的DNA；
步骤b、利用SSR分子标记引物对分别对各辣椒品种的DNA进行PCR扩增，获得多条多态性条带；
步骤c、统计分析多态性条带，并基于Jaccards相似系数和UPGMA方法构建辣椒种质群体的树状图，获得待选辣椒种质群体亲缘关系树状图。
本发明相比现有技术具有以下优点：
本发明通过提供可用于分析辣椒种质间亲缘关系的分子标记组，可获取辣椒种质群体亲缘关系树状图，从而能够迅速判断辣椒接穗和砧木之间的亲缘关系，从而为挑选砧木和接穗缩短了时间，且选择亲缘关系近的接穗和砧木可有效提高嫁接成活率；同时通过改进嫁接方法和喷施油菜素内酯及葡萄糖的混合物，可进一步提高嫁接成活率，为辣椒连作提供了较好的思路和解决办法。
附图说明
图1为实施例所得亲缘关系树状图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例
本实施例选用18种代表性的辣椒种质，包括8个辣椒常见品种包括春辣九号，杭椒二号，苏椒五号，庆椒117，红优三号，福椒四号，满丰二号，福椒旋丽F1；10个辣椒常见砧木品种，包括威壮贝尔F1，东洋强势F1，辣椒砧木206，野立姆，保强，根基，沃夫冈，格拉芙特，TANTAN F1，富根卫士。
随机选择3个砧木型品种及3个接穗型品种，共6个品种，提取DNA，用于多态性SSR标记筛选；参考网上公开发表的论文及相关数据库初选出120对SSR标记，用这120对标记引物分别扩增前面筛选的6个品种，在这6个品种DNA扩增结果表现出多态性的即为多态性引物，累计获得43个多态性SSR标记。
本发明选用的43个SSR分子标记在选定的18个辣椒种质中具有多态性。根据43个分子标记设计的引物对具体为SEQ ID NO.1-86所示的核苷酸序列。(每个SSR分子标记对应1对上下游引物，例如标记SYZM1对应的一对上下游引物为SYZM-1F和SYZM-1R)
表1
获取对应的引物对后，构建所有品种之间的亲缘关系树状图，具体采用以下方法，该方法包括：
步骤1、提取不同辣椒品种的DNA；
步骤2、根据上述引物对的核苷酸序列，合成引物；
步骤3、利用引物对分别对各辣椒品种DNA进行PCR扩增，获得多条多态性条带；
步骤4、统计分析多态性条带，并基于Jaccards相似系数和UPGMA方法构建辣椒种质群体的树状图，获得辣椒种质群体亲缘关系树状图；
步骤5、根据辣椒种质群体亲缘关系树状图判断辣椒品种间的亲缘关系。
所得亲缘关系树状图如图1，其中ZB：威壮贝尔F1；DY：东洋强势F1；Z206：辣椒砧木206；YLM：野立姆；BQ：保强；GJ：根基；WFG：沃夫冈；GL：格拉芙特；TAN：TANTAN F1；FG：富根卫士；CL：春辣九号；H2：杭椒二号；SJ5：苏椒五号；QJ：庆椒117；HY3：红优三号；F4：福椒四号；MF2：满丰二号；LI：福椒旋丽F1。
实施例2
根据该亲缘关系图，挑选亲缘关系远近不同的组合进行嫁接成活率检测，分别检测亲缘关系不同组合的嫁接成活率，以以下组合为例：亲缘关系较近的BQ-LI组合、亲缘关系较远的BQ-HY3；亲缘关系较近的TAN-SJ5、亲缘关系较远的TAN-LI。嫁接成活率如表2。
表2不同嫁接组合嫁接成活率
注：BQ、TAN、LI、HY3、SJ5分别代表辣椒品种保强、TANTAN F1、福椒旋丽F1、红优三号、苏椒五号。
由表2可知，依据分子标记构建的亲缘关系图可以作为砧穗组合亲和力判定的依据，亲缘关系越近的接穗和砧木，其对应的嫁接成活率越高。
实施例3
嫁接方法的改进
选取好接穗和砧木后采用以下方法嫁接：
s1、砧木比接穗提前3-5天播种，在接穗2叶1心期进行嫁接；
S2、嫁接时，先去除砧木心叶，用刀片沿垂直砧木叶片展开方向劈开砧木胚轴，深度0.6-0.8cm，保留其中一侧表皮，不要将茎秆完全劈开，然后切取接穗，沿真叶下部1cm处向下斜切，切口长0.5cm左右，背侧再斜切一刀，形成楔形，插入砧木劈缝中，用嫁接夹固定。
在嫁接完成后第2天喷施葡萄糖6g/L+2,4表油菜素内酯0.03mg/L浓度。
喷施的油菜素内酯溶液中还包括6g/L的葡萄糖。
以改良插接法在接穗2叶1心期进行嫁接作为对照例。
嫁接完成后，统计对应的嫁接速度、成活率等，所得结果如表3。
表3两种嫁接方法嫁接速度、成活率等比较
与常规劈接相比，该改良插接法大幅提升嫁接效率，成活率基本相同，嫁接完成后至嫁接苗成活所需时间缩短2天，减少嫁接后管理工时，并且愈合口更加平滑，“大小脚”发生率降低(表3)。
实施例4
为了获取最佳葡萄糖和2,4表油菜素内酯的喷施组合，进行以下操作。
设置不同浓度梯度葡萄糖、2,4表油菜素内酯对嫁接苗进行喷施，结果如表4。
表4喷施葡萄糖+2,4表油菜素内酯对嫁接苗的影响
最终确定，葡萄糖6g/L，2,4表油菜素内酯0.03mg/L浓度为最优浓度，可显著提升嫁接成活率，并且嫁接完成后至嫁接苗成活所需时间也缩短了2天。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 安徽农业大学，安徽省皖江蔬菜产业技术研究院有限责任公司
<120> 一种用于辣椒亲缘关系分析的SSR分子标记引物对及其应用
<160> 86
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成(Synthetic gene)
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tgaaaagacg attttgtcta atgcg 25
<210> 71
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成(Synthetic gene)
<400> 71
ggcggagaag aactagacga ttagc 25
<210> 72
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成(Synthetic gene)
<400> 72
ccacccaatc cacatagacg 20
<210> 73
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成(Synthetic gene)
<400> 73
acgaggccca agctgttatg tc 22
<210> 74
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成(Synthetic gene)
<400> 74
ttgtcccgac tctccattga cc 22
<210> 75
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成(Synthetic gene)
<400> 75
cactttgata cgtgaacact tcc 23
<210> 76
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成(Synthetic gene)
<400> 76
agtttgcact ggtcctgctc 20
<210> 77
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成(Synthetic gene)
<400> 77
tcacctcata agggcttatc aatc 24
<210> 78
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成(Synthetic gene)
<400> 78
tccttaacct tacgaaacct tgg 23
<210> 79
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成(Synthetic gene)
<400> 79
gcaaggatgc ttagttgggt gtc 23
<210> 80
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成(Synthetic gene)
<400> 80
tcccaaaatt accttgcagc ac 22
<210> 81
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成(Synthetic gene)
<400> 81
tcccagaccc ctcgtgatag 20
<210> 82
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成(Synthetic gene)
<400> 82
tcctgctcct tccacaactg 20
<210> 83
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成(Synthetic gene)
<400> 83
gaatgtgaat cgcccgtatg c 21
<210> 84
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成(Synthetic gene)
<400> 84
catccggcat caatatgtta gtagc 25
<210> 85
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成(Synthetic gene)
<400> 85
gggtttgcat gatctaagca tttt 24
<210> 86
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成(Synthetic gene)
<400> 86
cgctggaatg cattgtcaaa ga 22
Claims (6)
1.一种用于辣椒亲缘关系分析的SSR分子标记引物对，其特征在于，所述SSR分子标记引物对具体为43对引物对，对应的核苷酸序列为SEQ ID NO 1～86所示核苷酸序列，其中按顺序每两个核苷酸序列构成一个引物对。
2.一种利用权利要求1所述SSR分子标记引物对提高辣椒嫁接成活率的方法，其特征在于，该方法包括：
步骤1、利用权利要求1所述SSR分子标记引物对构建待选辣椒品种之间的亲缘关系树状图；
步骤2、根据步骤1构建的亲缘关系树状图，选取亲缘关系经的接穗和砧木。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，该方法还包括选取好接穗和砧木后采用以下方法嫁接：
S1、砧木比接穗提前3-5天播种，在接穗2叶1心期进行嫁接；
S2、嫁接时，先去除砧木心叶，用刀片沿垂直砧木叶片展开方向劈开砧木胚轴，深度0.6-0.8cm，保留其中一侧表皮，不要将茎秆完全劈开，然后切取接穗，沿真叶下部1cm处向下斜切，切口长0.5cm左右，背侧再斜切一刀，形成楔形，插入砧木劈缝中，用嫁接夹固定。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，该方法还包括在嫁接完成后第2天喷施0.03mg/L的油菜素内酯。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，喷施的油菜素内酯溶液中还包括6g/L的葡萄糖。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤1中亲缘关系树状图具体由以下方法获得：
步骤a、提取各待选辣椒品种的DNA；
步骤b、利用SSR分子标记引物对分别对各辣椒品种的DNA进行PCR扩增，获得多条多态性条带；
步骤c、统计分析多态性条带，并基于Jaccards相似系数和UPGMA方法构建辣椒种质群体的树状图，获得待选辣椒种质群体亲缘关系树状图。
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2020
- 2020-11-23 CN CN202011323340.XA patent/CN112425389B/zh active Active
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