CN103642906B - 辣椒杂交种纯度检测est-ssr分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分子标记领域，具体涉及辣椒杂交种纯度检测EST-SSR分子标记及其应用。本发明开发了辣椒杂交种纯度检测EST-SSR分子标记HE4，应用于‘热辣1号’杂交种纯度检测。

Description

辣椒杂交种纯度检测EST-SSR分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及分子标记领域，具体涉及辣椒杂交种纯度检测EST-SSR分子标记及其应用。

背景技术

辣椒属于茄科辣椒属一年或多年生草本植物。辣椒以其果实特有的辣味、色泽和营养成分成为一种重要的世界性蔬菜作物。大量研究表明辣椒果实中含有的抗氧化类物质可以保护生物有机体免受氧化伤害和提高机体免疫力。另外，辣椒中辣椒素类物质能够加速能量和脂类的新陈代谢及降低癌症细胞的发生率。随着大众对辣椒营养成分和药用成分的充分认识，栽培面积逐年增加。

种子是主要的农业生产资料，种子纯度是种子质量的核心指标，直接影响农产品质量和优良品种的增产潜力，开展作物种子纯度检测对保证种子质量具有重要意义。作物品种纯度鉴定的常用方法主要包括种子形态鉴定、田间种植形态鉴定和同工酶电泳技术鉴定等。种子形态易受环境条件影响，鉴定结果准确性较差；田间种植形态鉴定存在周期较长，成本较高，工作量较大，并且表型易受栽培措施和环境条件的影响，严重影响品种纯度鉴定的效率及准确性，越来越不能满足育种工作和生产经营的需要；利用同工酶技术鉴定作物品种纯度虽然准确、可靠，但同工酶标记具有组织和器官特异性，信息量非常有限，多态性不够丰富。

随着辣椒新品种数量的不断增加，传统的鉴定方法难以有效区分遗传关系较近的杂交种。分子标记技术能够从DNA水平上揭示子代与亲本间的遗传差异，不受环境条件和栽培措施的影响，无组织、器官及发育特异性，能够检测微小的变异，不受植株生长季节的限制，多态性丰富、稳定性高，可以大大缩短鉴定时间。DNA分子标记技术的迅速发展，使得从基因组水平上检测辣椒杂交种纯度成为可能。

‘热辣1号’是中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所经多年研究选育出的微辣丰产青皮尖椒。该杂交组合播种至开花约59天，至大量收获约105天。始收时株高55～60cm，生长势极强，分枝能力强，枝叶茂盛。每亩鲜椒产量4000～5000kg，单果重62.0g左右，果长21.0～26.0cm，果宽3.3～3.7cm，果肉厚0.3～0.4cm，辣度指数4352SHU，红熟果维生素C含量1.62mg g^-1。抗黄瓜花叶病毒病，田间表现耐热、较耐涝，较抗青枯病和枯萎病，耐疫病、炭疽病。本品种适宜的栽培区域为全国各个辣椒主产区，最适宜为两广、海南等不嗜辣地区。

EST-SSR（expressed sequence tag-simple sequence repeat）标记，是根据EST序列中的简单串联重复序列开发的一种标记类型，是一类由几个核苷酸为重复单位组成的串联重复序列，根据串联重复单位数目的差异检测多态性。辣椒EST-SSR标记具有多态性丰富、共显性遗传、稳定性和重复性较好、对DNA质量要求不高、操作简单易行、不受环境因素影响等优点，与基因组SSR标记相比，EST-SSR标记不仅降低了开发成本、提高了开发效率，而且节省了开发时间，显著提高了其利用价值。近年来，随着辣椒基因组工程的发展，辣椒丰富的EST序列资源为EST-SSR标记的开发提供了便利条件。目前辣椒杂交种纯度的EST-SSR鉴定方法尚未见报道。

发明内容

针对传统作物杂交种纯度检验方法易受环境条件和栽培措施的影响，鉴定周期较长，成本较高，鉴定结果准确性较差，费时费力等缺点。

本发明的一个目的，是提供一种辣椒杂交种纯度检测的EST-SSR分子标记，其对应的核苷酸序列如下：

引物名称	正向引物	反向引物
			HE4	5’-AATGGGAAGAGAAATTGTGAAAGCA-3’	5’-TTCAATGCCAACAATGGCATCCTA-3’

所述的EST-SSR分子标记可应用于辣椒杂交种纯度的检测。

利用该分子标记检测‘热辣1号’杂交种纯度的方法，包括如下步骤：

（1）采用改良的CTAB法（AllenGC,Flores-VergaraMA,Krasynanski S,Kumar S,Thompson WF.Amodified protocol for rapidDNA isolation from plant tissues using cetyltrimethylammonium bromide.Nat Protoc,2006,1:2320–2325）提取辣椒叶片基因组DNA，以母本材料04Ca125（母本04Ca125是广西玉林羊角椒在连续病圃条件下，经6代单花自交选育而成的自交系）和父本材料03Ca21（父本03Ca21是1998年从热带蔬菜种质圃内发现的一株天然杂交株后经6代单花自交选育而成的粗牛角椒自交系）基因组DNA为模板，利用开发的辣椒EST-SSR引物进行PCR扩增，筛选在亲本间表现多态性的EST-SSR标记，其中1对EST-SSR引物（HE4）在‘热辣1号’杂交种和亲本间能扩增出明显的多态性，带型为双亲互补带型，可用于‘热辣1号’种子纯度鉴定。

（2）用于鉴定‘热辣1号’（以04Ca125为母本，03Ca21为父本杂交产生的F1代）辣椒杂交种纯度的EST-SSR引物序列包括正向引物序列HE4F：5’-AATGGGAAGAGAAATTGTGAAAGCA-3’，反向引物序列HE4R：5’-TTCAATGCCAACAATGGCATCCTA-3’。

（3）以‘热辣1号’单株DNA为模板加入EST-SSR引物HE4进行PCR扩增，根据特异谱带的扩增结果鉴定‘热辣1号’辣椒杂交种的纯度。

检测‘热辣1号’辣椒杂交种纯度的方法，包括如下步骤：

(1)将‘热辣1号’播种于营养钵中，待植株长至5～6片真叶时利用改良的CTAB法（Allen GC,Flores-Vergara MA,Krasynanski S,Kumar S,Thompson WF.A modified protocol for rapid DNA isolationfrom plant tissues using cetyltrimethylammonium bromide.Nat Protoc,2006,1:2320–2325）提取‘热辣1号’单株叶片的基因组DNA。

(2)PCR扩增反应体系及程序为：PCR反应体系为10μL，其中包括10×PCR Buffer1μL，0.2mM dNTPs，引物（HE4）50ng，0.5U Taq DNA聚合酶，热辣1号基因组DNA20ng，无菌超纯水补齐至10μL。扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min，35个循环；72℃终延伸10min。PCR产物保存于10℃。

(3)扩增产物检测：5μL扩增产物与2μL上样缓冲液混合经12%非变性聚丙烯酰胺凝胶（丙烯酰胺∶甲叉双丙烯酰胺=29∶1）电泳，220v恒定电压电泳4h，银染显色进行带型统计。

(4)根据特异谱带的扩增结果鉴定‘热辣1号’辣椒杂交种的纯度。‘热辣1号’品种纯度（%）=（1-n/N）×100%，其中N为待测‘热辣1号’种子数目，n为单独具有父本谱带特征或单独具有母本谱带特征或既不同于‘热辣1号’谱带特征也不同于父母本谱带特征的植株数目。

传统田间种植形态鉴定所需时间较长，易受环境条件影响，不能完全满足杂交种经营的需要。DNA分子标记技术的发展，为辣椒品种纯度鉴定提供了更为准确、快速的方法。本发明利用在‘热辣1号’亲本材料间表现多态性的EST-SSR标记HE4，以‘热辣1号’单株DNA为模板进行扩增，根据特异谱带的扩增结果检测杂交种的纯度。共显性的EST-SSR标记HE4扩增出的特异谱带能够将杂交种与母本自交种、父本自交种区分开来；具有双亲特异谱带的植株属于真实的杂交种，缺少父本特异谱带，与母本扩增图谱一致的为母本自交株。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：（1）不受栽培措施和环境条件的影响。（2）无器官、组织及发育特异性：该方法在植株生长的任何时期均可进行鉴定。（3）多态性丰富、共显性遗传：能够将杂交种与母本自交种、父本自交种区分开来。（4）对DNA质量要求不高且需要量少。（5）成本较低、操作简单：该方法在苗期即可进行鉴定，节省大量人力、物力和土地资源。（6）重复性和稳定性较好。（7）快速高效：6h之内即可完成种子纯度鉴定工作。（8）准确性高：该方法从基因组水平上揭示子代与亲本间的遗传差异，克服了田间表型鉴定带来的误差。（9）应用推广前景广阔：可以快速、准确检测‘热辣1号’杂交种纯度，为开展辣椒制种和良种的及时销售提供科学依据，有广阔的应用前景。

附图说明

图1：EST-SSR标记HE4在亲本材料及部分‘热辣1号’单株中的扩增结果。其中M代表DL1000DNA Marker，1为‘热辣1号’母本材料04Ca125，2为‘热辣1号’父本材料03Ca21，3-24为：‘热辣1号’单株。检测结果表明，22号为母本自交株。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明做进一步详细说明：

以下如无特殊说明，本发明所述设备及材料均为市售设备及材料。

本发明所需主要仪器设备为：高速冷冻离心机，水浴锅，PCR仪，电泳仪，垂直电泳槽。

本发明所需主要试剂为：苯酚、氯仿、异戊醇、无水乙醇、CTAB、PCR Buffer、dNTP、Taq DNA聚合酶、超纯水、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、TEMED、过硫酸铵、甲酰胺、溴酚蓝、二甲苯腈、EDTA、Tris、硼酸、硝酸银、甲醛、氢氧化钠、无水碳酸钠。

实施例1：

(1)将186粒‘热辣1号’种子播种于营养钵中，待植株长至5～6片真叶时利用改良的CTAB法（Allen GC,Flores-Vergara MA,Krasynanski S,Kumar S,Thompson WF.A modified protocol for rapidDNA isolation from plant tissues using cetyltrimethylammonium bromide.Nat Protoc,2006,1:2320–2325）提取单株叶片的基因组DNA。

(2)PCR扩增反应体系及程序为：PCR反应体系为10μL，其中包括10×PCR Buffer1μL，0.2mM dNTPs，引物（HE4）50ng，0.5U Taq DNA聚合酶，‘热辣1号’基因组DNA20ng，无菌超纯水补齐至10μL。扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min，35个循环；72℃终延伸10min。PCR产物保存于10℃。

(3)扩增产物检测：5μL扩增产物与2μL上样缓冲液混合经12%非变性聚丙烯酰胺凝胶（丙烯酰胺∶甲叉双丙烯酰胺=29∶1）电泳，220v恒定电压电泳4h，银染显色进行带型统计。

(4)根据特异谱带的扩增结果鉴定‘热辣1号’辣椒杂交种的纯度。其中，185个‘热辣1号’单株既具有母本特异谱带也具有父本特异谱带，属于真实的杂交种，22号单株缺少父本特异带，与母本带型一致（附图1），说明22号单株为母本自交株，‘热辣1号’辣椒杂交种的纯度为99.46%。

(5)鉴定效果检验

将取材后的‘热辣1号’幼苗按照顺序移栽到地势平坦、土质肥沃的田块，采用常规栽培措施进行管理，在成株期依据品种的特征特性逐株进行鉴定，其中，22号植株与母本性状一样，果形为细羊角椒，果色浅绿色，其余植株均具有‘热辣1号’辣椒品种的典型特征，生长一致，叶片较母本材料大些，果形为粗牛角椒，果色深绿色。田间种植形态学鉴定结果与EST-SSR标记HE4检测结果一致，该结果说明EST-SSR标记HE4可以快速、准确地鉴定‘热辣1号’辣椒杂交种纯度。

其中，（1）中采用改良的CTAB法提取辣椒叶片的基因组DNA具体步骤如下：

配制CTAB提取液（0.1mol L^-1Tris pH7.5，0.05mol L^-1EDTApH8.0，0.7mol L^-1NaCl，2%CTAB），高温灭菌后，添加2%巯基乙醇，65℃预热；

利用液氮将辣椒叶片研磨成粉末装入2.0mL离心管中，样品达到1/3处为宜，每管加入预热的CTAB提取液700μL置于65℃恒温水浴箱中45min（每隔8min轻轻摇动一次）；

加入苯酚/氯仿/异戊醇（苯酚：氯仿：异戊醇=25:24:1）700μL充分混匀16min，动作缓慢，4℃12000rpm离心6min；

吸取上清液转入1.5mL离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇（氯仿：异戊醇=24:1）充分混匀16min，动作缓慢，4℃12000rpm离心6min；

吸取上清液转入1.5mL离心管中，加入2倍体积预冷的无水乙醇，轻轻混匀，置-20℃冰箱沉淀15min；

将絮状DNA沉淀置于1.5mL离心管中，采用70%乙醇漂洗两遍，晾干；

加入120μL灭菌超纯水，4℃冰箱溶解，溶解后母液贮于-20℃冰箱备用。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。

Claims (2)

1.辣椒杂交种纯度检测EST-SSR分子标记，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如下：

HE4：

正向引物：5’-AATGGGAAGAGAAATTGTGAAAGCA-3’，

反向引物：5’-TTCAATGCCAACAATGGCATCCTA-3’。

2.权利要求1所述分子标记在‘热辣1号’杂交种纯度检测中的应用。