CN115820913B - 一种梨果皮红色/绿色性状辅助选择育种的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种梨果皮红色/绿色性状辅助选择育种的方法，包括以下步骤：提取待选择育种的杂交苗或梨品种的DNA，采用引物进行PCR扩增；所述引物用于扩增与梨果皮红色性状连锁的分子标记；与梨果皮红色性状连锁的位点位于分子标记扩增产物的内部；位点的核苷酸序列包括位于‘中矮1号’梨参考基因组的Chr5的26527817碱基处的位点的核苷酸序列，参考基因组的GeneBank登录号：SMOL00000000。采用上述方法可以在杂交苗的幼苗期快速淘汰绿果皮单株，节省后续杂交苗维护和鉴定评价成本，显著提高红皮梨育种效率，具有适用品种广泛、红株检出率高、错误率低、表型与带型一致率高等优点。
Description
本发明为分案申请，原中国发明专利申请号为202210685255.0，申请日为2022年6月14日，申请时专利名称为：与梨果皮红色性状连锁的位点、分子标记及其应用。
技术领域
本发明属于梨分子遗传育种领域，尤其涉及一种梨果皮红色/绿色性状辅助选择育种的方法。
背景技术
梨(Pyrus L.)是一种重要的蔷薇科(Rosaceae)果树，为我国三大水果之一，据联合国粮农组织统计数据库(FAOSTAT)数据显示，2020年我国梨栽培面积为87万公顷，产量1610万吨，分别占世界总面积和产量的67％和70％，在果树产业中居重要地位。近年来，红梨因其诱人的外观和丰富的营养价值，越来越受消费者青睐。然而，在实际生产中，能够在我国栽培的红梨品种不多，尤其是我国主栽的梨品种为东方梨，缺少品质优良、着色稳定的红色品种，因此，红皮梨一直以来都是我国乃至全世界梨育种工作者的重要育种目标。
目前，杂交育种是梨育种中最常用的育种方式。由于梨为多年生果树，性状遗传机制复杂，杂交后代的优选率低，实生苗通常还需要渡过3-5年甚至更长时间的童期才能开花结果，育种过程中需要大量的土地和人力、物力成本，育种成本高。
前人开发的标记多需要采用荧光定量PCR或普通PCR加聚丙烯酰胺凝胶电泳的方式才能区分不同供试样品的表型，分别具有成本高和实验程序繁琐等缺点。因此，开发能够用普通PCR加琼脂糖凝胶电泳就能成功区分不同样品表型的分子标记，则能极大地降低实验成本并提高育种效率。
分子标记辅助选择育种技术应用于梨育种的重要前提是开发与梨重要性状紧密连锁的分子标记。果皮红色作为梨果实重要的外观品质性状，该性状遗传机制复杂，不同红梨品种红色性状的形成机制不同，并且现有的分子标记存在准确率低的问题，需要开发更为广泛有效的标记位点，以应用于梨育种工作。
梨的染色体存在很多位点但是并非所有的位点都适合作为分子标记，也并非所有的分子标记都可以用于梨果皮红色/绿色性状辅助选择，因此，如何筛选出合适的分子标记，并能够进一步提高准确率及筛选效率、降低错误率是亟待解决的技术难点。
发明内容
鉴于现有技术所存在的问题，本发明提供与梨果皮红色性状连锁的位点、分子标记、应用以及梨果皮红色/绿色性状辅助选择育种的方法。该位点、分子标记可以用于梨果皮红色/绿色性状辅助选择育种中，在杂交苗的幼苗期快速淘汰绿果皮单株，节省后续杂交苗维护和鉴定评价成本，显著提高红皮梨育种效率，具有适用品种广泛、准确率高、红株检出率高、错误率低、表型与带型一致率高等优点。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
与梨果皮红色性状连锁的位点，位点的核苷酸序列包括位于‘中矮1号’梨参考基因组的Chr5的26527817碱基处的位点的核苷酸序列，参考基因组的GeneBank登录号：SMOL00000000。
本发明的有益效果：采用上述标记可以用于梨果皮红色/绿色性状辅助选择育种中，在杂交苗的幼苗期快速淘汰绿果皮单株，节省后续杂交苗维护和鉴定评价成本，显著提高红皮梨育种效率，具有适用品种广泛、准确率高、红株检出率高、错误率低、表型与带型一致率高等优点。
进一步，碱基处的碱基序列为ATAACTAGCAAAAATAAGACACGAAATGTTAAATACT或A。
本发明提供上述位点在梨果皮红色/绿色性状辅助选择育种中的应用。
本发明的有益效果：基于上述位点，可以开发标记引物等，可以用于梨果皮红色/绿色性状辅助选择育种中，在杂交苗的幼苗期快速淘汰绿果皮单株，节省后续杂交苗维护和鉴定评价成本，显著提高红皮梨育种效率，具有适用品种广泛、准确率高、红株检出率高、错误率低、表型与带型一致率高等优点。
本发明提供一种与梨果皮红色性状连锁的分子标记，上述位点位于分子标记扩增产物的内部。
进一步，分子标记的上游引物序列包括SEQ ID NO:1所示的序列，分子标记的下游引物序列包括SEQ ID NO:2所示的序列。
优选地，分子标记的上游引物序列为SEQ ID NO:1所示的序列，分子标记的下游引物序列为SEQ ID NO:2所示的序列。
本发明还提供上述的分子标记在梨果皮红色/绿色性状辅助选择育种中的应用。
本发明提供一种用于扩增上述分子标记的引物。
进一步，引物包括SEQ ID NO:1所示的序列和/或SEQ ID NO:2所示的序列。优选地，上游引物为SEQ ID NO:1所示的序列，下游引物为SEQ ID NO:2所示的序列。
采用上述技术方案的有益效果：采用上述引物可以实现梨果皮红色/绿色性状辅助选择育种，在杂交苗的幼苗期快速淘汰绿果皮单株，节省后续杂交苗维护和鉴定评价成本，显著提高红皮梨育种效率，具有适用品种广泛、准确率高、红株检出率高、错误率低、表型与带型一致率高等优点。
本发明提供上述的引物在梨果皮红色/绿色性状辅助选择育种中的应用。
本发明提供一种梨果皮颜色辅助选择育种试剂盒，包括上述引物。
采用上述技术方案的有益效果：采用上述试剂盒可以实现梨果皮红色/绿色性状辅助选择育种，在杂交苗的幼苗期快速淘汰绿果皮单株，节省后续杂交苗维护和鉴定评价成本，显著提高红皮梨育种效率，具有适用品种广泛、准确率高、红株检出率高、错误率低、表型与带型一致率高等优点。
进一步，所述试剂盒还包括：PCR扩增用酶、去离子水、阳性对照、阴性对照中的一种或几种的组合。
本发明提供上述的试剂盒在梨果皮红色/绿色性状辅助选择育种中的应用。
本发明提供一种梨果皮红色/绿色性状辅助选择育种的方法，包括以下步骤：提取待选择育种的杂交苗或梨品种的DNA，采用上述引物进行PCR扩增。或者提取待选择育种的杂交苗或梨品种的DNA，采用上述的试剂盒进行PCR扩增。
进一步，包括以下步骤：提取待选择育种的杂交苗或梨品种的DNA，采用引物对进行PCR扩增，引物对包括SEQ ID NO:1所示的序列和SEQ ID NO:2所示的序列。
采用上述技术方案的有益效果：采用PCR扩增结合琼脂糖电泳的方法，实验操作简单，不需要复杂昂贵的仪器就可以成功区分不同样品表型，极大地降低实验成本并提高育种效率。采用上述的引物具有准确率高的优点，可以实现梨果皮红色/绿色性状辅助选择育种，在杂交苗的幼苗期快速淘汰绿果皮单株，节省后续杂交苗维护和鉴定评价成本，显著提高红皮梨育种效率，具有适用品种广泛、准确率高、红株检出率高、错误率低、表型与带型一致率高等优点。
进一步，PCR扩增的反应条件包括：94℃3min；95℃10s，54℃30s，72℃30s，35个循环；72℃5min。
采用上述技术方案的有益效果：采用上述的扩增的条件有利于获得清晰明确的带形，有利于对结果的分析判断。
本发明提供的标记适用于不同梨品种间杂交后代的梨果皮红色/绿色性状辅助选择育种。例如：‘苹果梨’ב八月红’、‘八月红×红香酥’，鸭梨、南果、早酥、华酥、华金、华幸、黄冠、京白、安梨、花盖、黄金、慈梨、砀山酥、雪青、西子绿、中矮4号、初夏绿、玉绿、清香、翠冠、中梨1号、金花4号等绿皮品种与八月红、库尔勒香梨、中加1号、玉露香、红香酥、锦香、矮香、中矮1号、中矮2号、中矮5号等红皮品种间的杂交后代，以及上述红皮梨品种之间的杂交后代等等。
‘八月红’是以‘早巴梨’ב早酥’杂交选育而成的一个早熟脆肉红色梨新品种，其果实风味酸甜适口，果皮很容易着大面积红色而深受消费者和育种者喜爱，是培育红皮梨新品种的绝佳亲本之一，应用比较广泛。
附图说明
图1为复合区间作图法果皮红色性状在基因组中的定位情况，纵坐标代表LOD值，横坐标代表作图Block在染色体上的分布，灰色横线代表用PT检验1000次，0.99置信度对应的LOD阈值(7.916)。
图2为实施例1中，B717-Del3 SCAR标记在红皮梨和绿皮梨中的带形图，1、2、3、4为红皮梨带型，5、6为绿皮梨带型，M为DNA Marker。
图3为实施例2中，B717-Del3 SCAR标记在‘苹果梨’ב八月红’杂交组合150株子代中的扩增结果图(条带上方的编号分别对应1-150号样品(第18、20、21、71和111号样品由于操作原因第一次没有检测到清晰条带，第二次重新扩增获得了清晰条带)；M为DNAMarker。
图4为实施例3中，B717-Del3 SCAR标记‘八月红’ב红香酥’杂交组合185株子代中的扩增结果图(条带上方的编号分别对应1-185号样品，第49、61、70、153、154号样品第一次没有检测到清晰条带，第二次扩增获得了清晰条带)；M为DNA Marker。
图5为实施例3中，B717-In1标记在‘八月红×红香酥’185株子代中的扩增，M为DNAMarker；部分条带为得到清晰条带进行了二次扩增。
图6为实施例3中，B717-Del2标记在‘八月红×红香酥’185株子代中的扩增，M为DNA Marker；部分条带为得到清晰条带进行了二次扩增。
图7为实施例4中，为B717-Del3 SCAR标记在47个梨品种中的扩增结果图；M为DNAMarker。
图8为实施例4中，B717-Del2 SCAR标记在47个梨品种中的扩增结果；M为DNAMarker。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
本发明提供与梨果皮红色性状连锁的InDel位点及基于该位点的分子标记及其应用。
本发明提供的与梨果皮红色性状连锁的InDel位点，位于‘中矮1号’梨参考基因组(GeneBank登录号：SMOL00000000)的Chr5的26527817碱基处，该处的碱基序列如SEQ IDNO:3所示，为5'-ATAACTAGCAAAAATAAGACACGAAATGTTAAATACT-3'，变异序列为A。
该变异位点的变异幅度比较大，相差36bp，这就使扩增片段可以通过很简单的琼脂糖电泳就能轻松分辨。位点位于红皮性状染色体定位结果中LOD峰值附近区域(如图1所示)，获得的与红色性状紧密连锁的区域，越接近峰值的区域说明连锁关系越可靠，选用的标记也越准确，可以用于梨果皮红色/绿色性状辅助选择育种。
本发明提供基于上述InDel位点开发的SCAR分子标记，记为B717-Del3，所述InDel位点位于SCAR分子标记扩增产物的内部。
本发明所述B717-Del3 SCAR分子标记在梨果皮红色性状辅助选择育种中的应用。采用上述标记扩增到的2个片段长度差距比较大，区分容易。
本发明所述B717-Del3 SCAR分子标记的引物对为：
上游引物(正向引物)序列：5'-CGCTGTGGTACGTCTACAAATT-3'，如SEQ ID NO:1所示；
下游引物(反向引物)序列：5'-TTTGACGATCGCGTACCAT-3'，如SEQ ID NO:2所示。
所述引物对在梨果皮红色性状育种中的应用。采用上述标记扩增到的2个片段长度差距比较大，区分容易。
本发明针对‘苹果梨’ב八月红’、‘八月红’ב红香酥’2个杂交组合群体采用以上分子标记进行鉴定，B717-Del3 SCAR标记能够对供试群体中果皮红色的单株进行选择，选择效率可以达到100％和98.25％。进一步可以采用以上分子标记在不同梨品种中进行鉴定，本发明提供的B717-Del3 SCAR标记能够准确区分红皮品种和绿皮品种，可以应用于这些品种为亲本的红皮梨育种的早期选择，能够显著提高红皮梨育种的效率，应用前景良好。本发明具有适用品种广泛、准确率高、红株检出率高、错误率低、表型与带型一致率高等优点。
实施例中，2×Taq PCR Mix(含染料)购自北京天恩泽基因科技有限公司，为即用型PCR试剂盒3.0(CAT#:90805-10)。
引物序列均由中美泰和生物技术(北京)有限公司合成。
本发明中未经特殊说明的实验材料均可通过市购获得或者本领域常规方法制备。本发明中的方法未经特殊说明均为本领域的常规方法。
下面通过具体实施例进行进一步介绍。
实施例1
使用B717-Del3分子标记的引物对鉴定梨果皮红色性状，包括以下步骤：
(1)采集梨杂交组合单株(或不同梨品种)新梢幼叶，提取DNA。
(2)采用B717-Del3分子标记的引物对对提取的DNA分别进行PCR扩增，PCR扩增采用20μL反应体系，反应体系成分组成和PCR反应程序如表1和表2所示，扩增分子标记的引物对如表3所示。
表1 PCR反应体系
表2 PCR反应程序
表3 B717-Del3 SCAR标记引物序列
(3)对PCR产物进行3％琼脂糖凝胶电泳，并对电泳结果进行条带统计，标记中红皮和绿皮单株的带型如图2所示，如果带形为151bp和115bp双条带或115bp单带表明为红皮单株；如果带形为151bp单带表明为绿皮单株。
利用上述方法可以在杂交苗的幼苗期快速淘汰绿果皮单株，节省后续杂交苗维护和鉴定评价成本，显著提高红皮梨育种效率。
实施例2
分别采用B717-Del3标记、B717-In1标记、B717-Del2标记在‘苹果梨×八月红’150株子代中进行PCR扩增。
方案1：采用B717-Del3标记在‘苹果梨×八月红’150株子代中进行PCR扩增，操作步骤同实施例1。
方案2：采用B717-In1标记在‘苹果梨×八月红’150株子代中进行PCR扩增，除引物不同外，其他操作步骤同实施例1。B717-In1标记的引物为：
上游引物(正向引物)序列：5'-AAGCAGCAAAAACTGAGTCACT-3'，如SEQ ID NO:4所示；下游引物(反向引物)序列：5'-TGCCTTTACAGTCCCATTTG-3'，如SEQ ID NO:5所示。
判断方法为：PCR扩增结果，如果带形为138bp和172bp双条带或172bp单带表明为红皮单株；如果带形为138bp单带表明为绿皮单株。
方案3：采用B717-Del2标记在‘苹果梨×八月红’150株子代中进行PCR扩增，除引物不同外，其他操作步骤同实施例1。B717-Del2标记的引物为：
上游引物(正向引物)序列：TCCTCCTTGGACTCTCTGTGG(SEQ ID NO:6)；下游引物(反向引物)序列：CGCAGAACCATATCAGCAAAA(SEQ ID NO:7)。
判断方法为：PCR扩增结果，如果带形为196bp和133bp双条带或133bp单条带表明为红皮单株；如果带形为196bp单带表明为绿皮单株。
方案4：采用B717-In1标记和B717-Del2标记对‘苹果梨×八月红’150株子代组合检测，即对每个样本先采用B717-In1标记检测再采用B717-Del2标记检测。采用B717-In1标记检测方法同方案2。采用B717-Del2标记检测方法同方案3。
判断方法：如果其中任何一个标记的引物对扩增结果表明为红皮单株，可以初步认为该单株为红色表型。否则，可以初步认定为该单株为绿色表型。
实验结果：
如表4和图3所示，以B717-Del3标记在‘苹果梨×八月红’150株子代中进行鉴定，其红株检出率为100％，与B717-In1+B717-Del2组合检测结果一致，并且以B717-Del3标记的红株检出率明显高于B717-In1和B717-Del2单独检测结果。
以B717-Del3标记在‘苹果梨×八月红’150株子代中进行鉴定总错误率为2％，与B717-In1和B717-Del2组合检测结果一致，并且总错误明显低于B717-In1、B717-Del2单独检测结果，说明相较于B717-In1、B717-Del2，采用B717-Del3标记可以显著降低错误率。
采用B717-Del3标记可以在杂交苗的幼苗期快速淘汰绿果皮单株，节省后续杂交苗维护和鉴定评价成本，显著提高红皮梨育种效率。
表4分别采用B717-Del3、B717-In1、B717-Del2标记在‘苹果梨×八月红’150株子代中的扩增情况
实施例3
采用B717-Del3标记、B717-In1标记、B717-Del2标记在‘八月红×红香酥’185株子代中的进行PCR扩增。
方案1：采用B717-Del3标记在‘八月红×红香酥’185株子代中进行PCR扩增，操作步骤同实施例2的方案1。
方案2：采用B717-In1标记在‘八月红×红香酥’185株子代中进行PCR扩增，操作步骤、B717-In1标记的引物的序列及判断方法同实施例2的方案2。
方案3：采用B717-Del2标记在‘八月红×红香酥’185株子代中进行PCR扩增，操作步骤、B717-Del2标记的引物的序列及判断方法同实施例2的方案3。
方案4：采用B717-In1标记和B717-Del2标记对‘八月红×红香酥’185株子代组合检测，即对每个样本先采用B717-In1标记检测再采用B717-Del2标记检测。操作步骤、B717-In1标记的引物的序列及判断方法、B717-Del2标记的引物的序列及判断方法均同实施例2的方案4。
实验结果：
如表5、图4至图6所示，以B717-Del3标记在‘八月红×红香酥’185株子代中进行鉴定，其红株检出率为98.25％，高于B717-In1+B717-Del2组合、B717-In1和B717-Del2单独检测结果；以B717-Del3标记在‘八月红×红香酥’185株子代中进行鉴定，总错误率为10.27％，低于B717-In1+B717-Del2组合、B717-In1和B717-Del2单独检测结果。
表5采用B717-Del3标记、B717-In1标记、B717-Del2标记在‘八月红×红香酥’185株子代中的扩增情况
实施例4
采用B717-Del3标记、B717-Del2标记分别在47个梨品种中进行PCR扩增。
方案1：采用B717-Del3标记在47个梨品种中进行PCR扩增，操作步骤同实施例1。
方案2：采用B717-Del2标记在47个梨品种中进行PCR扩增，操作步骤、B717-Del2标记的引物的序列及判断方法同实施例2的方案3。
实验结果：
如表6、图7至图8所示，以B717-Del3标记在47个不同梨品种进行验证，其表型与带型一致率为74.47％，明显高于B717-Del2标记的表型与带型一致率。
利用B717-Del3标记可以选出带型与品种果皮表型一致的梨品种，以这些品种为亲本(其中一个亲本为红色表型)进行杂交，可以使用该SCAR标记早期鉴定杂交苗后代的果皮颜色，幼苗期快速淘汰绿果皮单株，节省后续杂交苗维护和鉴定评价成本，显著提高红皮梨育种效率。
表6采用B717-Del3标记、B717-Del2标记在47个梨品种中的扩增情况
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种梨果皮红色/绿色性状辅助选择育种的方法，其特征在于，包括以下步骤：提取待选择育种的杂交苗或梨品种的DNA，采用引物进行PCR扩增；所述引物用于扩增与梨果皮红色性状连锁的分子标记；与梨果皮红色性状连锁的位点位于分子标记扩增产物的内部；位点的核苷酸序列为位于‘中矮1号’梨参考基因组的Chr5的26527817碱基处的位点的核苷酸序列，参考基因组的GeneBank 登录号：SMOL00000000；碱基处的碱基序列为ATAACTAGCAAAAATAAGACACGAAATGTTAAATACT或A。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述引物包括：SEQ ID NO:1所示的序列和SEQ ID NO:2所示的序列。
3.根据权利要求1或2所述方法，其特征在于，PCR扩增的反应条件包括：94℃ 3min；95℃ 10s，54℃ 30s，72℃ 30s，35个循环；72℃ 5min。
4.一种梨果皮红色/绿色性状辅助选择育种的方法，其特征在于，包括以下步骤：提取待选择育种的杂交苗或梨品种的DNA，采用试剂盒进行PCR扩增；所述试剂盒包括引物，所述引物用于扩增与梨果皮红色性状连锁的分子标记；与梨果皮红色性状连锁的位点位于分子标记扩增产物的内部；位点的核苷酸序列为位于‘中矮1号’梨参考基因组的Chr5的26527817碱基处的位点的核苷酸序列，参考基因组的GeneBank 登录号：SMOL00000000；碱基处的碱基序列为ATAACTAGCAAAAATAAGACACGAAATGTTAAATACT或A。
5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述引物包括：SEQ ID NO:1所示的序列和SEQ ID NO:2所示的序列。
6.根据权利要求4或5所述方法，其特征在于，PCR扩增的反应条件包括：94℃ 3min；95℃ 10s，54℃ 30s，72℃ 30s，35个循环；72℃ 5min。
7.根据权利要求4或5所述方法，其特征在于，所述试剂盒还包括：PCR扩增用酶、去离子水、阳性对照、阴性对照中的一种或几种的组合。
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