CN108707645B - 一种西瓜品种苏蜜9号种子纯度的鉴定方法 - Google Patents

一种西瓜品种苏蜜9号种子纯度的鉴定方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种西瓜品种苏蜜9号种子纯度的鉴定方法，首先提取西瓜组织的DNA，设计RAPD引物JAASRP1093，以苏蜜9号的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，最后对电泳结果进行分析，以父母本样品DNA的特异标记作为对照，只有同时具有亲本特异标记的单株才可确定为苏蜜9号杂交种。本发明人通过分子标记的筛选，鉴定出1个具有共显性标记的RAPD引物JAASRP1093。这个RAPD标记在多次重复中表现稳定，可用于西瓜杂交种种子的纯度鉴定，利于西瓜商品种子高效准确的质量控制。本发明的鉴定方法成本低、标记稳定、准确性高，不受被测样品环境的影响，且在整个生长季节都可检测。

Description

一种西瓜品种苏蜜9号种子纯度的鉴定方法
技术领域
本发明涉及一种西瓜种子纯度的鉴定方法，尤其是一种利用RAPD分子标记技术进行西瓜品种苏蜜9号种子纯度的鉴定方法，属于作物育种技术领域。
背景技术
西瓜是一种重要的经济作物，由于其外形美观、味甜多汁，深受消费者的喜爱。我国是西瓜生产大国。据统计，2013年，我国大约184万公顷的栽培面积生产了731.9万吨的西瓜产量，占全球西瓜栽培面积的52％及全球总产量的67％。在西瓜杂种制种过程中，母本系自交的种子常混杂于F1中，严重影响种子的质量和纯度，给生产造成巨大的经济损失。因此，优良F1代杂种的遗传纯度快速、准确鉴定成为在西瓜生产中最为迫切需要解决的问题之一。
西瓜杂交种子纯度的传统检测方法目前主要有田间形态学鉴定和同工酶鉴定。但在整个生长期假杂种与真杂种之间田间形态的差异不是很明显，需到成熟期对果实进行鉴定才比较准确，耗时长、工作量大，受季节影响，费用昂贵。而同工酶分析易受到环境和所取材料部位的影响，费时费力，准确度不高。
西瓜品种‘苏蜜9号’是江苏省农科院蔬菜研究所以自交系SW082-1-1为母本，以自交系SW069-2-1为父本配制而成的小果型西瓜一代杂种。早熟，耐低温弱光，果实椭圆形，瓤红色，果皮底色浅绿色，覆深绿色窄条纹，果皮厚约0.5cm，中心可溶性固形物含量12.0％～13.2％，质地脆沙，汁液多，纤维少，风味佳，适宜长江中下游地区春季大棚栽培。为保证优良品种产生最大的经济效益，需要一种快速、准确、稳定的检测方法进行西瓜品种‘苏蜜9号’的鉴定。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中西瓜品种杂交种子纯度鉴定方法存在耗时长、费用高、不够准确等缺陷，提供一种西瓜品种苏蜜9号种子纯度的鉴定方法，该鉴定方法能够对西瓜品种苏蜜9号种子的纯度进行简便快速、准确可靠、低成本地检测。
技术方案
一种西瓜品种苏蜜9号种子纯度的鉴定方法，包括如下步骤：
(1)提取西瓜品种苏蜜9号的基因组DNA；
(2)设计RAPD引物JAASRP1093，以西瓜品种苏蜜9号的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得到扩增产物；
所述RAPD引物JAASRP1093的核苷酸序列为5'-CCCGATTCGG-3'；
(3)将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；
(4)对电泳结果进行分析，以父母本样品DNA的特异标记作为对照，只有同时具有亲本特异标记的单株才可确定为苏蜜9号杂交种，否则为杂种。
步骤(4)中，RAPD引物JAASRP1093产生大小为260bp的母本特异标记JAASRP1093260，产生大小分别为625bp和1500bp的父本特异标记JAASRP1093625、JAASRP10931500，只有同时具有亲本特异条带的单株才为真正的苏蜜9号杂交种。
进一步，步骤(1)中，基因组DNA的提取方法为：在西瓜品种苏蜜9号两叶一心时取幼嫩叶片1～3g，经液氮研磨，用CTAB裂解液转入1.5ml离心管中，65℃水浴0.5～1h后取出冷却，加入等体积的体积比为24:1的氯仿与异戊醇的混合物，轻轻摇晃20～30min后,12000r/min离心8～10min,取上清液用体积比为24:1的氯仿与异戊醇的混合物抽提1～2次，加入10％醋酸钠和预冷的异丙醇，4℃冰箱静置3h以上，收集絮状DNA，用70％乙醇洗涤后干燥，溶于TE(1mL 1mol/L Tris·Hcl(PH8.0),0.2mL 0.5mol/L EDTA(PH8.0),加ddH2O定容至100mL)中，4℃保存备用。
进一步，步骤(2)中，PCR扩增的反应体系为18ul，其中含：20ng基因组DNA,2.0mmol·L-1MgCl2，0.15mmol·L-1dNTPs，0.44umol·L-1 10RAPD引物JAASRP1093，0.75UTaq DNA聚合酶。
进一步，步骤(2)中，PCR扩增的反应程序为：94℃2min，94℃30s，37℃45s，72℃90s，40个循环，72℃10min延伸。
进一步，步骤(3)中，琼脂糖凝胶电泳检测的电压为120V，电泳时间为0.5-1h。
有益效果：本发明通过鉴别西瓜品种‘苏蜜9号’单株中父母本特异条带的有无，计算出种子遗传纯度。用于提高西瓜种子的质量检测进程，专用于西瓜商品种子遗传纯度的检测。本发明的检测方法，具有准确性高，不受被测样品环境的影响，成本低，且可在整个生长季节都可检测等优点。
附图说明
图1是西瓜品种苏蜜9号及其亲本的DNA片段的RAPD电泳图谱；
1：母本；2：父本；3：杂种；M是用于纠正实验偏差的标准分子量。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
一种西瓜品种苏蜜9号种子纯度的鉴定方法，包括如下步骤：
(1)提取西瓜品种苏蜜9号的基因组DNA；
基因组DNA的提取方法为：在西瓜品种苏蜜9号两叶一心时取幼嫩叶片2g，经液氮研磨，用CTAB裂解液转入1.5ml离心管中，65℃水浴0.5～1h后取出冷却，加入等体积的体积比为24:1的氯仿与异戊醇的混合物，轻轻摇晃30min后,12000r/min离心8～10min,取上清液用体积比为24:1的氯仿与异戊醇的混合物抽提1～2次，加入10％醋酸钠和预冷的异丙醇，4℃冰箱静置3h以上，收集絮状DNA，用70％乙醇洗涤后干燥，溶于TE中，4℃保存备用。利用紫外/可见光光度计进行DNA纯度分析和定量检测。
(2)设计RAPD引物JAASRP1093，其由擎科生物科技有限公司合成，以西瓜品种苏蜜9号的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得到扩增产物；
在美国ABI 2720热循环仪上进行PCR扩增；所述RAPD引物JAASRP1093的核苷酸序列为：5'-CCCGATTCGG-3'；
PCR扩增反应体系为18ul，其中含：20ng基因组DNA,2.0mmol·L-1MgCl2，0.15mmol·L-1dNTPs，0.44umol·L-1 10引物，0.75U Taq DNA聚合酶(TAKARA)。PCR扩增反应程序为：94℃2min，94℃30s，37℃45s，72℃90s，40个循环，72℃10min延伸，后于4℃保存。
(3)将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；
根据DNA定量检测的结果，用H2O稀释PCR扩增产物至200ng/ul备用。TAE电泳缓冲液：50X TAE电泳缓冲液：12.2g Tris,2.85ml冰醋酸，10ml 0.25mol/L EDTA(PH8.0),加水至50ml。
以电泳缓冲液为溶剂，称取1g琼脂糖，加50X TAE电泳缓冲液2ml和98ml蒸馏水，在微波炉上溶解，配成1％的琼脂糖凝胶100ml。稍冷后，加入0.5ug/ml GoldView,混匀；安装好电泳槽和样品梳，灌胶；胶冷却后，在电泳槽内倒入1X TAE电泳缓冲液。连接电极，在120V恒压条件进行电泳，电泳时间为0.5～1h，以扩增的DNA条带充分展开为止。
紫外检测仪上观察并拍照，结果见图1，图1是西瓜品种苏蜜9号及其亲本的DNA片段的RAPD电泳图谱，其中，1：母本；2：父本；3：杂种；M是用于纠正实验偏差的标准分子量。
(4)对电泳结果进行分析，以父母本样品DNA的特异标记作为对照，只有同时具有亲本特异标记的单株才可确定为苏蜜9号杂交种，否则为杂种。

Claims (5)

1.一种西瓜品种苏蜜9号种子纯度的鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）提取西瓜品种苏蜜9号的基因组DNA；
（2）设计RAPD 引物JAASRP1093，以西瓜品种苏蜜9号的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得到扩增产物；
所述RAPD 引物JAASRP1093的核苷酸序列为5'-CCCGATTCGG-3'；
（3）将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；
（4）对电泳结果进行分析，以父母本样品DNA的特异标记作为对照，只有同时具有亲本特异标记的单株才可确定为苏蜜9号杂交种，否则为杂种；
步骤（4）中，所述亲本特异标记是指大小为260 bp的母本特异标记JAASRP1093260，以及大小分别为625 bp和1500 bp的父本特异标记JAASRP1093625、JAASRP10931500。
2.如权利要求1所述西瓜品种苏蜜9号种子纯度的鉴定方法，其特征在于，步骤（1）中，基因组DNA的提取方法为：在西瓜品种苏蜜9号两叶一心时取幼嫩叶片1~3g，经液氮研磨，用CTAB裂解液转入1.5ml离心管中，65℃水浴0.5～1h后取出冷却，加入等体积的体积比为24:1的氯仿与异戊醇的混合物，轻轻摇晃20～30min后,12000r/min离心8～10min,取上清液用体积比为24:1的氯仿与异戊醇的混合物抽提1～2次，加入10%醋酸钠和预冷的异丙醇，4℃冰箱静置3h以上，收集絮状DNA，用70% 乙醇洗涤后干燥，溶于TE 中，4℃保存备用。
3.如权利要求1所述西瓜品种苏蜜9号种子纯度的鉴定方法，其特征在于，步骤（2）中，PCR扩增的反应体系为18ul，其中含：20ng基因组DNA, 2.0mmol·L-1 MgCl2，0.15 mmol·L- 1dNTPs，0.44umol·L-1 10 RAPD 引物JAASRP1093，0.75U Taq DNA聚合酶。
4.如权利要求1所述西瓜品种苏蜜9号种子纯度的鉴定方法，其特征在于，步骤（2）中，PCR扩增的反应程序为：94℃2min，94℃30s，37℃45s，72℃90s，40个循环，72℃10min延伸。
5.如权利要求1至4任一项所述西瓜品种苏蜜9号种子纯度的鉴定方法，其特征在于，步骤（3）中，琼脂糖凝胶电泳检测的电压为120V，电泳时间为0.5-1h。
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利用RAPD和ISSR 2种分子标记鉴定西瓜杂交种的遗传纯度;羊杏平等;《江苏农业学报》;20101231;第26卷(第06期);第1313-1318页 *
利用RAPD和ISSR分子标记对西瓜作图亲本的多态性分析;羊杏平等;《江苏农业学报》;20091231;第25卷(第05期);第1100-1107页 *

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