CN108165655B - 一种与菠菜雄性紧密连锁的ssr标记sp_ssr19及其在菠菜性别鉴定中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种与菠菜雄性紧密连锁的SSR标记SP_SSR19及其在菠菜性别鉴定中的应用，属于分子生物学技术领域。本发明的技术方案要点为：一种与菠菜雄性紧密连锁的SSR标记SP_SSR19，该SSR标记SP_SSR19通过以下特异引物对扩增获得，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，在菠菜雄株中扩增出178bp的特异条带，在菠菜雌株中无扩增产物，所述特异引物对为：上游引物：5’‑GGTACTGGTTAGGGCTCTGG‑3’；下游引物：5’‑CATCTGGTCATCCGATGTGA‑3’。利用本发明提供的分子标记不但可以用来对菠菜栽培种进行早期性别鉴定，也可以应用到对菠菜野生种早期性别鉴定工作中，提前对菠菜雌、雄株进行筛选，大大提高育种效率，在菠菜生产实践、育种中具有重要的价值。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种与菠菜雄性紧密连锁的SSR标记SP_SSR19及其在菠菜性别鉴定中的应用。
背景技术
菠菜（Spinacia oleracea L.）别名波斯草、赤根菜，是黎科菠菜属以绿叶为主要产品器官的一、二年生草本植物。菠菜营养丰富，含有多种维生素，耐寒性强，生产周期短，复种指数高，产量及产值均较高，深受生产者和消费者的喜爱。目前在我国南北各地普遍栽培，是春、秋、冬季的主要绿叶蔬菜之一，也是我国主要出口蔬菜之一。据联合国粮食及农业组织（FAO）2014年统计，我国菠菜年产量约22.1百万吨，占世界菠菜总产量的90.9%，是世界上最大的菠菜种植国家及消费国家。2014年，我国菠菜种子市场规模为11.55亿元，进口570.0t菠菜种子，出口60.2t。预测到2020年，我国菠菜种子市场规模将达到19.75亿元，对菠菜种子的需求量非常巨大。自21世纪初以来，国外种子公司如圣尼斯、先正达、坂田等培育的菠菜优良品种陆续、大量的推广销售到我国，占据了我国大部分种子市场。据黄铎（2013）报道，我国菠菜生产每年需要常规种约6800t、杂交种约1800t，目前市场上用于生产的杂交种主要来自圣尼斯、先正达、坂田、泷井等公司，而我国自主培育的菠菜一代杂种少、推广面积有限。因此，非常有必要提高我国培育菠菜品种的种类和质量。
分子标记辅助育种是利用分子标记与决定目标性状基因紧密连锁的特点，通过检测分子标记即可检测到目的基因的存在，达到选择目标性状的目的，具有快速、准确、不受环境条件干扰的优点。其是育种工作中重要的一项技术手段，不仅弥补了作物育种中传统的选择技术准确率低的缺点，而且加快了育种进程。分子标记辅助育种工作中非常重要的一个环节就是筛选到有效的与性状紧密连锁的分子标记。菠菜不仅具有雌雄异株植株，并且还具有雌雄同株植株，这些雌雄异株植物可以作为商业育种非常好的资源，但是菠菜在营养生殖阶段雌株、雄株形态几乎没有差异。因此，急需寻找与性别紧密连锁并且适用于多数品种的分子标记用于早期菠菜的性别鉴定。Akamatsu等（1998）开发出与菠菜X/Y基因连锁的分子标记T11A、V20A，可用于鉴别菠菜雌、雄植株。Onodera等（2011）在分析几千个AFLP标记的基础上，最终鉴定了10个与菠菜性别决定位点X/Y紧密连锁的AFLP标记。刘丹丹等（2015）将SRAP标记转化为与Y基因共分离的SCAR标记S5.7和S9.5。Kudoh等（2017）在对AFLP转化为SCAR标记及在BAC末端序列设计引物的基础上，开发了8个雄性特异的分子标记。以上这些标记除了T11A和V20A外，往往不存在普遍性，只能应用某些特定品种，并且国内科研机构开发的性别连锁的分子标记非常少，不利用于菠菜品种知识产权的保护。本专利是在利用PacBio三代测序技术对菠菜XX、YY植株测序的基础上，利用生物信息学软件对获得Y染色体上雄性特异Contigs分析获得SSR标记，该标记具有稳定、适用不同品种的特点，可以广泛应用于菠菜分子标记辅助育种。
发明内容
本发明解决的技术问题是提供了一种与菠菜雄性紧密连锁的SSR标记SP_SSR19及其在菠菜性别鉴定中的应用。首先利用PacBio测序技术对菠菜XX、YY基因组进行全基因组测序，对获得全基因组序列进行比较基因组分析，获得雄性特异序列；然后利用SOAPdenovo2软件对获得的雄性特异序列进行组装，获得雄性特异contigs，再利用RepeatMasker软件分析获得的雄性特异contigs，根据其中SSR序列的两端序列设计引物，利用设计的引物对菠菜栽培种进行雌雄鉴定，最后对菠菜栽培种、野生种进行雌雄鉴定。
本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案，一种与菠菜雄性紧密连锁的SSR标记SP_SSR19，其特征在于：该SSR标记SP_SSR19通过以下特异引物对扩增获得，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，在菠菜雄株中扩增出178bp的特异条带，在菠菜雌株中无扩增产物，所述特异引物对为：
上游引物：5’-GGTACTGGTTAGGGCTCTGG-3’；
下游引物：5’-CATCTGGTCATCCGATGTGA-3’。
本发明所述的与菠菜雄性紧密连锁的SSR标记SP_SSR19在菠菜性别鉴定中的应用，其特征在于具体过程为：首先提取待测菠菜的基因组DNA，以待测菠菜的基因组DNA为模板利用特异引物对进行PCR扩增，PCR扩增反应体系为：10×PCR Buffer 2μL、2.5mM dNTPMixture 1μL、10μM/μL上游引物1.25μL、10μM/μL下游引物1.25μL、5U/μL Taq酶0.2μL、100-200ng模板DNA 1μL和无菌水13.3μL，PCR扩增反应程序为：95℃预变性2min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，共30个循环；最后72℃延伸7min；琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，若扩增出178bp的特异性条带则为雄性，若无扩增产物则为雌性。
进一步优选，所述待测菠菜为菠菜栽培种或菠菜野生种。
本发明提供的鉴定菠菜性别的分子标记克服了现有技术中只能在抽薹期才能区分菠菜雌雄株而带来的育种效率低下的问题，实现在苗期就能进行菠菜性别鉴定的技术效果。通过利用本发明提供的特异性引物对采用PCR方法检测待测菠菜的基因组DNA，扩增SSR标记SP_SSR19，当扩增产物在琼脂糖凝胶电泳中出现178bp的特异条带时，可判定待测菠菜为雄性，若无该条带，则待测菠菜为雌性，可以准确对菠菜进行性别鉴定，用于筛选植株，大大提升了菠菜的育种效率。相对于国内外已发现的其它标分子记，本发明SSR标记SP_SSR19与菠菜雄性紧密连锁，位于Y染色体上，为菠菜性别决定基因的克隆和测序奠定了基础，在菠菜生产实践中、育种中具有非常重要的价值。
附图说明
图1为SP_SSR19标记检测菠菜栽培种性别的琼脂糖凝胶电泳图，M为marker，C为阴性对照；
图2为SP_SSR19标记检测菠菜不同栽培中、野生种性别的琼脂糖凝胶电泳图，M为marker（6个条带分别为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp），电泳泳道分别为Spinacia oleracea Cornell ID #273、Spinacia oleracea Chung Pu Lao、Spinacia oleracea Cornell ID #174、Spinacia oleracea DA JIAN YE BO CAI、Spinacia turkestanica SPI 155/83、Spinacia turkestanica 1.1和Spinacia tetrandra SPI153/89，C为阴性对照。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。
实施例1
与菠菜雄性紧密连锁的SSR标记SP_SSR19的获得及验证
1、利用PacBio测序技术对菠菜XX、YY基因组进行全基因组测序
筛选菠菜种质资源，菠菜栽培种Cornell #9群体中既具有雌株、雄株，又有雌雄同株。雌株为XX植株，利用雌雄同株之间进行杂交（XY x XY→YY:XY:XX）获得YY植株，利用PacBio测序技术对菠菜XX、YY基因组进行全基因组测序。
2、对获得全基因组序列进行比较基因组分析，获得雄性特异序列
利用生物信息学分析软件进行比较基因组分析，获得雄性特异序列。
3、利用SOAPdenovo2软件对获得的雄性特异序列进行组装，获得雄性特异contigs
4、利用RepeatMasker软件分析获得的雄性特异contigs，根据其中SSR序列的两端序列设计引物
5、菠菜栽培种Conell #9基因组DNA的提取
采用CTAB法提取菠菜单株的基因组DNA，根据花器官确定雌性基因组和雄性基因组，并将10个单株DNA进行等量混合，构建雌性基因组池和雄性基因组池。
6、SSR标记SP_SSR19在菠菜栽培种Conell #9中的验证
利用设计的特异引物对：
上游引物：5’-GGTACTGGTTAGGGCTCTGG-3’
下游引物：5’-CATCTGGTCATCCGATGTGA-3’
对菠菜栽培种Conell #9雌、雄基因池分别进行扩增，琼脂糖凝胶电泳结果显示，雄性基因组中出现178bp的特异条带，雌性基因组中无扩增产物，扩增产物的测序结果如序列表中SEQ ID NO.1所示。
PCR扩增反应体系为：10×PCR Buffer（2μL）、2.5mM dNTP Mixture（1μL）、10μM/μL上游引物（1.25μL）、10μM/μL下游引物（1.25μL）、5U/μL Taq酶（0.2μL）、100-200ng模板DNA（1μL）和无菌水（13.3μL）。
PCR扩增反应程序为：95℃预变性2min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，共30个循环；最后72℃延伸7min。
实施例2
与菠菜雄性紧密连锁的SSR标记SP_SSR19在菠菜栽培种与野生种性别鉴定中的应用
1、菠菜栽培种、野生种单株基因组DNA的提取
采用CTAB法提取待测菠菜单株的基因组DNA。
2、SSR标记SP_SSR19在菠菜栽培种、野生种性别鉴定中的应用
利用设计的特异引物对：
上游引物：5’-GGTACTGGTTAGGGCTCTGG-3’
下游引物：5’-CATCTGGTCATCCGATGTGA-3’
对待测菠菜的栽培种、野生种单株基因组DNA分别进行扩增，琼脂糖凝胶电泳结果出现178bp特异条带的为雄株，无扩增产物的为雌株。
PCR扩增反应体系为：10×PCR Buffer（2μL）、2.5mM dNTP Mixture（1μL）、10μM/μL上游引物（1.25μL）、10μM/μL下游引物（1.25μL）、5U/μL Taq酶（0.2μL）、100-200ng模板DNA（1μL）和无菌水（13.3μL）。
PCR扩增反应程序为：95℃预变性2min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，共30个循环；最后72℃延伸7min。
以上实施例描述了本发明的基本原理、主要特征及优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 河南师范大学
<120> 一种与菠菜雄性紧密连锁的SSR标记SP_SSR19及其在菠菜性别鉴定中的应用
<130> 2018
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 178
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 1
ggtactggttagggctctgggtttttttctttttttttctttgtgtctccctttgttttt 60
ctaattctcttctttggctatttttttggctctttttggctaatgataatgataaggttc 120
tttttggctatttttggcatatgttttcttgttttaagtcacatcggatgaccagatg 178
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 2
ggtactggttagggctctgg 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 3
catctggtcatccgatgtga 20。
序列表
<110> 河南师范大学
<120> 一种与菠菜雄性紧密连锁的SSR标记SP_SSR19及其在菠菜性别鉴定中的应用
<130> 2018
<141> 2018-02-27
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 178
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
ggtactggtt agggctctgg gtttttttct ttttttttct ttgtgtctcc ctttgttttt 60
ctaattctct tctttggcta tttttttggc tctttttggc taatgataat gataaggttc 120
tttttggcta tttttggcat atgttttctt gttttaagtc acatcggatg accagatg 178
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
ggtactggtt agggctctgg 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
catctggtca tccgatgtga 20
Claims (3)
1.一种与菠菜雄性紧密连锁的SSR标记SP_SSR19，其特征在于：该SSR标记SP_SSR19通过以下特异引物对扩增获得，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，该SSR标记的特异引物对可在菠菜雄株中扩增出178bp的特异条带，在菠菜雌株中无扩增产物，所述特异引物对为：
上游引物：5’-GGTACTGGTTAGGGCTCTGG-3’；
下游引物：5’-CATCTGGTCATCCGATGTGA-3’。
2.权利要求1所述的与菠菜雄性紧密连锁的SSR标记SP_SSR19在菠菜性别鉴定中的应用，其特征在于具体过程为：首先提取待测菠菜的基因组DNA，以待测菠菜的基因组DNA为模板利用权利要求1中所示的特异引物对进行PCR扩增，PCR扩增反应体系为：10×PCR Buffer2μL、2.5mM dNTP Mixture 1μL、10μM/μL上游引物1.25μL、10μM/μL下游引物1.25μL、5U/μLTaq酶0.2μL、100-200ng模板DNA 1μL和无菌水13.3μL，PCR扩增反应程序为：95℃预变性2min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，共30个循环；最后72℃延伸7min；琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，若扩增出178bp的特异性条带则为雄性，若无扩增产物则为雌性。
3.根据权利要求2所述的与菠菜雄性紧密连锁的SSR标记SP_SSR19在菠菜性别鉴定中的应用，其特征在于：所述待测菠菜为菠菜栽培种或菠菜野生种。
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