CN104404061B

CN104404061B - 水稻黄绿叶突变基因ygl6及其编码的蛋白和应用

Info

Publication number: CN104404061B
Application number: CN201410728239.0A
Authority: CN
Inventors: 施军琼; 赵芳明; 何光华; 桑贤春; 凌英华; 王楠; 杨正林
Original assignee: Southwest University
Current assignee: Southwest University
Priority date: 2014-12-03
Filing date: 2014-12-03
Publication date: 2016-11-30
Anticipated expiration: 2034-12-03
Also published as: CN104404061A

Abstract

本发明公开了水稻黄绿叶突变基因YGL6及其编码的蛋白和应用，水稻黄叶突变基因YGL6的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示，氨基酸序列如SEQ ID No.15所示，与野生型相比水稻黄绿叶突变基因YGL6在第4个外显子上第11碱基由T转换为A，并导致第4位的编码氨基酸由亮氨酸变异为TAG终止子，该基因突变后的水稻YGL6突变体在苗期叶片呈现黄绿色，分蘖后期至成熟期转变为淡绿色，通过杂交发现该性状为隐性性状，因此能够利用此性状选育新品种和种子纯度鉴定，对水稻的遗传育种具有重要意义。

Description

水稻黄绿叶突变基因YGL6及其编码的蛋白和应用

技术领域

本发明属于遗传学领域，具体涉及水稻黄绿叶突变基因YGL6，还涉及该基因编码的蛋白和应用。

背景技术

水稻(Orvza sativa L.)是世界上最重要的粮食作物。尤其杂交水稻的种植，显著提高了水稻的产量，从以前的每亩200-300斤，到现在的每亩800斤，与第二次绿色革命一起差不多解决了全球的粮食危机，为保障国家乃至世界粮食安全做出了巨大贡献。然而种子纯度是制约杂交稻发挥更大作用的重要制约因子。近年来因杂交水稻种子不纯而给农民造成的损失越来越严重。这一问题已引起政府、专家的高度重视。两系法杂交水稻的种子生产，近几年均出现过重大损失。1999年湖南曾因遭遇低温造成2万亩制种大部分失败，损失超过千万元。2002年长江流域8月份的低温，又严重损害了两系杂交稻种子生产。但是鉴定杂种种子纯度一直没有理想的技术方法已成为我国种子产业发展的制约因素。利用苗期标记性状进行作物杂种一代新品种选育和种子纯度鉴定，能在苗期通过观察标记性状的存在或消失与否来识别真假杂种，从而达到能及早识别剔除杂种或非杂种株、实现亲本和杂交种种子纯度双重排杂、加强种子质量监督、大大降低种子鉴定费用、保证田间品种纯度、增产节支等目的。该项技术直观准确，简便快速，具有一般的异地种植鉴定和DNA分子标记鉴定技术无法比拟的优越性。近年来在作物育种及种子纯度鉴定上的研究应用也越来越受到重视。前人已做了大量的工作，也取得了可喜的成绩，成功选育了一些带标记的不育系，如紫叶标记不育系紫S、白化转绿型叶色标记不育系玉兔S和NHR111SA。但由于多数苗期标记性状单系本身性状不优良、常导致其它重要农艺性状显著降低，利用时都需要进行一个杂交转育过程以克服不良性状的遗传累赘，实现优异性状的聚合，这个过程往往非常困难，都要通过大量长期的转育才能实现。因而，发现一些稳定遗传、叶色变异对其它性状尤其产量、品质性状没有显著影响的叶色突变非常重要。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供水稻黄绿叶突变基因YGL6，该基因为苗期标记性状，并且对其他主要农艺性状无显著影响，为水稻转基因研究提供有力的工具，促进杂交稻育种研究；本发明的目的之二在于提供水稻黄绿叶突变基因YGL6编码的蛋白质；本发明的目的之三在于提供水稻黄绿叶突变基因YGL6的应用。

为实现上述目的，本发明利用甲基磺酸乙酯(EMS)诱变自育优良恢复系缙恢10号获得一个遗传稳定的水稻“斑马叶”突变体，在遗传分析和基因定位的基础上，先通过基因预测、同源搜索及基因序列差异比较，初步确定了水稻黄绿叶突变性状为YGL6隐性基因控制，YGL6为3-β类固醇脱氢酶/异构酶(LOC_Os12g23180)。随后，本发明以水稻黄绿叶突变体ygl6为材料，克隆了水稻黄绿叶突变基因YGL6，具有如SEQ ID No.14所示的核苷酸序列，开放阅读框为330bp，编码109个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID No.15所示。与野生型缙恢10号相比，突变基因YGL6在第4个外显子上第11碱基有T-A的转换，并导致第4位的编码氨基酸序列发生亮氨酸(Leucine)到TAG终止子的转变，使突变蛋白仅有109个氨基酸，并且LOC_Os12g23180蛋白与41-kDa的叶绿体茎环结合蛋白相近。

然后，然后构建RNAi载体并转化中花11，经鉴定转基因阳性植株叶片变为黄绿。进一步确定水稻黄绿叶性状由YGL6基因突变引起，因此水稻黄绿叶突变基因YGL6能够用于在水稻黄绿叶性状的分子育种。

本发明的有益效果在于：本发明提供了水稻黄绿叶突变基因YGL6，该基因为苗期标记性状，对其他主要农艺性状无显著影响，为水稻遗传育种研究提供了有力的工具，为选育纯种不育系奠定基础。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：

图1为水稻黄绿叶突变体ygl6和野生型缙恢10号形态学观察结果(A：野生型缙恢10号形态；B：水稻黄绿叶突变体ygl6形态；C：苗期野生型缙恢10号与水稻黄绿叶突变体ygl6形态；D：分蘖后期野生型缙恢10号与水稻黄绿叶突变体ygl6形态)。

图2为水稻黄绿叶突变基因YGL6基因的遗传和物理图谱(A为YGL6的初定位区间在第12染色体长臂SSR标记RM1337和RM1261间；B为将YGL6基因精细定位在标记Ind23与Ind37间143kb的范围内；C为所在区域BAC克隆；D为突变体yfl6的候选基因Os12g23180的结构及突变位置)。

图3为水稻黄绿叶突变基因YGL6在野生型缙恢10号和突变体ygl6中的表达(WT为缙恢10号)。

图4为YGL6突变体RNAi表型分析及定量real-time PCR分析和色素分析，其中A为中花11(ZH11)和YGL6的3株RNAi转基因阳性植株表型；B为YGL6在中花11和3株RNAi转基因阳性植株中的real-time PCR定量PCR分析；C为3株RNAi转基因阳性植株和野生型的色素分析，Chla为叶绿素a，Chlb为叶绿素b，Car为胡萝卜素。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

本发明实施例中使用的材料：野生型水稻材料缙恢10号(WT)和水稻黄绿叶突变体ygl6，均由本实验室培育；M-MLV逆转录酶、高保真DNA聚合酶PFU、Taq DNA聚合酶、T4DNA连接酶、限制性内切酶、pMD19-T载体、Trizol试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、λ-Hind III DNA Marker及DL5000DNA Marker购自TaKaRa公司；DNA Marker III购自天根生化科技(北京)有限公司；氨苄青霉素(Ampicillin，Amp)和卡拉霉素(Kanamycin，Kan)为Sigma公司产品；引物合成和DNA测序由上海英俊生物技术有限公司完成；其它化学试剂购自北京鼎国生物技术有限责任公司；大肠杆菌DH5α、农杆菌LBA4404由本实验室保存。

实施例1、水稻黄绿叶突变体ygl6的获得和形态学观察

利用甲基磺酸乙酯(EMS)诱变自育优良恢复缙恢10号获得一个遗传稳定的水稻黄绿叶突变体，命名为ygl6。水稻黄绿叶突变体ygl6，在苗期叶片呈现黄绿色，分蘖后期至成熟期转变为淡绿色(图1)。该性状经过多代观察，表现稳定遗传，并且其他主要农艺性状如穗长和每穗粒数没有显著差异，株高、有效穗、千粒重显著减少。

实施例2、突变ygl6基因遗传分析与定位

以ygl6突变体为父本，籼稻品种西农1A(Xinong1A)为母本杂交获得F1代植株叶片全部表现为正常绿色，然后通过自交获得8149株F₂代群体中，依据黄绿叶性状分离出了突变叶片和正常叶片两种表型，分离出1997株突变单株，其余为正常株，可以看出正常株与突变株符合3：1的分离比例，表明该突变性状由一对隐性单基因控制。

初步定位：选取均匀分布于水稻12条染色体上的480对SSR引物，在亲本ygl6和西农1A间检测多态性，其中有98对SSR引物显示多态性。用这98对引物在正常和突变基因池中进行基因连锁分析，筛选与基因Zebra-15连锁的SSR标记，发现YGL6与第12染色体短臂上标记RM1337和RM1261连锁。用连锁标记RM1337和RM1261，同时设计了1个具有亲本多态性的In/Del标记Ind24分析156株隐性突变单株。结果显示，基因YGL6与标记RM1337和Ind24之间，遗传均为0.32cM(图2中A)。

精细定位：根据已公布的籼稻品种93-11序列，在标记RM1337和Ind24间进一步筛选和开发了40对In/Del引物，其中Ind13，Ind23，Ind37和Ind39在两亲本间表现出多态性(表1)。用这4对引物分析所有1997株突变单株，结果表明：标记Ind13，Ind23，Ind37和Ind39与基因YGL6之间的交换株分别为2、1、1和3个(图2中B)。最终YGL6被定位在标记Ind23和Ind37之间，物理距离为143kb的范围内，此区间包括两个BAC克隆：OSJNBa0024B20和OSJNBa0037L20(图2中C)。

表1、5对具有多态性的SSR标记序列

引物	正向序列(5′→3′)	反向序列(5′→3′)
			Ind13	cctctaaagttcctacaattcga(SEQ ID NO.1)	cattacgtcctagagtctgtgct(SEQ ID NO.2)
Ind23	ctattcttaatatcgggtgcgt(SEQ ID NO.3)	gagttggagaaggaacagagtt(SEQ ID NO.4)
			Ind24	ctcgctaacaagacgcctta(SEQ ID NO.5)	gtcaccaaccggatcataga(SEQ ID NO.6)
Ind37	cgatcagtagtcactcccttca(SEQ ID NO.7)	agcacaagcacttggtgaat(SEQ ID NO.8)
			Ind39	gctatgtcaaacacggtcttatt(SEQ ID NO.9)	ctggtgtatccaacgcttgt(SEQ ID NO.10)

对BAC克隆OSJNBa0024B20和OSJNBa0037L20上位于标记Ind23和Ind37之间的21个注释基因(http://www.gramene.org)进行了分析，通过cDNA和蛋白序列比对(在NCBIBLAST进行)，分析这些基因的功能(或预测功能、同源基因功能)，发现在BAC克隆OSJNBa0037L20上有一个3-β类固醇脱氢酶/异构酶基因－Os12g23180。根据Os12g23180基因的序列信息可知，该基因由10个外显子和9个内含子组成，基因组编码框序列全长1131bps，cDNA编码序列全长1476bps，核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，编码376个氨基酸(图2D)。

实施例3、克隆Os12g23180基因

根据GenBank已登录的水稻日本晴基因Os12g23180序列，利用Vector NTI软件设计扩增YGL6突变体和野生型缙恢10号Os12g23180序列的mRNA特异引物：上游引物YGL6F：5’-atgtcgtcgccgaccgccg-3’(SEQ ID No.12)；下游引物YGL6R：5’-atgtcgtcgccgaccgccg-3’(SEQ ID No.13)。

分别取野生型缙恢10号和突变体ygl6在光照培养两周的幼叶2g，迅速放入液氮中研磨成粉末，按照Trizol试剂盒说明书提取总RNA。所得野生型缙恢10号和突变体ygl6总RNA的电泳结果显示主带清晰完整，28S和18S的条带亮度比约为2:1，说明RNA的浓度和纯度符合实验要求，可以用于合成双链cDNA。然后分别以所得野生型缙恢10号和突变体ygl6总RNA为模板，按照M-MLV逆转录酶说明书，使用Oligo(dT)引物进行逆转录获得cDNA；再以cDNA为模板，以SEQ ID No.12和SEQ ID No.13所示序列为特异引物及高保真DNA聚合酶PFU进行PCR扩增，PCR反应条件为：94℃预变性5分钟；然后94℃变性30秒，55℃复性30秒，72℃延伸1分钟，共35个循环；最后72℃延伸10分钟。将RT-PCR产物进行1.0％(g/mL)琼脂糖凝胶电泳检测。结果显示，野生型缙恢10号和突变体的突变体ygl6扩增产物均在约1000bp处呈单一特异性条带，并将野生型缙恢10号扩增产物命名为YGL6基因，突变体ygl6扩增产物命名为YGL6突变基因(ZEBRA15’)。

然后按照DNA凝胶回收试剂盒说明书进行切胶回收纯化，纯化的YGL6基因和YGL6突变基因与PTCK303载体在T4DNA连接酶的作用下于16℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取质粒，PCR鉴定后测序，分别得重组载体PTCK303-YGL6和PTCK303-YGL6’。将重组载体PTCK303-YGL6和PTCK303-YGL6’送测序公司进行测序，结果显示YGL6突变基因序列如SEQ ID No.14所示，开放阅读框为1131bp，与野生型缙恢10号相比，突变基因YGL6在第4个外显子上第11碱基有T-A的转换，并导致第4位的编码氨基酸序列发生亮氨酸(L)到终止子TAG的变异，突变后氨基酸序列如SEQID No.15所示，YGL6基因序列与日本晴基因Os12g23180序列一致。

实施例4、分析水稻黄绿叶突变基因YGL6的表达情况

利用表2的引物对水稻黄绿叶突变基因YGL6进行荧光定量分析，同时以Actin为内参反应体系为：在25μL的反应体系中加入2μL的cDNA模板，2μL引物，12.5μL SYBR Green荧光染料和8.5μL RNase-free H₂O，在Bio-rad荧光定量PCR仪上进行荧光定量扩增；扩增条件为：95℃预变性30秒；95℃变性5秒，60℃30秒，40个循环；并加溶解曲线65℃→95℃梯度升温，梯度升温条件为0.5℃/5秒，然后利用CFX-Manager软件进行数据的收集与处理，结果如图3所示。

表2、定量引物序列

引物	正向序列(5′→3′)	反向序列(5′→3′)
			Actin	gacccagatcatgtttgagacct(SEQ ID No.16)	cagtgtggctgacaccatcac(SEQ ID No.17)
YGL6	tgaagagcagcctcctgctaccat(SEQ ID No.18)	caagaagacaccaatgaacctggt(SEQ ID No.19)

由图3可知，水稻黄绿叶突变突变体YGL6基因的表达量比野生型有极显著的降低，可能是由于无义突变介导的mRNA降解所致，从而防止有潜在毒性的截短蛋白的产生。

实施例5、突变基因YGL6的功能验证

为了验证水稻突变体ygl6的黄绿叶性状是由突变基因YGL6引起的，将YGL6基因通过正向和反向连入PTCK303载体中获得RNAi重组表达载体。具体方法为：分别以YGL6RiF1：5′-gccggtacccaagtgcaacacctttgaagagaa-3′(SEQ ID No.20)与ygl6RiR1，5′-gccggatccaagagcagcctcctgctaccat-3′(SEQ ID No.21)和ygl6RiF2：5′-gccgagctcaagagcagcctcctgctaccat-3′(SEQ ID No.22)和ygl6RiR2：5′-gccactagtcaagtgcaacacctttgaagagaa-3′(SEQ ID No.23)为引物，扩增野生型缙恢10号cDNA，扩增产物经纯化后分别用Kpn Ⅰ和BamH Ⅰ与Xho Ⅰ和Spe Ⅰ酶切，然后先后连入PTCK303载体，获得RNAi重组表达载体，分别命名为PTCK303-Z15CV和PTCK303-Z15CV′。将获得的RNAi重组表达载体PTCK303-Z15CV和PTCK303-Z15CV′分别转化ygl6突变体，获得转基因植株，然后观察转基因植株的叶片性状，结果如图4中A所示。结果显示，转基因植株叶片变为黄绿叶型，进一步证实了ygl6突变体是由Os12g23180基因第4个外显子上第11位碱基由“T”突变为“A”，其原因是突变基因YGL6表达提前终止引起的。然后利用real-time PCR分析水稻突变体ygl6和中花11中YGL6突变基因的表达量，结果如图4中B所示。结果显示，在转基因植株中YGL6突变基因表达量下调。最后检测水稻突变体ygl6和中花11的叶绿素a(Chla)，叶绿素b(Chlb)和胡萝卜素(Car)的含量，结果如图1中C所示。结果显示，在转基因植株中Chla，Chlb和Car表达量均出现下调，其中Chla下调最为明显。

由于水稻黄绿叶是理想的形态标记性状，其叶色变异对其它性状尤其产量、品质性状影响较小，因而在回交转育中，能快速达到育种要求。所以本发明公开的YGL6突变基因为水稻的分子育种提供了重要的基因资源。基于YGL6突变基因构建植物表达载体并转化优质背景的水稻不育系，再将转化的水稻细胞培育成黄绿叶不育系，即可通过转基因快速实现黄绿叶不育系。从而利用苗期黄绿叶标记性状进行作物杂种一代新品种选育和种子纯度鉴定，能在苗期通过观察标记性状的存在或消失与否来识别真假杂种，从而达到能及早识别剔除杂种或非杂种株、实现亲本和杂交种种子纯度双重排杂、加强种子质量监督、大大降低种子鉴定费用、保证田间品种纯度、增产节支等目的。该项技术直观准确，简便快速，具有一般的异地种植鉴定和DNA分子标记鉴定技术无法比拟的优越性。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims

1.水稻黄绿叶突变基因YGL6，其特征在于：核苷酸序列如SEQ ID No.14所示。

2.权利要求1所述水稻黄绿叶突变基因YGL6编码的蛋白质，其特征在于：氨基酸序列如SEQ ID No.15所示。

3.权利要求1所述水稻黄绿叶突变基因YGL6在水稻黄绿叶性状的分子育种中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：水稻品种为缙恢10 号。