CN105112527A - 一种碧螺春商品茶的分子鉴定方法 - Google Patents

一种碧螺春商品茶的分子鉴定方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种碧螺春商品茶的分子鉴定方法，属分子标记技术领域。该方法将待鉴定样品PCR反应获得扩增产物测序后，与碧螺春母树品种条形码比对，当扩增产物的SNP序列与碧螺春适制品种条形码所示的差异碱基序列的相似性达到99.5%以上，则该待鉴定样品为碧螺春品种。本发明克服了用感官审评或理化分析等方法难以鉴别碧螺春茶的真伪以及山茶属下不同茶树品种的技术问题，能有效、简便快速地对碧螺春商品茶的品种进行准确鉴定。

Description

一种碧螺春商品茶的分子鉴定方法
技术领域
本发明属于分子标记技术领域，具体涉及一种碧螺春商品茶的分子鉴定方法。
背景技术
茶树[Camelliasinensis(L.)O.Kuntze]是一种重要的经济作物，是21世纪最流行的健康饮料植物之一。中国是茶树的原产地，产茶历史悠久。近年来，中国茶产业快速发展，产业规模不断扩大，茶园种植面积、产量、出口数量和金额屡创新高。同时，二十世纪九十年代开始全国各地挖掘、恢复历史名茶和创制新名茶并举，名优茶数量不断增加，质量逐年提高，市场全面开拓。苏州洞庭碧螺春茶作为全国著名历史名优茶之一，碧螺春茶产于苏州太湖洞庭，该地气候湿润温和、常年云雾弥漫，良好的生态环境、适宜的茶树品种和精细的加工工艺，成就了碧螺春茶的独特品质，其外形条索纤细、色绿隐翠、茸毫披覆、卷曲似螺、内质汤色嫩绿、香气鲜雅、兰韵突出，滋味鲜醇、回味绵长，叶底柔嫩，因此以形美、色艳、香浓、味醇“四绝”以及悠久的帝王传说享誉海内外。2002年12月，洞庭碧螺春茶列为国家原产地保护产品(GB18957-2003)。
目前，苏州“洞庭碧螺春”茶的茶树群体种以小、中叶型灌木为主。根据苏州市吴中区农林局林业站统计：目前东西山共有28000余亩茶园，其中洞庭地方群体茶树品种茶园18000多亩，年产茶叶276吨，其中碧螺春128吨，茶叶总产值15000万元左右，其中碧螺春产值12500万元左右。洞庭山茶树通常称为东、西山群体中小叶型，嫩梢较长，重量较轻。东、西山群体种以“柳叶条”、“酱板头”、“柴茶”等小叶茶树品种为代表，这些茶树品种适宜制作洞庭碧螺春，是目前洞庭碧螺春原产地主导茶树品种。
目前，碧螺春茶因其在茶叶市场中价值高、功效多的特性而不可避免地遭到了仿冒，因此有必要对名优茶的品质真伪进行鉴别，以保护品茶爱好者的利益，维持名优茶市场的公平公正性。感官判别和理化检测是最常用的茶叶品质鉴别方法，但感官的判别方法受品茶师的个人经验、心理和生理因素等影响，往往判别结果的准确性和重复性差；理化检测的方法只限于某些茶叶内部特定组分的分析，而且分析流程多，成本高。
近年来，分子生物学和生物技术迅速发展，遗传标记技术在此基础上也得到了迅猛发展。分子标记作为继形态学标记、细胞学标记、生化标记之后一种新的遗传标记技术，发展时间虽短但具有广阔的应用前景和巨大的应用潜力，在遗传图谱构建、群体遗传结构和多样性分析、物质演化和亲缘关系研究中具有重要意义。目前，分子标记技术已在茶树研究中广泛应用，取得较多进展，并且研究也不断改进。在茶树中应用较多的分子标记技术为限制性内切酶片段长度多态性(RFLP)、随机扩增多态性DNA标记(RAPD)、简单序列重复(SSR)、扩增片段长度多态性(AFLP)、单核苷酸多态性(SNP)等。虽然RFLP、RAPD、SSR、AFLP在分子标记技术中具有各自的优点，但是也存在实验操作繁琐、检测周期长、成本高等缺点。单核苷酸多态性(SNP)作为最常见的一种可遗传变异，广泛存在动植物基因组中。SNPs是指基因组水平上，单个核苷酸变异形成的DNA序列多态性，为第三代分子标记的代表。SNP包括两种形式，碱基的转换或碱基的颠换，具有分布广泛、数量巨大、遗传稳定性强，基因编码区的SNP可能会直接影响产物蛋白质的结构或基因表达水平等优点，而且也易于自动快速检测和自动化分析，是研究复杂遗传性状和基因组进化的理想标记。
发明内容
发明目的：本发明的目的是提供一种碧螺春商品茶的分子鉴定方法。本发明利用分子标记技术克服了感官判别和理化检测方法的不足，利用SNP差异位点，最终达到碧螺春茶品质真伪快速鉴别的目的检测。
技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种碧螺春商品茶的分子鉴定方法，包括以下步骤：
1)确定碧螺春茶叶样品的6个SNP位点，在NCBI中通过blast找到的对应的6个基因序列；
2)引物的设计；根据找到的6个基因序列，按照同源克隆的方法，找到近缘植物，并进行序列的比对，找到同源性较高的片段区域，设计这6个基因片段的上下游引物；
3)基因组DNA提取；
4)PCR扩增及检测；
5)将扩增产物测序后与碧螺春母树品种条形码比对，碧螺春母树品种条形码的碱基序列如SEQIDNO：25～30所示，扩增产物的SNP序列与碧螺春母树品种条形码所示的差异碱基序列的相似性达到99.5％以上，则该待鉴定样品为碧螺春品种。
其中，上述引物的设计长度18-25bp，产物大小为200-600bp，Tm值为50℃-60℃，GC含量在40％-60％之间。
其中，上述基因组DNA提取采用改良CTAB法从新鲜叶片中提取基因组DNA，其主要操作步骤为：
1)将0.1g的茶叶放入研钵中，并加入少量的PVPP，倒入液氮，将叶片充分研磨至白色粉末状，并转移至1.5mL离心管，然后在离心管中加入0.6mL预热的CTAB提取液并充分震荡混匀，65℃水浴一小时，期间不断震荡混匀；
2)在离心管中加入等体积的氯仿异戊醇混合液，充分混匀，室温静置5min；
3)使用离心机在4℃下10000rpm离心10min，吸上清液至新离心管，加入等体积的氯仿异戊醇混合液，混匀后静置5min；
4)使用离心机在4℃下10000rpm离心10min，吸上清液至新离心管，加入等体积的异丙醇混匀后在-20℃下放置1h以上；
5)使用离心机在4℃下5000rpm离心5min，弃上清液收集沉淀；
6)在离心管中加入高盐缓冲液，在65℃水浴，溶解沉淀；
7)使用离心机在4℃下10000rpm离心5min，吸上清液于新离心管；
8)在管中加入1/10体积NaAc及2/3体积异丙醇，混匀，在-20℃放20min；
9)使用离心机在4℃下5000rpm离心5min，弃上清液，收集沉淀；
10)使用70％的乙醇洗涤沉淀3次，倒置离心管于吸水纸上，干燥沉淀；
11)使用300μL超纯水溶解沉淀，加入0.5RNase使RNA降解；
12)使用NanoDropND-1000分光光度计测定浓度和纯度；
13)使用1％琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的质量。
其中，上述PCR扩增反应程序为：94℃预变性10min；然后进入循环，每个循环94℃变性30sec，52～55℃退火30sec，72℃延伸90sec，共35个热循环，最后延伸72℃延伸10min；4℃冷却后取出扩增产物。
有益效果：本发明能够节省成本，以及对于样本量没有限制，克服了直接使用单个位点进行确认不太准确的问题，本发明通过采用6个SNP位点确定更加准确。该方法简单易行，稳定可靠，只需极少量样品就可完成，具有很好的实用价值，碧螺春正品，可以用其他相似茶叶作为代用品，本发明方法能方便地鉴定出碧螺春、能方便地将碧螺春与从形态特征易与碧螺春混淆的其它茶叶区别开。因此，本发明方法对保护碧螺春的收购及茶叶生产质量具有十分重要的应用价值。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进一步详细说明。
实施例1：
1、材料的选取以及6个SNP位点的确定
碧螺春茶叶样品为不同省份碧螺春样品。试验中，碧螺春茶样分别于2013年5-6月购自江苏、浙江、安徽和福建等产茶名区。碧螺春的6个SNP位点的基因序列参见SEQIDNO:1～6，根据这6个SNP位点，在NCBI中通过blast找到的对应的基因，其基因序列参见SEQIDNO:7～12。
表1供试洞庭碧螺春茶树品种(系)来源和原产地
表2参照茶树品种(系)来源和原产地
表3商品碧螺春茶来源
2、EST-SNP的开发
在NCBIGenBank中获取(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)茶树EST序列。在NCBI数据库中获得了47789条EST序列，这些序列来源于不同茶树品种、不同组织和器官的cDNA文库。
(1)去除‘噪音’序列：从数据库中直接获取的EST序列往往包含一些低质量的小片段，同时还带有少量载体序列及末端存在polyA/T“尾巴”的序列，去除这些序列；(2)EST数据的聚类和拼接：利用Phrap软件进行聚类和拼接；(3)筛选：利用AutoSNP软件进行筛选，排除旁系同源基因的干扰，并解决测序错误引起的假阳性问题。通过上述方法筛选得到碧螺春的6个SNP位点的基因序列。
碧螺春的6个SNP位点：
3、引物的设计及扩增
使用Primer5.0软件在候选SNP对应的6个基因序列两侧设计引物，引物设计的原则为：长度18-25bp，产物大小为200-600bp，Tm值为50℃-60℃，GC含量在40％-60％之间。共设计了6组引物序列，具体参见序列表SEQIDNO:13～24。
4、基因组DNA提取
采用改良CTAB法从新鲜叶片中提取基因组DNA，其主要操作程序为：
(1)将0.1g左右的茶叶放入研钵中，并加入少量的PVPP，倒入液氮，将叶片充分研磨至白色粉末状，并转移至1.5mL离心管，然后在离心管中加入0.6mL预热的CTAB提取液(2％CTAB，0.1MTris，20mMEDTA，1.4MNacl，pH8.0)并充分震荡混匀，65℃水浴一小时，期间不断震荡混匀。
(2)在离心管中加入等体积的氯仿异戊醇混合液(氯仿：异戊醇＝24:1)，充分混匀，室温静置5min。
(3)使用离心机在4℃下10000rpm离心10min，吸上清液至新离心管，加入等体积的氯仿异戊醇混合液，混匀后静置5min。
(4)使用离心机在4℃下10000rpm离心10min，吸上清液至新离心管，加入等体积的异丙醇混匀后在-20℃下放置1h以上。
(5)使用离心机在4℃下5000rpm离心5min，弃上清液收集沉淀。
(6)在离心管中加入高盐缓冲液(10mMTris，0.1mMEDTA，1MNaCl，pH8.0)，在65℃水浴，溶解沉淀。
(7)使用离心机在4℃下10000rpm离心5min，吸上清液于新离心管。
(8)在管中加入1/10体积NaAc(pH5.2)及2/3体积异丙醇，混匀，在-20℃放20min。
(9)使用离心机在4℃下5000rpm离心5min，弃上清液，收集沉淀。
(10)使用70％的乙醇洗涤沉淀3次，倒置离心管于吸水纸上，干燥沉淀。
(11)使用300μL超纯水(ddH2O)溶解沉淀，加入0.5RNase使RNA降解。
(12)使用NanoDropND-1000分光光度计(Thermofisherscientific,USA)测定浓度和纯度。
(13)使用1％琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的质量。
5、PCR扩增及检测
PCR反应在Bio-RadDNAEngineDyadPCR仪上进行，反应体系及反应程序如下：将上述的6对引物分别进行下述PCR反应，分别得到6个PCR产物。6个基因对应的PCR退火温度依次为：55℃、52℃、54℃、52℃、52℃、53℃。
反应程序为：
得到的6组PCR产物分别经1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测，目的条带使用AxyPrepDNAGelExtractionKit(AxygenCorp.)进行回收。吸取5μL回收产物，用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测有无目的片段，若有则将回收产物置于-20℃下保存备用。
6、大肠杆菌感受态DH5α的制备及转化
(1)取大肠杆菌感受态(TaKaRa，Japan)与冰上溶化，将溶液全部加入至5mL的LB液体培养基中，于恒温摇床中37℃下220rpm振荡培养过夜；
(2)将5mL菌液全部转移至含有100mL的LB液体培养基的150mL锥形瓶中，于恒温摇床中37℃下220rpm振荡培养2～3h，至OD600为0.4～0.5(细菌个数小于108个/mL)；
(3)将菌液转移至灭菌的50mL离心管中，冰上放置10min；
(4)4℃下4000rpm离心10min，倒出培养液，将离心管置于超净工作台中倒置约1min以便培养液流尽，回收管底沉淀；
(5)加入冷的20mmol/L的CaCl210mL悬浮沉淀，于冰上放置30min；
(6)4℃下4000rpm离心10min，回收管底细菌；
(7)加入冷的20mmol/L的CaCl2(预先加入15％甘油)2mL悬浮沉淀；
(8)用冻存管封装感受态细胞，每份100μL-150μL；
(9)将感受态细胞用液氮速冻后，于-70℃下保存待用。
1.3.4.3感受态转化、测序与比对
将1.2.4.1中回收得到的目标片段(约1500bp)与pMDl8-TVector载体进行连接，连接体系如下：
将上述反应液于16℃下连接3h后，用于大肠杆菌感受态DH5α的转化：
(1)将感受态细胞取出至冰上融化，然后将5μL连接液加入至感受态细胞中，混匀；
(2)冰浴达30min后，于42℃水浴热激90s，再迅速于冰上放置5min；
(3)加入灭菌的LB液体培养基1mL后，用封口膜密封后，置于恒温摇床中37℃下220rpm振荡培养1h；
(4)培养1h后，4℃12000rpm离心1min。
(5)用移液器吸取上清液1mL，将剩余的溶液吸打混匀，吸取菌液用L形涂布棒均匀涂布于LB(含0.1％Amp)固体培养基上；
(6)将培养皿倒置于恒温培养箱中37℃黑暗培养至有菌落长出(约8～12h)。
(7)用灭菌的牙签挑取平板上的单菌落至3mL预先加入0.1％Amp的液态LB培养基中，于37℃下220rpm振荡培养8～12h；
将上述菌液用PCR反应(反应体系为10μL，反应程序不变)和琼脂糖凝胶电泳验证是否转化成功。若能检测到目的条带，则说明大肠杆菌转化成功。将能检测到目的条带的菌液送至南京金斯瑞生物公司进行测序。将测序结果用DNAMAN进行分析。
7、数据处理与分析
将扩增产物测序结果与碧螺春序列比对，所述的碧螺春的碱基序列如序列表中SEQIDNO：25～30所示的碱基序列，当扩增产物的序列与SEQIDNO：25～30所示的碱基序列的相似性较高，且在6个SNP位点碱基相同，该待鉴定样品为碧螺春；否则，不是碧螺春。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种碧螺春商品茶的分子鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）确定碧螺春茶叶样品的6个SNP位点，在NCBI中通过blast找到的对应的6个基因序列；
2）引物的设计；根据找到的6个基因序列，按照同源克隆的方法，找到近缘植物，并进行序列的比对，找到同源性较高的片段区域，设计这6个基因片段的上下游引物；
3）基因组DNA提取；
4）PCR扩增及检测；
5）将扩增产物测序后与碧螺春母树品种条形码比对，碧螺春母树品种条形码的碱基序列如SEQIDNO：25~30所示，扩增产物的SNP序列与碧螺春母树品种条形码所示的差异碱基序列的相似性达到99.5%以上，则该待鉴定样品为碧螺春品种。
2.根据权利要求1所述的一种碧螺春商品茶的分子鉴定方法，其特征在于，所述引物的设计长度18-25bp，产物大小为200-600bp，Tm值为50℃-60℃，GC含量在40%-60%之间。
3.根据权利要求1所述的一种碧螺春商品茶的分子鉴定方法，其特征在于，所述基因组DNA提取采用改良CTAB法从新鲜叶片中提取基因组DNA，其主要操作步骤为：
1）将0.1g的茶叶放入研钵中，并加入少量的PVPP，倒入液氮，将叶片充分研磨至白色粉末状，并转移至1.5mL离心管，然后在离心管中加入0.6mL预热的CTAB提取液并充分震荡混匀，65℃水浴一小时，期间不断震荡混匀；
2）在离心管中加入等体积的氯仿异戊醇混合液，充分混匀，室温静置5min；
3）使用离心机在4℃下10000rpm离心10min，吸上清液至新离心管，加入等体积的氯仿异戊醇混合液，混匀后静置5min；
4）使用离心机在4℃下10000rpm离心10min，吸上清液至新离心管，加入等体积的异丙醇混匀后在-20℃下放置1h以上；
5）使用离心机在4℃下5000rpm离心5min，弃上清液收集沉淀；
6）在离心管中加入高盐缓冲液，在65℃水浴，溶解沉淀；
7）使用离心机在4℃下10000rpm离心5min，吸上清液于新离心管；
8）在管中加入1/10体积NaAc及2/3体积异丙醇，混匀，在-20℃放20min；
9）使用离心机在4℃下5000rpm离心5min，弃上清液，收集沉淀；
10）使用70%的乙醇洗涤沉淀3次，倒置离心管于吸水纸上，干燥沉淀；
11）使用300μL超纯水溶解沉淀，加入0.5RNase使RNA降解；
12）使用NanoDropND-1000分光光度计测定浓度和纯度；
13）使用1%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的质量。
4.根据权利要求1所述的一种碧螺春商品茶的分子鉴定方法，其特征在于，所述PCR扩增反应程序为：94℃预变性10min；然后进入循环，每个循环94℃变性30sec，52~55℃退火30sec，72℃延伸90sec，共35个热循环，最后延伸72℃延伸10min；4℃冷却后取出扩增产物。
5.根据权利要求3所述的一种碧螺春商品茶的分子鉴定方法，其特征在于，所述步骤2）中氯仿：异戊醇的比例为氯仿：异戊醇=24:1。
6.根据权利要求3所述的一种碧螺春商品茶的分子鉴定方法，其特征在于，所述步骤6）中高盐缓冲液为10mMTris，0.1mMEDTA，1MNaCl，pH8.0。
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