CN1887048A - 无核荔枝嫁接砧木选择新技术 - Google Patents
无核荔枝嫁接砧木选择新技术 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1887048A CN1887048A CN 200510080811 CN200510080811A CN1887048A CN 1887048 A CN1887048 A CN 1887048A CN 200510080811 CN200510080811 CN 200510080811 CN 200510080811 A CN200510080811 A CN 200510080811A CN 1887048 A CN1887048 A CN 1887048A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- primer
- ssr
- lichee
- litchi
- germplasm
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了无核荔枝嫁接砧木选择新技术。发明步骤：一)、采用选择性扩增微卫星(SAM)结合数据库搜索法分离简单序列重复(SSR)序列；二)、用简单序列重复(SSR)序列的侧翼序列设计SSR引物；三)、筛选有用引物，获得荔枝特异性的简单序列重复(SSR)标记；四)、应用荔枝特异性的简单序列重复(SSR)标记对部分荔枝种质进行遗传多样性分析；五)、数据分析；六)、根据数据分析结果，挑选亲缘关系近的荔枝种质作砧木进行无核荔枝的嫁接繁殖。通过无核荔枝嫁接砧木选择新技术进行无核荔枝的嫁接繁殖，使无核荔枝的接穗嫁接亲和力好、繁殖形成同质的无性系，成活率高达95％。无核荔枝品种与妃子笑、糯米糍相比，它具有果大、早熟、种核退化、风味口感上佳等优点。
Description
技术领域
本发明涉及果树嫁接技术领域，具体涉及一种应用简单序列重复(SimpleSequence Repeat，简称SSR)分子标记解决无核荔枝嫁接不亲和问题的技术方法
背景技术
荔枝(Litchi chinensis Sonn.)为无患子科(Sapindaceae)荔枝属(Litchi)植物，因其果实色泽鲜艳、肉质细嫩多汁、香甜可口而享誉中外，有“人间仙果”、“佛果”、“果王”的美称。荔枝果肉的营养价值高，每100克果汁中含维生素C 36毫克、蛋白质0.7克、脂肪0.6克、碳水化合物14克，产生热能267.7760千焦。中医认为，荔枝味酸，性平偏温，具有生津止渴、补气养血、理气止痛等功效，尤其对病后体虚、气血不足、胃脘胀痛、胃阴不足及口渴咽干等症具有神奇的医疗保健作用。因此民间常把荔枝作为药疗补品食用。除了用作食品外，其果实还可以用来酿酒；其花芳香多蜜，是理想的蜜源植物；树皮、果皮、树根含有大量单宁，可以工业用；百年荔枝的树干是上好的木材，称为“中国酸枝木”，非常珍贵。由于荔枝用途广泛、经济价值高，因此在我国水果业中具有重要的地位。
无核荔枝目前已在海南开始种植，但是其中有个严重的问题。用普通黑叶或其它荔枝实生苗作砧木进行嫁接繁殖，由于不亲和现象突出，导致成活率很低，不到5％。显然，嫁接不亲和的问题已成为无核荔枝大面积推广种植的限制因素。其实，不仅无核荔枝存在着严重的嫁接不亲和问题，其它荔枝主栽品种在繁殖的时候，也存在一定的嫁接不亲和现象。主要症状有①嫁接口肿大，上大下小明显，愈合不正常；②嫁接口愈合基本正常，也有1～2次正常梢次，但以后只在梢端簇生短小枝梢，甚至抽生短小花穗，不能结果；③定植后苗木变黄，不能抽梢，长时间维持生而不长的状况；④原来生长正常并已结果多年，随着时间的推移，逐步表现嫁接口上下生长不平衡而出现地上部黄化、衰退的现象。像这些嫁接不亲和的植株应该在早期就进行鉴定，然而传统的砧穗搭配试验周期长，成本高，难以快速有效地解决这个问题。而现代分子标记技术给迷茫中的我们带来了希望。
影响荔枝嫁接亲和性的因素很多，有遗传因素、形态解剖学的因素和生理生化的因素，但主要是亲缘关系的影响。一般认为，砧木与接穗的亲缘关系越近，其形态结构和生理代谢途径就越相似，嫁接面也就越容易愈合。基于这种考虑，我们开展了荔枝SSR分子标记的研究工作，并用自己开发的荔枝SSR标记对荔枝种质，包括无核荔枝、早熟荔枝、大果型荔枝的亲缘关系进行了分析，从中找到了适于无核荔枝进行嫁接繁殖的砧木。
发明内容
本发明的目的在于提供一种无核荔枝嫁接砧木选择新技术，即开发荔枝特异的SSR分子标记，用于鉴定和筛选与无核荔枝亲缘关系相近的种质材料，确定最优接穗/砧木组合，有效解决无核荔枝嫁接不亲和问题；荔枝嫁接砧木选择新技术，应用荔枝特异SSR分子标记分析荔枝种质获得一个嫁接效果好的无核荔枝砧穗组合；荔枝特异SSR分子标记采用以下技术步骤获得：
一)、任用一种荔枝品种为材料采用选择性扩增微卫星(Selectively AmplifiedMicrosatellite，简称SAM)法结合数据库搜索法分离简单序列重复(SimpleSequence Repeat，简称SSR)序列；
二)、用SSR的侧翼序列设计SSR引物：采用Primer Premier 5.0软件设计特异引物；引物设计参数为：引物长度(18-24nt)、3’端稳定性(-5.5～-9.0kcal/mol)、引物Tm值(53-60℃)、GC含量(45～55％)、引物rating值＞90；
三)、筛选有用引物，获得荔枝特异性的简单序列重复(SSR)标记。采用与步骤1相同的荔枝品种作材料，以其基因组DNA为模板，更换不同的简单序列重复(SSR)引物进行扩增；采用以下反应程序：94℃1分15秒、(57℃或55℃、53℃、51℃、45℃)不同的退火温度1分15秒、72℃45秒，35次循环，反应体系20微升；PCR产物经5％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、银染显色，选出有强扩增带的引物便是有用引物；其对应的扩增带便是荔枝特异性的简单序列重复(SSR)标记。同时选出每对引物最适宜的退火温度；核酸引物序列见表1：
表1荔枝特异性SSR标记(基因座)及其引物表
| 基因座名称 | 引物对名称 | 重复类型 | 左引物序列 | 右引物序列 | 退火温度 | 等位基因数 | 片段大小(bp) |
| Lit1Lit2Lit3Lit4Lit5Lit6Lit7Lit8Lit9Lit10Lit11Lit12Lit13Lit14Lit15Lit16Lit17Lit18Lit19Lit20Lit21Lit22Lit23Lit24Lit25Lit26Lit27Lit28 | Spe3spe5Spe9Spe12Spe14Spe16Spe17Spe18Spe22Spe26Spe28Spe30Spe33Spe36Spe38Spe39Spe41Spe37Spe40Spe32spe5Spe24-25Spe20-21S3S3S10S11S12 | (CT)6(CT/TC)6(CT)6(CT)6(TC/CT)6(CT)8(CT/TC)9(CT)6(CT)11(TC)6(CT)6(TC)6(CT/TC)6(CT)13(TC)6(CT)7(CT)6(CT)6(CT/TC)6(TC)6(CT/TC)6(GT)4GC(TG)4(TCTCT)3....(TC/CT)5(TCTCT)3(TC)6(TC)6(CT)18(TC)6(TC)6 | 5′TCGGCGACGAATGAAAG 3′5′GCGTTACTCGTCGGTCGT 3′5′CGGGCTTGTCTATTGACGCTG 3′5′CGTTGCGGTTGGACAGGT 3′5′CCCAGGCACGAACCAAAT 3′5′CGGAATCATCGGCTCACAA 3′5′CGCAACTTGAACCGTCCGT 3′5′GCTCGGAAACTAAGCAAAGG 3′5′GGCATAAAATCGAAGGATCAG3′5′GGTCGGCATCTACACTTCAG 3′5′AACCGAGTCAACCCAACG 3′5′CCGTCATTGGCTACACTCAT 3′5′GGCAATACCAGCAGC ATAAAG3′5′GGAGGTAGTGAAAACCAGGA3′5′GGCTACTTGGGCTAAGATTGT 3′5′CGTGACCGTTTTCTTTGAGG 3′5′GGCAACTAAACGGCAAAAT 3′5′GCGTAACTGCTGTCATAACCTG3′5′GTGGTTCCAAGCGATGAT 3′5′CGGTATTGGGTGCTGCTT 3′5′GCGTTACTCGTCGGTCGT 3′5′CGAGACCGATAGCGAACAA 3′5′CGTTTCATTTCCCCTCTTCAT 3′5′AGCGGAGCAGGAGCGGATG 3′5′AGCGGAGCAGGAGCGGATG 3′5′CGGTGAAAATTCTTTGCTCTG 3′5′GGTCGTCGGTCGTCAAGT 3′5′GTCGGTGGAGATGTGAAGG 3′ | 5′-KKVRVRV(CT)6-3′5′-KKRVRVR(TC)6-3′5′-GGCACCTCATCCCAACC-3′5′AGCGTATTGTCATTGCACCTT 3′5′-KKVRVRV(CT)6-3′ | 53℃53℃53℃53℃53℃53℃53℃53℃53℃53℃53℃53℃53℃53℃53℃53℃53℃53℃53℃53℃53℃57℃57℃55℃53℃55℃ | 3122226413113212222312121212 | 129～155250166～184320～370150～200110～11468～150120～17011880～120375113303～40060～8291133，139150～20074～106100～150175～220163100～150183240～275150175～200140190～210 |
| Lit29Lit30Lit31Lit32Lit33Lit34Lit35Lit36Lit37Lit38Lit39Lit40Lit41Lit42Lit43Lit44Lit45Lit46Lit47Lit48Lit49Lit50Lit51 | S12S12S13S14S16S16S16S17S18S19S19S20S21S22S23S27S27S29S30S31S32S32S33 | (TC)6(TC)6(CT)6(CT)6(GA)6G(GA)6G(GA)6G(GA)6G(AAC)4…(AG)12(AG)6(AG)6(GA)6(TC)7(TC)7(GA)6(TC)7(TC)7(GA)8(TC)7(CT)6...(ATCC)3(CT)16(CT)16(TC)7T | 5′GTCGGTGGAGATGTGAAGG 3′5′GTCGGTGGAGATGTGAAGG 3′5′CGGAATCCTCTGTTATGTTG 3′5′GGAGGGTCCGAATGTTTG 3′5′CCGTGTCCAGCACAGTTGAG 3′5′CCGTGTCCAGCACAGTTGAG 3′5′CCGTGTCCAGCACAGTTGAG 3′5′CCAACCAGACCTCGCATAG 3′5′GGACTACACTCGACCTGAT 3′5′CAAGGACGACGGACGAG 3′5′CAAGGACGACGGACGAG 3′5′CGGCACAAAGTTCCGTGGT 3′5′CGGGAATGCACTACAAAGAT 3′5′ACGATGCGATATTGCTTAC 3′5′GGCAGCTCCTTGGGTGA 3′5′GGCAATATGATGGAGCAAGG 3′5′GGCAATATGATGGAGCAAGG 3′5′TTGGGTTCCCGCCGATG 3′5′GGCAAAAGCAAAGCAATCGT 3′5′TGTCCCAGCAATCATCAAAG 3′5′CGGTGCATAAAATCGAAGGAT 3′5′CGGTGCATAAAATCGAAGGAT 3′5′CCCGAATACAAAACGATGCGAT 3′ | 5′-KKRVRVR(TC)6-3′ | 55℃55℃55℃55℃45℃45℃45℃55℃53℃53℃53℃55℃55℃55℃55℃55℃55℃55℃55℃53℃53℃53℃53℃ | 21112222222211121222111 | 125～13090101106151～160100～12555～75133～150118～135130～14097～101151～155139160147198～2009886～10057～6559～11524069172 |
根据所述的无核荔枝嫁接砧木选择新技术；一个嫁接效果好的无核荔枝砧穗组合，采用以下技术步骤获得：
一)、应用荔枝特异性的简单序列重复(SSR)标记对部分荔枝种质进行遗传多样性分析；首先用改良的CTAB法提取多个荔枝种质的基因组DNA，然后用筛选出来的荔枝特异性的简单序列重复(SSR)引物，对基因组DNA进行PCR扩增。采用以下反应程序：94℃1分15秒、各引物最适宜的退火温度1分15秒，72℃45秒，35次循环，反应体系总体积为20微升；PCR产物经5％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、银染显色；
二)、数据分析：
1)、SSR标记分析及遗传多样性分析选择扩增条带清晰且有多态性的SSR标记进行数据统计，有带记为“1”，无带记为“0”；用MVSP 3.13f软件根据Nei&Li(1979)的方法计算各种质间的相似系数(Genetic Similarity)
种质x和种质y各自的谱带数)
2)、聚类分析采用UPGMA(Unweighted pair-group method using anarithmetic average)法，应用MVSP 3.13f软件进行聚类分析；
三)、根据数据分析结果，挑选亲缘关系近的荔枝种质作砧木进行无核荔枝的嫁接繁殖；通过实验验证最后确定无核荔枝与A13号为最优接穗/砧木组合；当A13号荔枝种质的果实成熟以后，采果将种子取出，用水浸泡一天一夜，当胚根突破种皮时，播于苗床，苗床要遮荫，第二年6月便可作砧木进行嫁接。
本发明的优点及有益效果是：应用开发的荔枝SSR标记对荔枝种质，包括无核荔枝、早熟荔枝、大果型荔枝的亲缘关系进行了分析，从中找到了适于无核荔枝进行嫁接繁殖的砧木。通过无核荔枝嫁接砧木选择新技术进行无核荔枝的嫁接繁殖，使无核荔枝的接穗嫁接亲和力好、繁殖形成同质的无性系，成活率高达95％。无核荔枝品种与妃子笑、糯米糍相比，它具有果大、早熟、种核退化、风味口感上佳等优点。
具体实施方式
从以下实施例将进一步理解本发明：
1、材料来源：以无核荔枝、A13号、无核丁香等32个海南特有的荔枝品种和白糖罂、妃子笑、黑叶等少数几个广东荔枝品种以及两个龙眼主栽品种——石硖、储良作为实验材料。
2、方法：
(1)、分离SSR序列：
1)用无核荔枝作材料，用选择性扩增微卫星(Selectively AmplifiedMicrosatellite，SAM)法分离SAM片段，挑选100个SAM片段回收、克隆、测序，再用Sputnik软件对测序结果进行分析，获得SSR序列。
结果分析：几乎所有片段都含有SSR序列。其中，大部分测序片段含有二核苷酸CT/TC也就是AG/GA重复(这与SAM扩增时采用的SSR primer——PCT6相符)，且重复数多为6，这样的片段占了80.1％。也有重复数为7、8、9、11、12、13、16的CT/TC序列；最多的达到18个CT重复，除了二核苷酸重复之外，个别序列中还含有三核苷酸重复、四核苷酸重复和五核苷酸重复。
2)、搜索GENEBANK和EMBL数据库，查到5个与荔枝有关的基因序列，经Sputnik软件分析，发现ID号为AF235949的菲律宾荔枝28S大亚基核糖体RNA基因序列中含有一段二核苷酸(GT)重复：dinucleotide 476：493--length 18score 9GTGTGTGTGCTGTGTGTG这是一段间隔微卫星序列，中间被一个胞嘧啶核苷酸所打断。
(2)、设计SSR引物根据SSR的侧翼序列采用Primer Premier 5.0软件设计引物。共设计出70对引物。
(3)、有用引物的筛选，获得荔枝特异性的SSR标记。用上述70对引物对无核荔枝的基因组DNA进行扩增。采用以下反应程序：94℃1分15秒、(57℃或55℃、53℃、51℃、45℃)不同的退火温度1分15秒、72℃45秒，35次循环，反应体系20微升。PCR产物经5％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、银染显色。结果为：42对引物有强扩增带，为有用引物。其对应的扩增带便是荔枝特异性的SSR标记。同时选出每对引物最适宜的退火温度。核酸引物序列见表1：
表1荔枝特异性SSR标记(基因座)及其引物表
| 基因座名称 | 引物对名称 | 重复类型 | 左引物序列 | 右引物序列 | 退火温度 | 等位基因数 | 片段大小(bp) |
| Lit1Lit2Lit3Lit4Lit5Lit6Lit7Lit8Lit9Lit10Lit11Lit12Lit13Lit14Lit15Lit16Lit17Lit18Lit19Lit20Lit21Lit22Lit23Lit24Lit25Lit26Lit27Lit28Lit29Lit30Lit31Lit32Lit33Lit34Lit35Lit36Lit37Lit38Lit39Lit40Lit41Lit42Lit43Lit44Lit45Lit46Lit47Lit48 | Spe3spe5Spe9Spe12Spe14Spe16Spe17Spe18Spe22Spe26Spe28Spe30Spe33Spe36Spe38Spe39Spe41Spe37Spe40Spe32spe5Spe24-25Spe20-21S3S3S10S11S12S12S12S13S14S16S16S16S17S18S19S19S20S21S22S23S27S27S29S30S31 | (CT)6(CT/TC)6(CT)6(CT)6(TC/CT)6(CT)8(CT/TC)9(CT)6(CT)11(TC)6(CT)6(TC)6(CT/TC)6(CT)13(TC)6(CT)7(CT)6(CT)6(CT/TC)6(TC)6(CT/TC)6(GT)4GC(TG)4(TCTCT)3…(TC/CT)5(TCTCT)3(TC)6(TC)6(CT)18(TC)6(TC)6(TC)6(TC)6(CT)6(CT)6(GA)6G(GA)6G(GA)6G(GA)6G(AAC)4…(AG)12(AG)6(AG)6(GA)6(TC)7(TC)7(GA)6(TC)7(TC)7(GA)8(TC)7(CT)6...(ATCC)3 | 5′TCGGCGACGAATGAAAG 3′5′GCGTTACTCGTCGGTCGT 3′5′CGGGCTTGTCTATTGACGCTG 3′5′CGTTGCGGTTGGACAGGT 3′5′CCCAGGCACGAACCAAAT 3′5′CGGAATCATCGGCTCACAA 3′5′CGCAACTTGAACCGTCCGT 3′5′GCTCGGAAACTAAGCAAAGG 3′5′GGCATAAAATCGAAGGATCAG3′5′GGTCGGCATCTACACTTCAG 3′5′AACCGAGTCAACCCAACG 3′5′CCGTCATTGGCTACACTCAT 3′5′GGCAATACCAGCAGCATAAAG3′5′GGAGGTAGTGAAAACCAGGA3′5′GGCTACTTGGGCTAAGATTGT 3′5′CGTGACCGTTTTCTTTGAGG 3′5′GGCAACTAAACGGCAAAAT 3′5′GCGTAACTGCTGTCATAACCTG3′5′GTGGTTCCAAGCGATGAT 3′5′CGGTATTGGGTGCTGCTT 3′5′GCGTTACTCGTCGGTCGT 3′5′CGAGACCGATAGCGAACAA 3′5′CGTTTCATTTCCCCTCTTCAT 3′5′AGCGGAGCAGGAGCGGATG 3′5′AGCGGAGCAGGAGCGGATG 3′5′CGGTGAAAATTCTTTGCTCTG 3′5′GGTCGTCGGTCGTCAAGT 3′5′GTCGGTGGAGATGTGAAGG 3′5′GTCGGTGGAGATGTGAAGG 3′5′GTCGGTGGAGATGTGAAGG 3′5′CGGAATCCTCTGTTATGTTG 3′5′GGAGGGTCCGAATGTTTG 3′5′CCGTGTCCAGCACAGTTGAG 3′5′CCGTGTCCAGCACAGTTGAG 3′5′CCGTGTCCAGCACAGTTGAG 3′5′CCAACCAGACCTCGCATAG 3′5′GGACTACACTCGACCTGAT 3′5′CAAGGACGACGGACGAG 3′5′CAAGGACGACGGACGAG 3′5′CGGCACAAAGTTCCGTGGT 3′5′CGGGAATGCACTACAAAGAT 3′5′ACG ATGCGATATTGCTTAC 3′5′GGCAGCTCCTTGGGTGA 3′5′GGCAATATGATGGAGCAAGG 3′5′GGCAATATGATGGAGCAAGG 3′5′TTGGGTTCCCGCCGATG 3′5′GGCAAAAGCAAAGCAATCGT 3′5′TGTCCCAGCAATCATCAAAG 3′ | 5′-KKVRVRV(CT)6-3′5′-KKRVRVR(TC)6-3′5′GGCACCTCATCCCAACC-3′5′AGCGTATTGTCATTGCACCTT 3′5′-KKVRVRV(CT)6-3′5′-KKRVRVR(TC)6-3′ | 53℃53℃53℃53℃53℃53℃53℃53℃53℃53℃53℃53℃53℃53℃53℃53℃53℃53℃53℃53℃53℃57℃57℃55℃53℃55℃55℃55℃55℃55℃45℃45℃45℃55℃53℃53℃53℃55℃55℃55℃55℃55℃55℃55℃55℃53℃ | 312222641311321222231212121221112222222211121222 | 129～155250166～184320～370150～200110～11468～150120～17011880～120375113303～40060～8291133，39150～20074～106100～150175～220163100～150183240～275150175～200140190～210125～13090101106151～160100～12555～75133～150118～135130～14097～101151～155139160147198～2009886～10057～6559～115 |
| Lit49Lit50Lit51 | S32S32S33 | (CT)16(CT)16(TC)7T | 5′CGGTGCATAAAATCGAAGGAT 3′5′CGGTGCATAAAATCGAAGGAT 3′5′CCCGAATACAAAACGArGCGAT 3′ | 53℃53℃53℃ | 111 | 24069172 |
(4)、应用荔枝特异性的SSR标记对37个荔枝种质和2个龙眼种质进行遗传多样性分析。首先用改良的CTAB法提取所有供试材料的基因组DNA，，然后用筛选出来的荔枝特异性SSR引物对基因组DNA进行扩增。采用以下反应程序：94℃1分l5秒、各引物最适宜的退火温度1分15秒，72℃45秒，35次循环，反应体系总体积为20微升。PCR产物经5％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、银染显色。
(5)、数据分析用17个荔枝特异性SSR引物对基因组DNA进行扩增，选取清晰、明显、可重复的强扩增带用于二维数据统计，强带记为“1”，无带或弱带记为“0”。共涉及18个SSR位点，检测到46个等位基因的变异和4个非等位基因的变异(与龙眼有关)。根据SSR分析结果应用MVSP 3.13f软件计算37个荔枝栽培品种和2个龙眼主栽品种的遗传相似系数(GS)，获得遗传相似性矩阵其范围在0～1之间，平均0.567。无核荔枝与A13号之间的遗传相似系数为0.762，大于无核荔枝与两个黑叶实生苗之间的相似性(与黑叶尖是0.714，与黑叶圆是0.6)。
(6)、根据数据分析结果，选出亲缘关系近的荔枝种质A13号作砧木、无核荔枝作接穗进行芽接。每年6月中旬采集A13号种子，用水浸泡一天一夜当胚根突破种皮时，播于苗床，苗床要遮荫，第二年6月便可作砧木进行嫁接。
Claims (2)
1.无核荔枝嫁接砧木选择新技术，其特征在于：应用荔枝特异SSR分子标记分析荔枝种质获得一个嫁接效果好的无核荔枝砧穗组合；荔枝特异SSR分子标记采用以下技术步骤获得：
一)、任用一种荔枝品种为材料，采用选择性扩增微卫星(Selectively AmplifiedMicrosatellite，简称SAM)法结合数据库搜索法分离简单序列重复(SimpleSequence Repeat，简称SSR)序列；
二)、用SSR的侧翼序列设计SSR引物：采用Primer Premier 5.0软件设计特异引物；引物设计参数为：引物长度(18-24nt)、3’端稳定性(-5.5～-9.0kcal/mol)、引物Tm值(53-60℃)、GC含量(45～55％)、引物rating值＞90；
三)、筛选有用引物，获得荔枝特异性的简单序列重复(SSR)标记。采用与步骤1相同的荔枝品种作材料，以其基因组DNA为模板，更换不同的简单序列重复(SSR)引物进行扩增；采用以下反应程序：94℃1分15秒、(57℃或55℃、53℃、51℃、45℃)不同的退火温度1分15秒、72℃45秒，35次循环，反应体系20微升；PCR产物经5％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、银染显色，选出有强扩增带的引物便是有用引物；其对应的扩增带便是荔枝特异性的简单序列重复(SSR)标记。同时选出每对引物最适宜的退火温度；核酸引物序列见表1：
表1 荔枝特异性SSR标记(基因座)及其引物表
基因座名称
引物对名称
重复类型
左引物序列
右引物序列
退火温度
等位基因数
片段大小(bp)
Lit1Lit2Lit3Lit4Lit5Lit6Lit7Lit8Lit9Lit10Lit11Lit12Lit13
Spe3spe5Spe9Spe12Spe14Spe16Spe17Spe18Spe22Spe26Spe28Spe30Spe33
(CT)6(CT/TC)6(CT)6(CT)6(TC/CT)6(CT)8(CT/TC)9(CT)6(CT)11(TC)6(CT)6(TC)6(CT/TC)6
5′TCGGCGACGAATGAAAG 3′5′GCGTTACTCGTCGGTCGT 3′5′CGGGCTTGTCTATTGACGCTG 3′5′CGTTGCGGTTGGACAGGT 3′5′CCCAGGCACGAACCAAAT 3′5′CGGAATCATCGGCTCACAA 3′5′CGCAACTTGAACCGTCCGT 3′5′GCTCGGAAACTAAGCAAAGG 3′5′GGCATAAAATCGAAGGATCAG 3′5′GGTCGGCATCTACACTTCAG 3′5′AACCGAGTCAACCCAACG 3′5′CCGTCATTGGCTACACTCAT 3′5′GGCAATACCAGCAGCATAAAG 3′ 5′-KKVRVRV(CT)6-3′5′-KKRVRVR(TC)6-3′
53℃53℃53℃53℃53℃53℃53℃53℃53℃53℃53℃53℃53℃
3122226413113
129～155250166～184320～370150～200110～11468～150120～17011880～120375113303～400
Lit14Lit15Lit16Lit17Lit18Lit19Lit20Lit21Lit22Lit23Lit24Lit25Lit26Lit27Lit28Lit29Lit30Lit31Lit32Lit33Lit34Lit35Lit36Lit37Lit38Lit39Lit40Lit41Lit42Lit43Lit44Lit45Lit46Lit47Lit48Lit49Lit50Lit51
Spe36Spe38Spe39Spe41Spe37Spe40Spe32spe5Spe24-25Spe20-21S3S3S10S11S12S12S12S13S14S16S16S16S17S18S19S19S20S21S22S23S27S27S29S30S31S32S32S33
(CT)13(TC)6(CT)7(CT)6(CT)6(CT/TC)6(TC)6(CT/TC)6(GT)4GC(TG)4(TCTCT)3…(TC/CT)5(TCTCT)3(TC)6(TC)6(CT)18(TC)6(TC)6(TC)6(TC)6(CT)6(CT)6(GA)6G(GA)6G(GA)6G(GA)6G(AAC)4…(AG)12(AG)6(AG)6(GA)6(TC)7(TC)7(GA)6(TC)7(TC)7(GA)8(TC)7(CT)6(ATCC)3(CT)16(CT)16(TC)7T
5′GGAGGTAGTGAAAACCAGGA3′5′GGCTACTTGGGCTAAGATTGT3′5′CGTGACCGTTTTCTTTGAGG3′5′GGCAACTAAACGGCAAAAT3′5′GCGTAACTGCTGTCATAACCTG3′5′GTGGTTCCAAGCGATGAT3′5′CGGTATATTGGGTGCTGCTT3′5′GCGTTACTCGTCGGTCGT3′5′CGAGACCGATAGCGAACAA3′5′CGTTTCATTTCCCCTCTTCAT3′5′AGCGGAGCAGGAGCGGATG3′5′AGCGGAGCAGGAGCGGATG3′5′CGGTGAAAATTCTTTGCTCTG3′5′GGTCGTCGGTCGTCAAGT3′5′GTCGGTGGAGATGTGAAGG3′5′GTCGGTGGAGATGTGAAGG3′5′GTCGGTGGAGATGTGAAGG3′5′CGGAATCCTCTGTTATGTTG3′5′GGAGGGTCCGAATGTTTG3′5′CCGTGTCCAGCACAGTTGAG3′5′CCGTGTCCAGCACAGTTGAG3′5′CCGTGTCCAGCACAGTTGAG3′5′CCAACCAGACCTCGCATAG3′5′GGACTACACTCGACCTGAT3′5′CAAGGACGACGGACGAG3′5′CAAGGACGACGGACGAG3′5′CGGCACAAAGTTCCGTGGT3′5′CGGGAATGCACTACAAAGAT3′5′ACGATGCGATATTGCTTAC3′5′GGCAGCTCCTTGGGTGA3′5′GGCAATATGATGGAGCAAGG3′5′GGCAATATGATGGAGCAAGG3′5′TTGGGTTCCCGCCGATG3′5′GGCAAAAGCAAAGCAATCGT3′5′TGTCCCAGCAATCATCAAAG3′5′CGGTGCATAAAATCGAAGGAT3′5′CGGTGCATAAAATCGAAGGAT3′5′CCCGAATACAAAACGATGCGAT3′ 5′-GGCACCTCATCCCAACC-3′5′AGCGTATTGTCATTGCACCTT3′5′KKVRVRV(CT)6-3′5′KKRVRVR(TC)6-3′
53℃53℃53℃53℃53℃53℃53℃53℃57℃57℃55℃53℃55℃55℃55℃55℃55℃45℃45℃45℃55℃53℃53℃53℃55℃55℃55℃55℃55℃55℃55℃55℃53℃53℃53℃53℃
21222231212121221112222222211121222111
60～8291133，139150～20074～106100～150175～220163100～150183240～275150175～200140190～210125～13090101106151～160100～12555～75133～150118～135130～14097～101151～155139160147198～2009886～10057～6559～11524069172
2.根据权利要求所述的无核荔枝嫁接砧木选择新技术；一个嫁接效果好的无核荔枝砧穗组合，采用以下技术步骤获得：
一)、应用荔枝特异性的简单序列重复(SSR)标记对部分荔枝种质进行遗传多样性分析；首先用改良的CTAB法提取多个荔枝种质的基因组DNA，然后用筛选出来的荔枝特异性的简单序列重复(SSR)引物，对基因组DNA进行PCR扩增。采用以下反应程序：94℃1分15秒、各引物最适宜的退火温度1分15秒，72℃45秒，35次循环，反应体系总体积为20微升；PCR产物经5％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、银染显色；
二)、数据分析：
1)、SSR标记分析及遗传多样性分析选择扩增条带清晰且有多态性的SSR标记进行数据统计，有带记为“1”，无带记为“0”；用MVSP 3.13f软件根据Nei&Li(1979)的方法计算各种质间的相似系数(Genetic Similarity)
2)、聚类分析采用UPGMA(Unweighted pair-group method using anarithmetic average)法，应用MVSP 3.13f软件进行聚类分析；
三)、根据数据分析结果，挑选亲缘关系近的荔枝种质作砧木进行无核荔枝的嫁接繁殖；通过实验验证最后确定无核荔枝与A13号为最优接穗/砧木组合；当A13号荔枝种质的果实成熟以后，采果将种子取出，用水浸泡一天一夜，当胚根突破种皮时，播于苗床，苗床要遮荫，第二年6月便可作砧木进行嫁接。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 200510080811 CN1887048B (zh) | 2005-06-28 | 2005-06-28 | 无核荔枝嫁接砧木选择方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 200510080811 CN1887048B (zh) | 2005-06-28 | 2005-06-28 | 无核荔枝嫁接砧木选择方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1887048A true CN1887048A (zh) | 2007-01-03 |
| CN1887048B CN1887048B (zh) | 2010-11-17 |
Family
ID=37576330
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN 200510080811 Expired - Fee Related CN1887048B (zh) | 2005-06-28 | 2005-06-28 | 无核荔枝嫁接砧木选择方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN1887048B (zh) |
Cited By (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102612888A (zh) * | 2012-03-22 | 2012-08-01 | 宁波市农业科学研究院 | 一套鉴定筛选耐热瓠瓜砧木的方法 |
| CN103563711A (zh) * | 2013-11-06 | 2014-02-12 | 广西大学 | 成龄荔枝树边换品种边结果的培育方法 |
| CN103621321A (zh) * | 2013-12-06 | 2014-03-12 | 黄宗威 | 一种荔枝嫁接方法 |
| CN104025914A (zh) * | 2014-06-27 | 2014-09-10 | 太仓市惠其农机专业合作社 | 一种红毛丹嫁接方法 |
| CN105052566A (zh) * | 2015-08-18 | 2015-11-18 | 大连民族大学 | 一种油茶丰产高接换冠的分子设计方法 |
| CN106854677A (zh) * | 2017-01-19 | 2017-06-16 | 浙江省农业科学院 | 一种基于ssr标记筛选以蜡杨梅为砧木嫁接杨梅接穗的方法 |
| CN106922405A (zh) * | 2017-05-16 | 2017-07-07 | 张阳康 | 一种金丝桃嫁接棠梨树的方法 |
| CN107996168A (zh) * | 2017-12-25 | 2018-05-08 | 大连民族大学 | 一种空心李高接换冠的砧芽配置方法 |
| CN108207366A (zh) * | 2018-02-06 | 2018-06-29 | 信阳师范学院 | 一种茶树品种选育方法 |
| CN112176088A (zh) * | 2020-10-12 | 2021-01-05 | 华南农业大学 | 一种区分荔枝品种的ssr引物组及其应用 |
| CN112425389A (zh) * | 2020-11-23 | 2021-03-02 | 安徽农业大学 | 一种用于辣椒亲缘关系分析的ssr分子标记引物对及其应用 |
| CN116732223A (zh) * | 2023-06-05 | 2023-09-12 | 广东省农业科学院果树研究所 | 一种基于kasp技术开发的荔枝种胚性状snp分子标记及其应用 |
-
2005
- 2005-06-28 CN CN 200510080811 patent/CN1887048B/zh not_active Expired - Fee Related
Cited By (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102612888B (zh) * | 2012-03-22 | 2014-05-14 | 宁波市农业科学研究院 | 一套鉴定筛选耐热瓠瓜砧木的方法 |
| CN102612888A (zh) * | 2012-03-22 | 2012-08-01 | 宁波市农业科学研究院 | 一套鉴定筛选耐热瓠瓜砧木的方法 |
| CN103563711A (zh) * | 2013-11-06 | 2014-02-12 | 广西大学 | 成龄荔枝树边换品种边结果的培育方法 |
| CN103621321A (zh) * | 2013-12-06 | 2014-03-12 | 黄宗威 | 一种荔枝嫁接方法 |
| CN104025914A (zh) * | 2014-06-27 | 2014-09-10 | 太仓市惠其农机专业合作社 | 一种红毛丹嫁接方法 |
| CN105052566A (zh) * | 2015-08-18 | 2015-11-18 | 大连民族大学 | 一种油茶丰产高接换冠的分子设计方法 |
| CN106854677B (zh) * | 2017-01-19 | 2020-08-25 | 浙江省农业科学院 | 一种基于ssr标记筛选以蜡杨梅为砧木嫁接杨梅接穗的方法 |
| CN106854677A (zh) * | 2017-01-19 | 2017-06-16 | 浙江省农业科学院 | 一种基于ssr标记筛选以蜡杨梅为砧木嫁接杨梅接穗的方法 |
| CN106922405A (zh) * | 2017-05-16 | 2017-07-07 | 张阳康 | 一种金丝桃嫁接棠梨树的方法 |
| CN107996168A (zh) * | 2017-12-25 | 2018-05-08 | 大连民族大学 | 一种空心李高接换冠的砧芽配置方法 |
| CN108207366A (zh) * | 2018-02-06 | 2018-06-29 | 信阳师范学院 | 一种茶树品种选育方法 |
| CN112176088A (zh) * | 2020-10-12 | 2021-01-05 | 华南农业大学 | 一种区分荔枝品种的ssr引物组及其应用 |
| CN112176088B (zh) * | 2020-10-12 | 2022-04-15 | 华南农业大学 | 一种区分荔枝品种的ssr引物组及其应用 |
| CN112425389A (zh) * | 2020-11-23 | 2021-03-02 | 安徽农业大学 | 一种用于辣椒亲缘关系分析的ssr分子标记引物对及其应用 |
| CN112425389B (zh) * | 2020-11-23 | 2022-08-19 | 安徽农业大学 | 一种用于辣椒亲缘关系分析的ssr分子标记引物对及其应用 |
| CN116732223A (zh) * | 2023-06-05 | 2023-09-12 | 广东省农业科学院果树研究所 | 一种基于kasp技术开发的荔枝种胚性状snp分子标记及其应用 |
| CN116732223B (zh) * | 2023-06-05 | 2024-02-27 | 广东省农业科学院果树研究所 | 一种基于kasp技术开发的荔枝种胚性状snp分子标记及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1887048B (zh) | 2010-11-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN1887048B (zh) | 无核荔枝嫁接砧木选择方法 | |
| Liu et al. | The historical and current research progress on jujube–a superfruit for the future | |
| Siddiqui et al. | Genotypic variation in tomatoes affecting processing and antioxidant attributes | |
| Rukundo et al. | Storage root formation, dry matter synthesis, accumulation and genetics in sweetpotato | |
| Prakash et al. | Analysis of molecular diversity in guava using RAPD markers | |
| Caliskan et al. | Morpho-pomological and chemical diversity of pomegranate accessions grown in Eastern Mediterranean region of Turkey | |
| Marr et al. | Allozyme, morphological and nutritional analysis bearing on the domestication ofMomordica charantia L.(Cucurbitaceae) | |
| Kumar et al. | Understanding Cuminum cyminum: An important seed spice crop of arid and semi-arid regions | |
| Bhandari et al. | Role of molecular markers to study genetic diversity in Bamboo: A Review | |
| Salimpour et al. | Evaluating the salt tolerance of seven fig cultivars (Ficus carica L.) | |
| Mazri | Cactus pear (Opuntia spp.) breeding | |
| Sau et al. | Recent trends in agro-technology, post-harvest management and molecular characterisation of pomegranate | |
| Soldatenko et al. | Problems of production of competitive vegetable products | |
| Kafadar et al. | Genetic and biochemical properties of Cicer spp reveal distinction between wild and cultivated chickpea genotypes | |
| Singh et al. | Application of plant biotechnology in improvement of vegetable breeding | |
| Looregipoor et al. | Study on Quantitative and Qualitative Traits Diversity in Some Momordica charantia L. Genotypes | |
| Usman et al. | Morpho-chemical diversity and RAPD fingerprinting in white flesh guava cultivars | |
| Kayat et al. | Spring Onion (Allium fistulosum L.) breeding strategies | |
| Mukherjee et al. | The genus Amorphophallus: Cyto-histo-molecular genesis and commercial prospects | |
| Obae et al. | Growth Characteristics and Ginsenosides Production of In Vitro Tissues of American Ginseng, Panax quinquefolius L. | |
| Nair et al. | Garlic: Its importance and biotechnological improvement | |
| Fabroni et al. | Nutritional composition of clementine (citrus x clementina) cultivars | |
| Tsafack et al. | Effect of photoperiod and thermoperiod on microtuberization and carbohydrate levels in Cocoyam (Xanthosoma sagittifolium L. Schott) | |
| Kaushik | Melon Nutraceutomics and Breeding | |
| Punha et al. | Influences of Ammonium Nitrate on Growth and Inulin Content of Jerusalem Artichoke (Helianthus tuberosus L.) in Vitro |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C17 | Cessation of patent right | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20101117 Termination date: 20130628 |