CN108728572B - 一种标定四季茶花杂交新品种分子身份证的标记方法 - Google Patents

一种标定四季茶花杂交新品种分子身份证的标记方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108728572B
CN108728572B CN201810587311.0A CN201810587311A CN108728572B CN 108728572 B CN108728572 B CN 108728572B CN 201810587311 A CN201810587311 A CN 201810587311A CN 108728572 B CN108728572 B CN 108728572B
Authority
CN
China
Prior art keywords
primer
variety
camellia
ssr
identity card
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201810587311.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108728572A (zh
Inventor
刘信凯
张文驹
陶乃奇
严丹峰
钟乃盛
叶土生
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangzhou Zongke Gardening Development Co ltd
Palm Eco Town Development Co ltd
Fudan University
Original Assignee
Guangzhou Zongke Gardening Development Co ltd
Palm Eco Town Development Co ltd
Fudan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangzhou Zongke Gardening Development Co ltd, Palm Eco Town Development Co ltd, Fudan University filed Critical Guangzhou Zongke Gardening Development Co ltd
Priority to CN201810587311.0A priority Critical patent/CN108728572B/zh
Publication of CN108728572A publication Critical patent/CN108728572A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108728572B publication Critical patent/CN108728572B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种标定四季茶花杂交新品种分子身份证的标记方法，包括步骤：提取待新品种的基因组DNA；进行SSR位点筛选、引物设计和各SSR位点的多态性检测；在各SSR位点的正向引物的5’端加上能与荧光标记结合的M13接头序列，反向引物序列不变，并进行引物合成，进行DNA样品PCR扩增后测序，获得的目标片段的数据，基因型；将这些基因型数据转换为数字或字母编码作为各品种的分子身份证，并用该分子身份证来标定各茶花品种。本发明将荧光标记SSR技术和分子身份证构建技术应用于茶花新品种的鉴定工作中，能精确、可靠和高效的鉴别不同品种，并为每个品种构建一个唯一的分子身份证。

Description

一种标定四季茶花杂交新品种分子身份证的标记方法
【技术领域】
本发明涉及一种标定四季茶花杂交新品种分子身份证的标记方法，属于分子生物学领域的标记。
【背景技术】
山茶是我国传统名花，因叶色青翠、花色鲜艳，深受大众喜爱。据国际茶花协会统计，现有茶花品种2万多个，我国仅有800多个，目前，国内市场上常见的茶花大多以国外引进的品种为主，喜阴怕晒，环境要求苛刻，栽培要求高，极大地制约了茶花市场的发展。四季茶花新品种是棕榈生态城镇发展股份有限公司培育的全新一代茶花品种群，具有花色鲜艳、花型丰富、长势健壮、抗逆性强、管理粗放等优点，具有极大的市场开发应用潜力。而在开发应用过程中，品种权的保护具有重要意义。将不同的茶花品种进行品种标定后，不仅能对茶花品种进行保护，防止他人盗取或冒充的现象，还能保护育种者和生产者的合法权益。由于四季茶花杂交新品种是在亲本杂交获得子代后，用子代的枝条或芽以扦插或嫁接的方式进行繁殖，同一品种的后代具有相同的基因型，因此可用基因型来标定不同的茶花品种。
目前，因荧光标记SSR能精确获得目标DNA片段的大小，检测结果稳定、准确和高效，且适用于大批量品种的基因型标定。此外，将各品种在不同SSR位点获得的基因型赋值为数字或字母后，将这些数字化的位点串联形成字符串形式的编码，即将各SSR位点获得的基因型转化为数字化的“分子身份证”的形式来标定各品种。故可将其用于四季茶花杂交新品种的品种标定和品种权保护。而整个品种标定过程是以各品种在各SSR位点获得的不同基因型为基础构建的，故具有多态性的SSR位点的筛选和引物的设计是标定四季茶花杂交新品种的技术关键。而本技术发明正是要解决这一关键问题，开发用于四季茶花杂交新品种标定的SSR引物，并结合分子身份证的方法来标定茶花新品种，即通过数字化的方法，使得每个品种都拥有一个属于自己的字符串形式的代码，达到更加简单明了区分不同品种和对品种进行品种权保护的目的。
【发明内容】
本发明目的是填补现有技术的空白，提供一种标定四季茶花杂交新品种分子身份证的标记方法，用荧光标记SSR和分子身份证对四季茶花杂交新品种进行品种标定，为每个品种构建唯一的分子身份证，对其品种权保护提供相关的遗传信息，同时也为其他以扦插或嫁接的方式进行扩殖的山茶新品种的标定和品种权的保护提供参考。
本发明为实现上述目的，采用以下技术方案：
一种标定四季茶花杂交新品种分子身份证的标记方法，所述方法步骤如下：
(1)待标定四季茶花杂交新品种的基因组DNA的提取；
(2)进行SSR位点筛选、引物设计和各SSR位点的多态性检测；
(3)根据步骤(2)获得具有多态性的SSR位点，在各SSR位点的正向引物的5’端加上能与荧光标记结合的M13接头序列，反向引物序列不变，并进行引物合成，将其用于待标定茶花品种DNA样品的PCR扩增，对扩增产物进行毛细管电泳检测，获得测序数据后，用GeneMarker 2.2.0软件读取各SSR位点在各品种中获得的目标片段的数据，获得各品种在各SSR位点的基因型；
(4)根据步骤(3)获得的各品种在各SSR位点的基因型数据，将这些基因型数据转换为数字或字母编码作为各品种的分子身份证，并用该分子身份证来标定各茶花品种。
进一步的，本发明步骤(1)中，用于提取基因组DNA的材料为硅胶干燥的无病害的嫩叶片材料或新鲜无病害的嫩叶片材料。
进一步的，本发明步骤(2)中的方法包括以下步骤：
a、从杂交亲本杜娟红山茶转录组数据中开发获得SSR位点，提取杜鹃红山茶的RNA，并将获得的RNA样品进行测序，获得RNA-seq数据后，利用MISA软件(Microsatelliteidentification tool)扫描这些序列上的SSR位点；
b、SSR引物是用Primer 3.0引物设计程序进行批量设计，引物设计原则：引物长度18-24bp；退火温度50-65℃；上、下游引物的Tm值相差不大于5℃；PCR产物长度100-300bp；GC含量在40％-60％之间，为优化引物设计，用Primer 3.0获得引物后，用Primer Premier5.0进行进一步检验，尽量避免发夹结构，错配，引物二聚体的出现；
c、SSR位点多态性检测，其中，PCR扩增反应体系为10μL，包括：6.15μL 3d H2O、1μL不含Mg2+的10×PCR Buffer缓冲液、0.6μL浓度为25mM的Mg2+、0.8μL浓度为2.5mM的dNTP、0.4μL浓度为10μM的正向引物、0.4μL浓度为10μM的反向引物、0.15μL浓度为5U/μL的Taq酶和0.5μL的DNA模板，PCR反应程序为：94℃预变性3min；循环阶段94℃变性30s、各引物退火温度退火30s、72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min，最后4℃保存，PCR扩增产物先通过琼脂糖胶电泳检测各引物的扩增效率，然后再用8％的聚丙烯酰氨凝胶电泳上检测其多态性，各样品上样量为1.5μL，50bp的DNA Ladder为分子量标准，180V电压下电泳2h，0.1％的AgNO3溶液染色15min，NaOH溶液显色，拍照保存。
优选地，MISA软件(Microsatellite identification tool)搜索参数设置：二核苷酸重复单元的重复次数≥6；三核苷酸重复单元的重复次数≥5；四、五、六核苷酸重复单元的重复次数≥4。单核苷酸及其他核苷酸重复单元由于在应用中较少使用，故未作筛选。
进一步的，步骤(3)中所述的M13接头序列为：5’-CACGACGTTGTAAAACGAC-3’。步骤(3)中PCR扩增反应体系为10μL：6.15μL 3d H2O、1μL不含Mg2+的10×PCR Buffer缓冲液、0.6μL浓度为25mM的Mg2+、0.8μL浓度为2.5mM的dNTP、0.04μL浓度为10μM带M13的正向引物、0.36μL浓度为10μM的M13荧光标记、0.4μL浓度为10μM的反向引物、0.15μL浓度为5U/μL Taq酶和0.5μL的DNA模板，PCR反应程序如下：94℃预变性3min，循环阶段94℃变性30s、各退火温度退火30s、72℃延伸1min，30个循环后，72℃延伸10min，4℃保存。优选地，用于本发明的M13荧光标记有红色(ROX)、绿色(JOE)和蓝色(FAM)三种，但并不仅限于这三种。
进一步的，所述步骤(4)中，本发明将基因型转换为数字或字母编码的标准为：根据每对引物在某个品种扩增出的每种基因型进行赋值1，2，3，……，9表示，为避免每种带型出现两位数字，当带型数大于9时，分别用A，B，C代表第10，11，12种带型，以此类推，0表示无带；
各引物所对应的SSR位点在分子身份证中位置确定标准为：以各引物在品种中获得的目的片段长度的最小值为依据，并按照各引物获得目的片段长度的最小值从小到大的顺序排列来确定各引物所在SSR位点在分子身份证中的位置，而各引物所在SSR位点在分子身份证中的具体数字或字母由该位点在该品种中获得的基因型所决定。将各引物在各品种中获得的基因型赋值后的数字或字母串联后就构成了样品的分子身份证。
本发明与现有技术比较，有以下优点：
1、将荧光标记SSR技术和分子身份证构建技术应用于茶花新品种的鉴定工作中，能精确、可靠和高效的鉴别不同品种，并为每个品种构建一个唯一的分子身份证。
2、本发明利用9对引物将四季茶花新品种品种有效鉴别开，鉴别准确率高达100％，在进一步鉴别四季茶花杂交新品种方面具有很大潜力，与现有专利相比，效果更佳，更节约时间、成本等。
本发明中，以21个四季茶花杂交新品种为例，基于该技术来构建这21个品种的分子身份证，该方法的灵敏度高，能精确的区分1bp及以上的目标片段长度，这21个品种在9对引物所对应的位点都可以获得一个精确的目标片段大小数据。并且通过这9对引物可以精确、可靠的将不同品种区分开来。
【具体实施方式】
以下将结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
应当注意的是,下述实施例中描述的技术特征或者技术特征的组合不应当被认为是孤立的,它们可以被相互组合从而达到更好的技术效果。
实施例：以21个四季茶花杂交新品种为例进一步阐释本发明。表1：参试用21个四季茶花杂交新品种信息
Figure BDA0001689748020000061
标定四季茶花杂交新品种分子身份证的标记方法，包括以步骤：
1、提取表1中21种四季茶花杂交新品种的基因组DNA；
2、进行SSR位点筛选、引物设计和各SSR位点的多态性检测：
a、SSR位点从杂交亲本杜娟红山茶转录组数据中开发获得，提取杜鹃红山茶的RNA，并将获得的RNA样品进行测序，获得RNA-seq数据后，利用MISA软件扫描这些序列上的SSR位点，其中，MISA搜索参数设置：二核苷酸重复单元的重复次数≥6；三核苷酸重复单元的重复次数≥5；四、五、六核苷酸重复单元的重复次数≥4；
b、SSR引物是用Primer 3.0引物设计程序进行批量设计，其设计原则：引物长度18-24bp；退火温度50-65℃；上、下游引物的Tm值相差不大于5℃；PCR产物长度100-300bp；GC含量在40％-60％之间，为优化引物设计，用Primer 3.0获得引物后，用Primer Premier5.0进行进一步检验，尽量避免发夹结构，错配，引物二聚体的出现；
c、SSR位点多态性检测，其中，PCR扩增反应体系为10μL，包括：6.15μL3d H2O、1μL不含Mg2+的10×PCR Buffer缓冲液、0.6μL浓度为25mM的Mg2+、0.8μL浓度为2.5mM的dNTP、0.4μL浓度为10μM的正向引物、0.4μL浓度为10μM的反向引物、0.15μL浓度为5U/μL的Taq酶和0.5μL的DNA模板，PCR反应程序为：94℃预变性3min；循环阶段94℃变性30s、各引物退火温度退火30s、72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min，最后4℃保存，PCR扩增产物先通过琼脂糖胶电泳检测各引物的扩增效率，然后再用8％的聚丙烯酰氨凝胶电泳检测其多态性，各样品上样量为1.5μL，50bp的DNA Ladder为分子量标准，180V电压下电泳2h，0.1％的AgNO3溶液染色15min，NaOH溶液显色，拍照保存；
根据PCR扩增结果和多态性检测，最终从50对引物中筛选出9对PCR容易扩增、位点条带清晰和多态性好的引物(如表2所示)，并将这些引物用于茶花品种的标定。
表2：9对SSR引物信息：
Figure BDA0001689748020000081
3、筛选出的9对引物(表2)没有直接合成荧光引物，而是在每对引物的正向引物的5’加上M13接头序列(5’-CACGACGTTGTAAAACGAC-3’)让其能与荧光标记M13结合，反向引物不变，并进行引物合成，将其用于待标定茶花品种DNA样品的PCR扩增，PCR扩增反应体系为10μL：6.15μL 3d H2O、1μL不含Mg2+的10×PCR Buffer缓冲液、0.6μL浓度为25mM的Mg2+、0.8μL浓度为2.5mM的dNTP、0.04μL浓度为10μM带M13的正向引物、0.36μL浓度为10μM的M13荧光标记、0.4μL浓度为10μM的反向引物、0.15μL浓度为5U/μL Taq酶和0.5μL的DNA模板，PCR反应程序如下：94℃预变性3min，循环阶段94℃变性30s、各退火温度退火30s、72℃延伸1min，30个循环后，72℃延伸10min，4℃保存；对扩增产物进行毛细管电泳检测，获得测序数据后，用Gene Marker 2.2.0软件读取各SSR位点在各品种中获得的目标片段的数据，获得各品种在各SSR位点的基因型；
4、将步骤3获得各品种在各SSR位点的基因型数据按以下标准进行赋值：根据每对引物在某个品种扩增出的每种基因型进行赋值1，2，3，……，9表示，为避免每种基因型出现两位数字，当基因型数大于9时，分别用A，B，C代表第10，11，12种基因型，以此类推，0表示该品种在该引物没有获得基因型；各引物所对应的SSR位点在分子身份证中位置确定标准为：以各引物在品种中获得的目的片段长度的最小值为依据，并按照各引物获得目的片段长度的最小值从小到大的顺序排列来确定各引物所在SSR位点在分子身份证中的位置，而各引物所在SSR位点在分子身份证中的具体数字或字母由该位点在该品种中获得的基因型所决定。赋值结果见表3-1和表3-2。
表3-1
Figure BDA0001689748020000091
表3-2：
Figure BDA0001689748020000101
表3-1，3-2中空格处为各引物可能存在的基因型，但在这21个杂交新品种中未出现的基因型。
根据赋值结果和步骤4中各品种分子身份证构建的标准，便可获得21个新品种的分子身份证，见表4。由表4可看出这21个茶花新品种都具体自己独特的分子身份证，通过这9对SSR引物能将不同的茶花品种标定出。
表4：四季茶花杂交新品种分子身份证编码
Figure BDA0001689748020000102
Figure BDA0001689748020000111
表中编号列为21个山茶杂交新品种的品种编号，分子身份证一列为各品种获得的分子身份证。例如：品种编号为SJ-01的山茶杂交新品种的分子身份证为：195435221，其中从第一位数字到第九位数字表示9对引物在分子身份证中的顺序为：CamSSR08、CamSSR04、CamSSR06、CamSSR01、CamSSR07、CamSSR09、CamSSR05、CamSSR02、CamSSR03；第一位上的数字“1”表示该品种在引物CamSSR08中获得赋值为“1”的基因型，其余位置上的数字以此类推。其他品种的分子身份证的表示方法以此类推。
本发明分子身份证编码可以将不同品种进行有效的区分，在相同位置上，编码相同表示该引物在样品上扩增获得的基因型相同。当然，上述阐述只是基于例举的方式，位点的顺序可以是基于多个不同引物的不同组合。
本方法主要针对四季茶花杂交新品种，对以扦插或嫁接方式进行扩殖的普通茶花杂交新品种也有借鉴作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当理解的是，对于本技术领域普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和修饰，这些改进和修饰都应属于本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种标定四季茶花杂交新品种分子身份证的标记方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）待标定四季茶花杂交新品种的基因组DNA的提取，用于提取基因组DNA的材料为硅胶干燥的无病害的嫩叶片材料或新鲜无病害的嫩叶片材料，参试用21个四季茶花杂交新品信息如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
（2）进行SSR位点筛选、引物设计和各SSR位点的多态性，检测具体包括以下步骤；
a、从杂交亲本杜娟红山茶转录组数据中开发获得SSR位点，提取杜鹃红山茶的RNA，并将获得的RNA样品进行测序，获得RNA-seq数据后，利用MISA软件扫描这些序列上的SSR位点；
b、SSR引物是用Primer 3.0引物设计程序进行批量设计，其设计原则：引物长度18-24bp；退火温度50-65℃；上、下游引物的Tm值相差不大于5℃；PCR产物长度100-300bp；GC含量在40%-60%之间，为优化引物设计，用Primer 3.0获得引物后，用Primer Premier 5.0进行进一步检验，尽量避免发夹结构，错配，引物二聚体的出现；
c、SSR位点多态性检测，其中，PCR扩增反应体系为10µL，包括：6.15µL3d H2O、1µL不含Mg2+ 的10 × PCR Buffer缓冲液、0.6µL 浓度为25mM的Mg2+、0.8µL浓度为2.5mM的dNTP、0.4µL浓度为10µM的正向引物、0.4µL浓度为10µM的反向引物、0.15µL浓度为5U/μL的Taq酶和0.5µL的DNA模板，PCR反应程序为：94℃预变性3min；循环阶段94℃变性30s、各引物退火温度退火30s、72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min，最后4℃保存，PCR扩增产物先通过琼脂糖胶电泳检测各引物的扩增效率，然后再用8%的聚丙烯酰氨凝胶电泳检测其多态性，各样品上样量为1.5µL，50bp的DNA Ladder为分子量标准，180V电压下电泳2h，0.1%的AgNO3溶液染色15min，NaOH溶液显色，拍照保存；
筛选出的9对SSR引物信息如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE004
（3）根据步骤（2）获得具有多态性的SSR位点，在各SSR位点的正向引物的5’端加上能与荧光标记结合的M13接头序列，反向引物序列不变，并进行引物合成，将其用于待标定茶花品种DNA样品的PCR扩增，对扩增产物进行毛细管电泳检测，获得测序数据后，用GeneMarker 2.2.0软件读取各SSR位点在各品种中获得的目标片段的数据，获得各品种在各SSR位点的基因型；
（4）根据步骤（3）获得的各品种在各SSR位点的基因型数据，将这些基因型数据转换为数字或字母编码来表示各品种的分子身份证，并用该分子身份证来标定各茶花品种，将基因型数据转换为数字或字母编码的标准为：
根据每对引物在某个品种扩增出的每种基因型进行赋值1，2，3，……，9表示，为避免每种基因型出现两位数字，当基因型数大于9时，分别用A，B，C代表第10，11，12种基因型，以此类推，0表示该品种在该引物没有获得基因型；
各引物所对应的SSR位点在分子身份证中位置确定标准为：以各引物在品种中获得的目的片段长度的最小值为依据，并按照各引物获得目的片段长度的最小值从小到大的顺序排列来确定各引物所在SSR位点在分子身份证中的位置，而各引物所在SSR位点在分子身份证中的具体数字或字母由该位点在该品种中获得的基因型所决定。
2.根据权利要求1所述的一种标定四季茶花杂交新品种分子身份证的标记方法，其特征在于步骤（3）中所述的M13接头序列为5’-CACGACGTTGTAAAACGAC-3’。
3.根据权利要求1所述的一种标定四季茶花杂交新品种分子身份证的标记方法，其特征在于步骤（3）中的PCR扩增反应体系为10µL：6.15µL3d H2O、1µL不含Mg2+的10×PCRBuffer缓冲液、0.6µL浓度为25mM的Mg2+、0.8µL浓度为2.5mM的dNTP、0.04µL浓度为10µM带M13的正向引物、0.36µL浓度为10µM的M13荧光标记、0.4µL浓度为10µM的反向引物、0.15µL浓度为5U/μL Taq酶和0.5µL的DNA模板， PCR反应程序如下：94℃预变性3min，循环阶段94℃变性30s、各退火温度退火30s、72℃延伸1min，30个循环后，72℃延伸10min，4℃保存。
4.根据权利要求3所述的一种标定四季茶花杂交新品种分子身份证的标记方法，其特征在于所述的M13荧光标记为红色、绿色和蓝色三种。
CN201810587311.0A 2018-06-08 2018-06-08 一种标定四季茶花杂交新品种分子身份证的标记方法 Active CN108728572B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810587311.0A CN108728572B (zh) 2018-06-08 2018-06-08 一种标定四季茶花杂交新品种分子身份证的标记方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810587311.0A CN108728572B (zh) 2018-06-08 2018-06-08 一种标定四季茶花杂交新品种分子身份证的标记方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108728572A CN108728572A (zh) 2018-11-02
CN108728572B true CN108728572B (zh) 2021-10-22

Family

ID=63932863

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810587311.0A Active CN108728572B (zh) 2018-06-08 2018-06-08 一种标定四季茶花杂交新品种分子身份证的标记方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108728572B (zh)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110343778B (zh) * 2019-04-16 2023-08-22 中国林业科学研究院亚热带林业研究所 山茶品种春江红霞的多态性标记引物及山茶品种鉴定方法
CN110029186B (zh) * 2019-04-26 2022-06-03 北京农学院 牡丹ssr标记、其引物对及dna分子身份证的构建
CN110438253A (zh) * 2019-08-27 2019-11-12 贵州省茶叶研究所 一种利用ssr构建茶树基因身份证与分子二维码的方法
CN110564886B (zh) * 2019-09-29 2023-01-03 中国林业科学研究院亚热带林业研究所 金花茶ssr标记引物及其在杂种鉴定中的应用
CN114150083B (zh) * 2021-12-09 2022-07-26 中国林业科学研究院亚热带林业研究所 一种用于黑色茶花杂种鉴定的ssr标记引物及应用
CN115198030B (zh) * 2022-06-07 2023-09-01 上海市农业科学院 用于朱顶红杂交后代鉴定的ssr分子标记组合、ssr引物组合及其应用
CN115786473B (zh) * 2022-09-13 2023-07-04 河北农业大学 基于枣基因组多态性ssr位点的筛选方法及条形码的生成

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103667275A (zh) * 2013-12-13 2014-03-26 江西省林业科学院 油茶ssr分子标记
CN104651495A (zh) * 2015-01-16 2015-05-27 中国农业科学院郑州果树研究所 基于ssr基因型生成果树ssr分子身份证号码的方法
CN106480224A (zh) * 2016-12-28 2017-03-08 中国农业科学院茶叶研究所 快速鉴定不同白化茶树品种的分子标记组合、方法及应用
CN106755396A (zh) * 2016-12-16 2017-05-31 宁夏农林科学院枸杞工程技术研究所 一种用于构建枸杞dna指纹图谱的引物组合以及应用和方法
CN106834505A (zh) * 2017-03-15 2017-06-13 中国农业科学院郑州果树研究所 一种构建石榴品种身份证的方法及其应用
CN108034754A (zh) * 2018-01-15 2018-05-15 四川农业大学 利用ssr指纹图谱鉴别紫嫣茶树新品种的方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103667275A (zh) * 2013-12-13 2014-03-26 江西省林业科学院 油茶ssr分子标记
CN104651495A (zh) * 2015-01-16 2015-05-27 中国农业科学院郑州果树研究所 基于ssr基因型生成果树ssr分子身份证号码的方法
CN106755396A (zh) * 2016-12-16 2017-05-31 宁夏农林科学院枸杞工程技术研究所 一种用于构建枸杞dna指纹图谱的引物组合以及应用和方法
CN106480224A (zh) * 2016-12-28 2017-03-08 中国农业科学院茶叶研究所 快速鉴定不同白化茶树品种的分子标记组合、方法及应用
CN106834505A (zh) * 2017-03-15 2017-06-13 中国农业科学院郑州果树研究所 一种构建石榴品种身份证的方法及其应用
CN108034754A (zh) * 2018-01-15 2018-05-15 四川农业大学 利用ssr指纹图谱鉴别紫嫣茶树新品种的方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
An efficient identification strategy of clonal tea cultivars using long-core motif SSR markers;Rang Jian Wang 等;《SpringerPlus》;20161231;第5卷;第1-16页 *
ＳＳＲ 分子标记在山茶属观赏资源遗传多样性研究中的应用;张亚利 等;《植物科学学报》;20161231;第34卷(第5期);摘要，表1，第756页右栏第2段， *
茶花品种SSR指纹图谱分型技术反应体系优化;胡兴华 等;《中国农学通报》;20131231;第29卷(第1期);第127-131页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN108728572A (zh) 2018-11-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108728572B (zh) 一种标定四季茶花杂交新品种分子身份证的标记方法
CN106947816B (zh) 一种斜带石斑鱼亲子鉴定微卫星荧光多重pcr的方法
CN109022559A (zh) 一种基于二代测序技术的分子标记检测方法
CN111118194B (zh) 石蒜属植物荧光est-ssr分子标记及其应用
KR101493980B1 (ko) 벼 품종인식을 위한 Indel 마커
CN109868328B (zh) 鉴定紫斑牡丹品种的ssr分子标记及应用
CN106636393A (zh) 与南瓜皮色基因连锁的snp分子标记及其应用
CN106048042A (zh) 用于鉴定桃果实肉色性状的单核苷酸多态性标记位点、引物、试剂盒及应用
CN114350841B (zh) 基于全基因组测序的多态性分子标记和制备方法及应用
CN115852022A (zh) 基于全基因组重测序和kasp技术开发的烟草核心snp标记及其应用
CN110283929B (zh) 辣椒疫病抗性基因相关的snp标记5-160及其特异性引物和应用
CN112961936A (zh) 一种绿豆InDel分子标记检测引物组及其应用
Nguyen et al. Optimization of genotyping-by-sequencing (GBS) in chrysanthemums: selecting proper restriction enzymes for GBS library construction
CN108384885B (zh) 一种香樟ssr引物组合及其品种鉴定方法
CN115029465B (zh) 一种与油菜种子次生休眠主效QTL共分离的KASP和dCAPS标记及其应用
CN113789407B (zh) 一种用于油莎豆基因分型的snp分子标记组合及其应用
CN110358855B (zh) 辣椒疫病抗性基因snp标记5-156及其特异性引物和应用
CN108517373A (zh) 一个用于区分五个辣椒栽培种的InDel标记引物对及其应用
CN110878372B (zh) 银缕梅微卫星标记组合及其引物和应用
CN110016510B (zh) 一种用于罗氏沼虾遗传选育的分子标记
CN107365873A (zh) 与谷子叶鞘色性状连锁的分子标记及其应用
CN110317897B (zh) 辣椒疫病抗性基因相关的snp标记5-162及其特异性引物和应用
CN110106281B (zh) 六倍体I.trifida基因组特异SNP分子标记引物及应用
CN116622877B (zh) 与莲藕节间形状相关的snp分子标记及其应用
CN116004882B (zh) 一种用于构建辣椒分子身份证的snp分子标记及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information

Address after: Room 305, No. 136, Zhengkai Avenue, Zhengdong New District, Zhengzhou City, Henan Province

Applicant after: PALM ECO-TOWN DEVELOPMENT Co.,Ltd.

Applicant after: FUDAN University

Applicant after: GUANGZHOU ZONGKE GARDENING DEVELOPMENT Co.,Ltd.

Address before: 528400 Guangdong Province, Zhongshan City Xiaolan Town Xiangfeng West Road No. 21

Applicant before: PALM ECO-TOWN DEVELOPMENT Co.,Ltd.

Applicant before: FUDAN University

Applicant before: GUANGZHOU ZONGKE GARDENING DEVELOPMENT Co.,Ltd.

CB02 Change of applicant information
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant