CN108034754B - 利用ssr指纹图谱鉴别紫嫣茶树新品种的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种利用SSR指纹图谱鉴别紫嫣茶树新品种的方法，该方法包括以下步骤：提取茶样品总DNA，以提取的DNA为模板，采用12对SSR标记引物分别对其进行PCR扩增，PCR扩增产物经电泳和染色，判断目标条带呈“纯合”或“杂合”的状态，形成指纹图谱，然后进行紫嫣品种的鉴定。本发明采用12对SSR标记引物对样品进行PCR扩增、电泳、染色，然后观察其带型，只需判断带型为“纯合”或“杂合”两种状态，不需要和确定的紫嫣样品同时进行上述操作来进行比对。该鉴定方法操作简单快捷，常规实验室仪器设备即可完成，鉴定结果可靠，对于特色茶树新品种紫嫣的保护和推广等具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于茶树育种领域，具体涉及一种利用SSR指纹图谱鉴别紫嫣茶树新品种的方法。
背景技术
紫嫣为无性系茶树品种，属于灌木型，中叶类，晚生种，是四川农业大学茶学系和四川一枝春茶业有限公司从乐山市沐川县李家山的野生茶树资源中经单株育种法选育而成的品种。紫嫣于2017年9月获得农业部植物新品种保护授权(授权号CNA20120455.2)，其特征在于新梢芽叶和嫩茎均呈深紫色，一芽二叶其新梢花色苷含量最高可达到干重的3.0％以上，显著高于其他常规茶树品种(0.01-0.5％)。研究表明花色苷抗氧化能力较强，具有抗过敏、抑制癌变发生率、预防神经和心血管系统疾病、预防糖尿病等功效；同时花色苷在热水中溶解性好，可通过饮茶有效摄取。此外紫嫣品种还具有产量高、抗寒性强等优点。因此以紫色为特点、富含天然花色苷的紫嫣茶树品种和以其作为原料的茶产品具有极大的市场推广前景。
当前茶树育苗技术简单、市场准入门槛低、品种繁多杂乱，存在以假乱真、品种不纯的现象。由于紫嫣高花青素及紫色芽叶的性状仅出现在幼嫩新梢中，且易受季节和种植环境的影响，通过形态特征较难辨别无性系茶树苗是否为紫嫣品种。因此开发一种简单、有效的品种鉴别技术具有重要意义。另外，由于茶树可采用“短穗扦插”技术进行快速繁殖，优异品种一旦流入市场，将很难控制其传播。因此准确的品种鉴定手段对于保护育种人员的权益非常重要。
发明内容
针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种利用SSR指纹图谱鉴别紫嫣茶树新品种的方法，可以更准确地从植物基因的分子水平鉴别紫嫣茶树新品种资源。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
利用SSR指纹图谱鉴别紫嫣茶树新品种的方法，包括以下步骤：
(1)提取茶样品总DNA；
(2)以提取的DNA为模板，采用12对SSR引物同时对模板进行PCR扩增；其中，该12对SSR引物按分别为TM056引物、TM162引物、CSFM1585引物、CsFM1349引物、TM618引物、CsFM1107引物、CsFM1703引物、CsFM1565引物、TM466引物、CsFM1609引物、CsFM1820引物和TM200引物，其序列如下：
TM056引物序列：
上游引物：5’-TTGTTGGGTAGCTTTACTTGC-3’(SEQ ID NO:1)
下游引物：5’-TCAGGACGATTATGAGGATTA-3’(SEQ ID NO:2)
TM162引物序列：
上游引物：5’-ATCGCACAGACTCTCACG-3’(SEQ ID NO:3)
下游引物：5’-AGGCTTTTACTTCTCACAAC-3’(SEQ ID NO:4)
CSFM1585引物序列：
上游引物：5’-CCAAAGAGATTGCTCCCTCA-3’(SEQ ID NO:5)
下游引物：5’-TTCGTCCTCCTCTTCTGCAT-3’(SEQ ID NO:6)
CsFM1349引物序列：
上游引物：5’-TGGGCCAGAAGAGAAAAGAA-3’(SEQ ID NO:7)
下游引物：5’-GGTGTTCCTGGCACTTCAAT-3’(SEQ ID NO:8)
TM618引物序列：
上游引物：5’-CTGCGATTGCTGTTGTTGTT-3’(SEQ ID NO:9)
下游引物：5’-TGATCGTGGTCACAGACGTT-3’(SEQ ID NO:10)
CsFM1107引物序列：
上游引物：5’-ACTATCTCATGGCAGCCCAC-3’(SEQ ID NO:11)
下游引物：5’-TTGGGAATGAAAGGAACTGG-3’(SEQ ID NO:12)
CsFM1703引物序列：
上游引物：5’-AATCACAGAACATCCTCGCC-3’(SEQ ID NO:13)
下游引物：5’-TCATACGCGACTGCAAGTTC-3’(SEQ ID NO:14)
CsFM1565引物序列：
上游引物：5’-CAAATTTTGTCGTCGTCGTG-3’(SEQ ID NO:15)
下游引物：5’-TCGCCTAAATTCGTGAGCTT-3’(SEQ ID NO:16)
TM466引物序列：
上游引物：5’-AGTGGTTCCGACAAATCAGG-3’(SEQ ID NO:17)
下游引物：5’-ATTGCCTCAGCATTGGATTC-3’(SEQ ID NO:18)
CsFM1609引物序列：
上游引物：5’-GCAAAGAATTCAGCTCAGCC-3’(SEQ ID NO:19)
下游引物：5’-CCCCCAAAGTTCATTCTTCA-3’(SEQ ID NO:20)
CsFM1820引物序列：
上游引物：5’-TTTCGATGGGAATAAGCTCG-3’(SEQ ID NO:21)
下游引物：5’-TGAATCATCAATGGCTTCCA-3’(SEQ ID NO:22)
TM200引物序列：
上游引物：5’-TTATCCAGCCAGCTTTGT-3’(SEQ ID NO:23)
下游引物：5’-TATTGAAACCGCTTGTCG-3’(SEQ ID NO:24)；
(3)PCR扩增产物经电泳和染色，形成SSR指纹图谱，然后进行紫嫣品种的鉴定：在目标条带区域，若同时满足采用TM056引物、TM162引物、CSFM1585引物、CsFM1349引物、TM618引物、CsFM1107引物扩增出的目标条带分别在220-280bp、200-250bp、160-210bp、150-190bp、150-180bp和120-170bp范围内均为一条条带和采用CsFM1703引物、CsFM1565引物、TM466引物、CsFM1609引物、CsFM1820引物和TM200引物扩增出的目标条带分别在180-240bp、180-240bp、180-220bp、150-200bp、150-200bp和130-180bp范围内均为两条条带，则判定该样品为紫嫣品种，若不同时满足，则判定该样品不是紫嫣品种。
进一步地，步骤(2)中PCR反应体系为：1×PCR缓冲液、200μM dNTP、0.5U Taq聚合酶、0.2μM引物和40ng DNA模板，总体积为10-50μl；PCR反应程序为：94℃预变性4min，4℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，循环35次，最后72℃延伸10min。
进一步地，步骤(3)中PCR扩增进行电泳时，点样顺序依次为：Mark、TM056引物扩增产物、TM162引物扩增产物、CSFM1585引物扩增产物、CsFM1349引物扩增产物、TM618引物扩增产物、CsFM1107引物扩增产物、CsFM1703引物扩增产物、CsFM1565引物扩增产物、TM466引物扩增产物、CsFM1609引物扩增产物、CsFM1820引物扩增产物和TM200引物扩增产物。
本发明提供的利用SSR指纹图谱鉴别紫嫣茶树新品种的引物及方法，具有以下有益效果：
(1)本发明提供的12对SSR标记引物在紫嫣个体上表现出特定的带型，既有明显可辨别的特征，又能和其他品种有很高的区分度，采用本发明方法可简单、准确的鉴定样品是否为紫嫣品种。
(2)本发明的判断依据为采用12对SSR标记引物对样品进行PCR扩增、跑电泳、染色，然后观察其带型，只需判断带型为“纯合(即一条条带)”或“杂合(即两条条带)”两种状态，不需要和确定的紫嫣样品同时进行上述操作来进行比对。在应用实践中完全确定的紫嫣品种样品不易获得，因此这个特点将扩大本发明的应用范围。
(3)本发明对所测试的材料选择不受季节、环境、测试时间限制，适用于生长时期内的任意组织，包括芽、叶、花、根等，或已制作好储存一段时间的成品茶进行DNA提取，均不会影响鉴定效果。
(4)本发明对实验条件的要求为常规分子实验设备(主要包括PCR仪、电泳仪等)，不需要毛细管电泳系统、荧光信号检测仪等复杂设备；本发明所使用的引物为普通引物，不需要合成高成本的荧光标记引物。因此该方法具有简单、快速、成本低、适用范围广等优点。
(5)本发明中12对引物的排列顺序是经过特意编排的，使其具有以下特征：在“纯合”(或“杂合”)组中从左至右各标记的目标条带依次靠下，这一特征简化了判断标准，方便记忆，也可以作为判断测试样品是否为紫嫣品种的辅助证据，也有助于排除非特异扩增片段对于结果的干扰。
附图说明
图1为采用12对SSR引物在紫嫣茶样品中扩增出的电泳图。
图2为采用12对SSR引物在非紫嫣茶样品(龙井长叶)中扩增出的电泳图。
图3为采用12对SSR引物在非紫嫣茶样品(浙农117)中扩增出的电泳图。
具体实施方式
在利用SSR指纹图谱鉴别紫嫣茶树新品种的方法之前，首先要做的准备工作是选择适宜的引物，具体为：以紫嫣品种的DNA为模板，采用600对茶树SSR标记引物对其进行PCR扩增，经聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选出30对带型为“纯合”且条带清晰的引物和30对带型为“杂合”且条带清晰、两条带间距较大的引物(每个电泳孔最下方的明亮条带为目标条带，纯合只有一条目标条带，杂合有两条目标条带)，然后用上述60对引物，以30个常见的无性系茶树品种的DNA为模板进行PCR扩增并电泳，分别从30对紫嫣基因型为“纯合”的引物中筛选出6对“杂合”比例最高的引物，从30对紫嫣基因型为“杂合”的引物中筛选出6对“纯合”比例最高的引物，共同构成本发明所使用的12对SSR引物，最后将这12对引物根据它们在紫嫣中的带型，分为“纯合”和“杂合”两组，又根据目标条带在电泳胶上的相对位置(条带长度)由高到低进行排序，得到12对引物的编号顺序。
实施例1
1、使用试剂及茶品种
DNA提取使用北京天根植物基因组快速提取试剂盒；PCR反应试剂购于成都擎科梓熙生物技术有限公司；所测试的茶树品种见表1，各品种叶片样品采自四川名山茶树良种繁育场品种资源圃。
表1供试的30个茶树品种
2、对SSR标记引物进行编号
将12对SSR标记引物根据它们在紫嫣中的带型，分为“纯合”和“杂合”两组，又根据目标条带在电泳胶上的相对位置(条带长度)由高到低进行排序，得到12对引物的编号顺序，编号1-10的引物序列依次如下：
1号TM056引物序列：
上游引物：5’-TTGTTGGGTAGCTTTACTTGC-3’(SEQ ID NO:1)
下游引物：5’-TCAGGACGATTATGAGGATTA-3’(SEQ ID NO:2)
2号TM162引物序列：
上游引物：5’-ATCGCACAGACTCTCACG-3’(SEQ ID NO:3)
下游引物：5’-AGGCTTTTACTTCTCACAAC-3’(SEQ ID NO:4)
3号CSFM1585引物序列：
上游引物：5’-CCAAAGAGATTGCTCCCTCA-3’(SEQ ID NO:5)
下游引物：5’-TTCGTCCTCCTCTTCTGCAT-3’(SEQ ID NO:6)
4号CsFM1349引物序列：
上游引物：5’-TGGGCCAGAAGAGAAAAGAA-3’(SEQ ID NO:7)
下游引物：5’-GGTGTTCCTGGCACTTCAAT-3’(SEQ ID NO:8)
5号TM618引物序列：
上游引物：5’-CTGCGATTGCTGTTGTTGTT-3’(SEQ ID NO:9)
下游引物：5’-TGATCGTGGTCACAGACGTT-3’(SEQ ID NO:10)
6号CsFM1107引物序列：
上游引物：5’-ACTATCTCATGGCAGCCCAC-3’(SEQ ID NO:11)
下游引物：5’-TTGGGAATGAAAGGAACTGG-3’(SEQ ID NO:12)
7号CsFM1703引物序列：
上游引物：5’-AATCACAGAACATCCTCGCC-3’(SEQ ID NO:13)
下游引物：5’-TCATACGCGACTGCAAGTTC-3’(SEQ ID NO:14)
8号CsFM1565引物序列：
上游引物：5’-CAAATTTTGTCGTCGTCGTG-3’(SEQ ID NO:15)
下游引物：5’-TCGCCTAAATTCGTGAGCTT-3’(SEQ ID NO:16)
9号TM466引物序列：
上游引物：5’-AGTGGTTCCGACAAATCAGG-3’(SEQ ID NO:17)
下游引物：5’-ATTGCCTCAGCATTGGATTC-3’(SEQ ID NO:18)
10号CsFM1609引物序列：
上游引物：5’-GCAAAGAATTCAGCTCAGCC-3’(SEQ ID NO:19)
下游引物：5’-CCCCCAAAGTTCATTCTTCA-3’(SEQ ID NO:20)
11号CsFM1820引物序列：
上游引物：5’-TTTCGATGGGAATAAGCTCG-3’(SEQ ID NO:21)
下游引物：5’-TGAATCATCAATGGCTTCCA-3’(SEQ ID NO:22)
12号TM200引物序列：
上游引物：5’-TTATCCAGCCAGCTTTGT-3’(SEQ ID NO:23)
下游引物：5’-TATTGAAACCGCTTGTCG-3’(SEQ ID NO:24)。
3、利用SSR指纹图谱鉴别紫嫣茶树新品种的方法，具体包括以下步骤：
(1)采用CTAB法或试剂盒提取待测茶叶片或干茶样品的基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的DNA为模板，采用上述12对引物分别对其进行PCR扩增；PCR反应体系为：1×PCR缓冲液、200μM dNTP、0.5U Taq聚合酶、0.2μM引物和约40ng DNA模板，总体积为15μl；PCR反应程序为：94℃预变性4min，4℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，循环35次，最后72℃延伸10min。
(3)配制配制8％聚丙烯酰胺，然后按照8％聚丙烯酰胺：APS：TEMED＝1000:10:1的比例，配胶，然后灌胶，凝胶，最后移去梳子，向电泳槽中加入0.5×TBE缓冲液，然后向凝胶孔中加入2μl PCR扩增产物，点样顺序按照上述引物顺序进行，然后在160V电压下，电泳100min，最后银染显色，形成SSR指纹图谱，对这些带型进行统计，“纯合”带型记为“1”，“杂合”带型记为“2”，如带型缺失则记为“0”。12对引物的带型按顺序排列，结果见表2。
表2 30个茶品种基因型结果
| 序号 | 品种名称 | 基因型 | 序号 | 品种名称 | 基因型 |
| 1 | 川农黄芽早 | 120211 222121 | 16 | 平阳特早 | 222210 111222 |
| 2 | 川沐28 | 122112 222222 | 17 | 安吉白茶 | 221112 111221 |
| 3 | 蒙山11 | 211121 222212 | 18 | 菊花香 | 222211 111212 |
| 4 | 名山特早 | 122221 112212 | 19 | 黄叶早 | 122122 112211 |
| 5 | 南江4号 | 122121 122221 | 20 | 乌牛早 | 211212 111121 |
| 6 | 马边绿 | 212112 222221 | 21 | 四明雪芽 | 222212 221212 |
| 7 | 川黄1号 | 222122 122121 | 22 | 黄叶水仙 | 112221 012222 |
| 8 | 川茶2号 | 121111 121211 | 23 | 紫牡丹 | 112112 222211 |
| 9 | 南江1号 | 211221 122222 | 24 | 梅占 | 022222 212222 |
| 10 | 中茶302 | 211122 111221 | 25 | 福鼎大白茶 | 111222 211112 |
| 11 | 龙井43 | 122212 221111 | 26 | 铁观音 | 112221 222222 |
| 12 | 迎霜 | 120112 112212 | 27 | 黔湄409 | 111222 122222 |
| 13 | 浙农117 | 122111 112211 | 28 | 黔湄502 | 211221 121222 |
| 14 | 龙井长叶 | 112222 112121 | 29 | 白毫早 | 112111 112221 |
| 15 | 浙农113 | 222112 112221 | 30 | 紫鹃 | 222221 212222 |
采用上述方法鉴别紫嫣品种的标准为：如果1-6号引物对的目标条带(每个电泳孔最下方的明亮条带为目标条带)的带型均为“纯合”(即分别在220-280bp、200-250bp、160-210bp、150-190bp、150-180bp和120-170bp范围内扩增出一条条带)，同时7-12号引物对的带型均为“杂合”(即分别在180-240bp、180-240bp、180-220bp、150-200bp、150-200bp和130-180bp范围内扩增出两条条带)，则表明待测样品(品种)为紫嫣品种(从左往右，目标条带位置依次靠下)；如果不完全一致，即1-6号引物对中出现“杂合”带型或者7-12号引物对中出现“纯合”带型，则表明待测样品(品种)为非紫嫣品种。
由表2可以看出，30个非紫嫣的茶树品种的带型明显与紫嫣明显不同。
我们采用上述提供的12对SSR引物对紫嫣茶树品种进行PCR扩增，其电泳图见图1，如果“纯合”带型记为“1”，“杂合”带型记为“2”，则紫嫣的基因型可记为“111111 222222”。
图2为采用上述提供的12对SSR引物在非紫嫣茶样品(龙井长叶)中扩增出的电泳图，其基因型可记为“112222 112121”，可以看出12个标记中有8个的基因型与紫嫣不同，因此可判定为非紫嫣品种。
图3为采用上述提供的12对SSR引物在非紫嫣茶样品(浙农117)中扩增出的电泳图，其基因型可记为“122111 112211”，可以看出12个标记中有6个的基因型与紫嫣不同，因此可判定为非紫嫣品种。
采用上述方法可得出这30个品种的基因型数据，根据这些基因型数据还可以大概估算一个随机样品在12个位点均与紫嫣相同的概率P。
P＝前六个标记呈“纯合”概率之积×后六个标记呈“杂合”概率之积
＝(0.5333×0.4516×0.3448×0.4839×0.5000×0.4667)×
(0.4000×0.4839×0.6774×0.8065×0.6774×0.5161)
＝0.000347
根据计算结果可估算：随机抽取1000份不同的茶树品种样品，其中在本发明筛选的12个SSR标记基因型(用0,1,2表示)与紫嫣相同的样本约为0.347个。由于当前市面上的无性系茶树品种少于1000个，因此本发明的方法可以保证准确无误地鉴定紫嫣品种的真实性。
综上所述，本发明提供的方法比传统根据外观形态判断的方法更准确，与其他常规分子标记方法或指纹图谱方法相比，本发明方法更直观、简单、快捷。
序列表
<110> 四川农业大学
<120> 利用SSR指纹图谱鉴别紫嫣茶树新品种的方法
<160> 24
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttgttgggta gctttacttg c 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tcaggacgat tatgaggatt a 21
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atcgcacaga ctctcacg 18
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aggcttttac ttctcacaac 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccaaagagat tgctccctca 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ttcgtcctcc tcttctgcat 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tgggccagaa gagaaaagaa 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggtgttcctg gcacttcaat 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ctgcgattgc tgttgttgtt 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tgatcgtggt cacagacgtt 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
actatctcat ggcagcccac 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ttgggaatga aaggaactgg 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
aatcacagaa catcctcgcc 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tcatacgcga ctgcaagttc 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
caaattttgt cgtcgtcgtg 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tcgcctaaat tcgtgagctt 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
agtggttccg acaaatcagg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
attgcctcag cattggattc 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gcaaagaatt cagctcagcc 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
cccccaaagt tcattcttca 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tttcgatggg aataagctcg 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tgaatcatca atggcttcca 20
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<212> DNA
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
tattgaaacc gcttgtcg 18
Claims (3)
1.利用SSR指纹图谱鉴别紫嫣茶树新品种的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取茶样品总DNA；
(2)以提取的DNA为模板，采用12对SSR引物同时对模板进行PCR扩增；其中，该12对SSR引物分别为TM056引物、TM162引物、CSFM1585引物、CsFM1349引物、TM618引物、CsFM1107引物、CsFM1703引物、CsFM1565引物、TM466引物、CsFM1609引物、CsFM1820引物和TM200引物，其序列如SEQ ID NO:1-24所示；
(3)PCR扩增产物经电泳和染色，形成SSR指纹图谱，然后进行紫嫣品种的鉴定，鉴定标准为：若同时满足采用TM056引物、TM162引物、CSFM1585引物、CsFM1349引物、TM618引物、CsFM1107引物扩增出的目标条带分别在220-280bp、200-250bp、160-210bp、150-190bp、150-180bp和120-170bp范围内均为一条条带和采用CsFM1703引物、CsFM1565引物、TM466引物、CsFM1609引物、CsFM1820引物和TM200引物扩增出的目标条带分别在180-240bp、180-240bp、180-220bp、150-200bp、150-200bp和130-180bp范围内均为两条条带，则判定该样品为紫嫣品种，若不同时满足，则判定该样品不是紫嫣品种。
2.根据权利要求1所述的利用SSR指纹图谱鉴别紫嫣茶树新品种的方法，其特征在于，步骤(2)中PCR反应体系为：1×PCR缓冲液、200μM dNTP、0.5U Taq聚合酶、0.2μM引物和40ngDNA模板，总体积为10-50μl；PCR反应程序为：94℃预变性4min；4℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，循环35次，最后72℃延伸10min。
3.根据权利要求1所述的利用SSR指纹图谱鉴别紫嫣茶树新品种的方法，其特征在于，步骤(3)中PCR扩增进行电泳时，点样顺序依次为：Marker、TM056引物扩增产物、TM162引物扩增产物、CSFM1585引物扩增产物、CsFM1349引物扩增产物、TM618引物扩增产物、CsFM1107引物扩增产物、CsFM1703引物扩增产物、CsFM1565引物扩增产物、TM466引物扩增产物、CsFM1609引物扩增产物、CsFM1820引物扩增产物和TM200引物扩增产物。
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