CN113481320A - 与梨果皮红色性状连锁的位点、分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及与梨果皮红色性状连锁的位点、分子标记及其应用。位点的核苷酸序列包括位于‘中矮1号’梨参考基因组的Chr5的26306039碱基处的位点的核苷酸序列，参考基因组的GeneBank登录号：SMOL00000000。该处的碱基序列为T或TAACAAATTTTACTACCAAAGGATTCCATTTTAGC。上述位点及基于上述位点开发的分子标记可以用于梨果皮红色/绿色性状辅助选择育种中，在杂交苗的幼苗期快速淘汰绿果皮单株，节省后续杂交苗维护和鉴定评价成本，显著提高红皮梨育种效率。

Description

与梨果皮红色性状连锁的位点、分子标记及其应用

技术领域

本发明属于梨分子遗传育种领域，尤其涉及与梨果皮红色性状连锁的位点、分子标记及其应用。

背景技术

梨(PyrusL.)是一种重要的蔷薇科(Rosaceae)果树，为我国三大水果之一，据联合国粮农组织统计数据库(FAOSTAT)数据显示，2019年我国梨栽培面积为95万公顷，产量1700万吨，分别占世界总产量和面积的69％和71％，在果树产业中居重要地位。近年来，红梨因其诱人的外观和丰富的营养价值，越来越受消费者青睐。然而，在实际生产中，能够在我国栽培的红梨品种不多，尤其是我国主栽的梨品种为东方梨，缺少品质优良、着色稳定的红色品种，因此，红皮梨一直以来都是我国乃至全世界梨育种工作者的重要育种目标。

目前，杂交育种是梨育种中最常用的育种方式。由于梨为多年生果树，性状遗传机制复杂，杂交后代的优选率低，实生苗通常还需要渡过3～5年甚至更长时间的童期才能开花结果，育种过程中需要大量的土地和人力、物力成本，育种成本高。

分子标记辅助选择育种技术应用于梨育种的重要前提是开发与梨重要性状紧密连锁的分子标记。果皮红色作为梨果实重要的外观品质性状，也有相关分子标记的开发与应用，但该性状遗传机制复杂，不同红梨品种红色性状的形成机制不同，需要开发更为广泛有效的标记位点，以应用于梨育种工作，并且现有的分子标记存在准确率低的问题。同时，前人开发的标记多需要采用荧光定量PCR或普通PRC加聚丙烯酰胺凝胶电泳的方式才能区分不同供试样品的表型，分别具有成本高和实验程序繁琐等缺点。因此，开发能够用普通PCR加琼脂糖凝胶电泳即能成功区分不同样品表型的分子标记，则能极大地降低实验成本并提高育种效率。

发明内容

鉴于现有技术所存在的问题，本发明提供与梨果皮红色性状连锁的位点、分子标记及其应用，上述位点、分子标记可以用于梨果皮红色/绿色性状辅助选择育种中，在杂交苗的幼苗期快速淘汰绿果皮单株，节省后续杂交苗维护和鉴定评价成本，显著提高红皮梨育种效率和准确率。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

与梨果皮红色性状连锁的位点，位点的核苷酸序列包括位于‘中矮1号’梨参考基因组的Chr5的26306039碱基处的位点的核苷酸序列，参考基因组的GeneBank登录号：SMOL00000000。

本发明的有益效果：采用上述标记可以用于梨果皮红色/绿色性状辅助选择育种中，在杂交苗的幼苗期快速淘汰绿果皮单株，节省后续杂交苗维护和鉴定评价成本，显著提高红皮梨育种效率，具有准确率高等优点。

进一步，碱基处的碱基序列为T或TAACAAATTTTACTACCAAAGGATTCCATTTTAGC。

本发明提供上述位点在梨果皮红色/绿色性状辅助选择育种中的应用。

本发明的有益效果：基于上述位点，可以开发标记引物等，可以用于梨果皮红色/绿色性状辅助选择育种中，在杂交苗的幼苗期快速淘汰绿果皮单株，节省后续杂交苗维护和鉴定评价成本，显著提高红皮梨育种效率，具有准确率高等优点。

本发明提供一种与梨果皮红色性状连锁的分子标记，上述位点位于分子标记扩增产物的内部。

进一步，分子标记的上游引物序列包括SEQ ID NO:1所示的序列，分子标记的下游引物序列包括SEQ ID NO:2所示的序列。

优选地，分子标记的上游引物序列为SEQ ID NO:1所示的序列，分子标记的下游引物序列为SEQ ID NO:2所示的序列。

本发明还提供上述的分子标记在梨果皮红色/绿色性状辅助选择育种中的应用。

本发明提供一种用于扩增上述分子标记的引物。

进一步，引物包括：SEQ ID NO:1所示的序列和/或SEQ ID NO:2所示的序列。优选地，上游引物为SEQ ID NO:1所示的序列，下游引物为SEQ ID NO:2所示的序列。

采用上述技术方案的有益效果：采用上述引物可以实现梨果皮红色/绿色性状辅助选择育种，在杂交苗的幼苗期快速淘汰绿果皮单株，节省后续杂交苗维护和鉴定评价成本，显著提高红皮梨育种效率，具有准确率高等优点。

本发明提供上述的引物在梨果皮红色/绿色性状辅助选择育种中的应用。

本发明提供一种梨果皮颜色辅助选择育种试剂盒，包括上述引物。

采用上述技术方案的有益效果：采用上述试剂盒可以实现梨果皮红色/绿色性状辅助选择育种，在杂交苗的幼苗期快速淘汰绿果皮单株，节省后续杂交苗维护和鉴定评价成本，显著提高红皮梨育种效率，具有准确率高等优点。

进一步，所述试剂盒还包括：PCR扩增用酶、去离子水、阳性对照、阴性对照中的一种或几种的组合。

本发明提供上述的试剂盒在梨果皮红色/绿色性状辅助选择育种中的应用。

本发明提供一种在梨果皮红色/绿色性状辅助选择育种的方法，包括以下步骤：提取待选择育种的杂交苗的DNA，采用上述引物进行PCR扩增。

进一步，包括以下步骤：提取待选择育种的杂交苗的DNA，采用引物对进行PCR扩增，引物对包括SEQ ID NO:1所示的序列和SEQ ID NO:2所示的序列。

采用上述技术方案的有益效果：采用PCR扩增结合琼脂糖电泳的方法，实验操作简单，不需要复杂昂贵的仪器就可以成功区分不同样品表型，极大地降低实验成本并提高育种效率。采用上述的引物具有准确率高的优点，可以实现梨果皮红色/绿色性状辅助选择育种，在杂交苗的幼苗期快速淘汰绿果皮单株，节省后续杂交苗维护和鉴定评价成本，显著提高红皮梨育种效率。

进一步，PCR扩增的反应条件包括：94℃3min；95℃10s，56℃30s，72℃30s，35个循环；72℃5min。

采用上述技术方案的有益效果：采用上述的扩增的条件有利于获得清晰明确的带形，有利于对结果的分析判断。

进一步，所述杂交苗为‘苹果梨’ב八月红’杂交苗。

采取上述技术方案的有益效果：‘八月红’是以‘早巴梨’ב早酥’杂交选育而成的一个早熟脆肉红色梨新品种，其果实风味酸甜适口，果皮很容易着大面积红色而深受消费者和育种者喜爱，是培育红皮梨新品种的绝佳亲本之一。

附图说明

图1为复合区间作图法果皮红色性状在基因组中的定位情况，纵坐标代表LOD值，横坐标代表作图Block在染色体上的分布，灰色横线代表用PT检验1000次，0.99置信度对应的LOD阈值(7.916)。

图2为B717-In1SCAR标记在红皮梨和绿皮梨中的带形图，1为绿皮梨带型，2为红皮梨带型，M为Marker。

图3为B717-In1SCAR标记在‘苹果梨’ב八月红’杂交组合150株子代中的扩增结果图；M为Marker。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

本发明提供与梨果皮红色性状连锁的InDel位点及基于该位点的分子标记及其应用。

本发明提供的与梨果皮红色性状连锁的InDel位点，位于‘中矮1号’梨参考基因组(GeneBank登录号：SMOL00000000)的Chr5的26306039碱基处，该处的碱基序列为T，变异序列如SEQ ID NO:3所示，为5'-TAACAAATTTTACTACCAAAGGATTCCATTTTAGC-3'。

该变异位点的变异幅度比较大，相差34bp，这就使扩增片段通过很简单的琼脂糖电泳就能轻松分辨。位点位于红皮性状染色体定位结果中LOD峰值附近区域(如图1所示)，获得的与红色性状紧密连锁的区域，越接近峰值的区域说明连锁关系越可靠，选用的标记也越准确。

本发明提供基于上述InDel位点开发的SCAR分子标记，记为B717-In1，所述InDel位点位于SCAR分子标记扩增产物的内部。

本发明所述B717-In1SCAR分子标记在梨果皮红色性状辅助选择育种中的应用。采用上述标记扩增到的2个片段长度差距比较大，区分容易。

本发明所述B717-In1SCAR分子标记的引物对为：

上游引物(正向引物)序列：5'-AAGCAGCAAAAACTGAGTCACT-3'，如SEQ ID NO:1所示；

下游引物(反向引物)序列：5'-TGCCTTTACAGTCCCATTTG-3'，如SEQ ID NO:2所示。

所述引物对在梨果皮红色性状育种中的应用。采用上述标记扩增到的2个片段长度差距比较大，区分容易。

本发明对‘苹果梨’ב八月红’杂交组合群体用以上分子标记进行鉴定，SCAR标记能够对供试群体中果皮红色的单株进行选择，选择效率为100％，可以应用于红皮梨育种的早期选择，能够显著提高红皮梨育种的效率，应用前景良好。

下面通过具体实施例进行进一步介绍。

实施例1

1.采集‘苹果梨’ב八月红’杂交组合150个单株新梢幼叶，分别提取DNA。

2.用B717-In1分子标记的引物对对提取的DNA进行PCR扩增，PCR扩增采用20μL反应体系，反应体系成分组成和PCR反应程序如表1和表2所示，扩增分子标记的引物对如表3所示。其中，2×TaqPCRMix(含染料)来源于北京天恩泽基因科技有限公司生产的即用型PCR试剂盒3.0(CAT#:90805-10)，引物序列由中美泰和生物技术(北京)有限公司合成。

表1 PCR反应体系

表2 PCR反应程序

表3 SCAR标记引物序列

3.对PCR产物进行3％琼脂糖凝胶电泳，并对电泳结果进行条带统计，红皮和绿皮单株的带型如图2所示，如果带形为138bp和172bp双条带表明为红皮单株；如果带形为138bp单带表明为绿皮单株。

4.选取供试杂交组合150个已结果单株，根据果皮颜色情况，红色表型为87株，绿色表型为63株。

采用上述方法以引物对供试杂交组合150个已结果单株的DNA分别进行扩增，电泳结果如图3所示，按照从左至右、从上至下的顺序分别为1-150号样品，根据电泳结果汇总的采用B717-In1标记的引物序列扩增的具体结果如表4所示。

表4

根据PCR扩增结果红皮单株有90个(其中，根据果皮颜色情况，3株为绿色表型，87株为红色表型)，显示为红皮单株的PCR扩增结果其中96.67％(87/90)与红色表型一致；根据PCR扩增结果绿色单株有60个(根据果皮颜色情况，全部为绿色表型)。从图3和表4可以看出，果皮颜色为红色的87株组合的单株扩增结果的带形均为红色表型，表明利用该标记能将该组合100％的红色表型鉴定出来。

利用上述步骤可以在杂交苗的幼苗期快速淘汰绿果皮单株，节省后续杂交苗维护和鉴定评价成本，显著提高红皮梨育种效率。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国农业科学院果树研究所

<120> 与梨果皮红色性状连锁的位点、分子标记及其应用

<130> HF21A1063

<141> 2021-08-25

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aagcagcaaa aactgagtca ct 22

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgcctttaca gtcccatttg 20

<210> 3

<211> 35

<212> DNA

<213> 梨(pear)

<400> 3

taacaaattt tactaccaaa ggattccatt ttagc 35

Claims (10)

1.与梨果皮红色性状连锁的位点，其特征在于，位点的核苷酸序列包括位于‘中矮1号’梨参考基因组的Chr5的26306039碱基处的位点的核苷酸序列，参考基因组的GeneBank登录号：SMOL00000000。

2.根据权利要求1所述位点，其特征在于，碱基处的碱基序列为T或TAACAAATTTTACTACCAAAGGATTCCATTTTAGC。

3.一种与梨果皮红色性状连锁的分子标记，其特征在于，权利要求1或2所述位点位于分子标记扩增产物的内部。

4.根据权利要求3所述分子标记，其特征在于，分子标记的上游引物序列包括SEQ IDNO:1所示的序列，分子标记的下游引物序列包括SEQ ID NO:2所示的序列。

5.一种用于扩增权利要求3或4所述分子标记的引物。

6.根据权利要求5所述引物，其特征在于，包括：SEQ ID NO:1所示的序列和/或SEQ IDNO:2所示的序列。

7.一种梨果皮颜色辅助选择育种试剂盒，其特征在于，包括权利要求5或6所述引物。

8.权利要求1或2所述位点在梨果皮红色/绿色性状辅助选择育种中的应用。

9.权利要求3或4所述分子标记、权利要求5或6所述引物和/或权利要求7所述的试剂盒在梨果皮红色/绿色性状辅助选择育种中的应用。

10.一种在梨果皮红色/绿色性状辅助选择育种的方法，其特征在于，包括以下步骤：提取待选择育种的杂交苗的DNA，采用权利要求5或6所述引物进行PCR扩增。

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