CN116004882B - 一种用于构建辣椒分子身份证的snp分子标记及其应用 - Google Patents
一种用于构建辣椒分子身份证的snp分子标记及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116004882B CN116004882B CN202210921698.5A CN202210921698A CN116004882B CN 116004882 B CN116004882 B CN 116004882B CN 202210921698 A CN202210921698 A CN 202210921698A CN 116004882 B CN116004882 B CN 116004882B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- molecular marker
- chromosome
- nucleotide
- locus
- corresponds
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 235000002566 Capsicum Nutrition 0.000 title claims abstract description 98
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 title claims abstract description 87
- 239000001390 capsicum minimum Substances 0.000 title claims abstract description 55
- 240000008574 Capsicum frutescens Species 0.000 title abstract 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims abstract description 59
- 239000006002 Pepper Substances 0.000 claims abstract description 41
- 241000722363 Piper Species 0.000 claims abstract description 40
- 235000016761 Piper aduncum Nutrition 0.000 claims abstract description 40
- 235000017804 Piper guineense Nutrition 0.000 claims abstract description 40
- 235000008184 Piper nigrum Nutrition 0.000 claims abstract description 40
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 7
- 238000011161 development Methods 0.000 claims abstract description 7
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 claims abstract description 5
- 241000208293 Capsicum Species 0.000 claims description 52
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 51
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 50
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 19
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 4
- 239000001511 capsicum annuum Substances 0.000 claims description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 abstract description 14
- 230000003321 amplification Effects 0.000 abstract description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 abstract description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 6
- 240000004160 Capsicum annuum Species 0.000 description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 241000758706 Piperaceae Species 0.000 description 3
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 3
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 3
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 2
- 235000002567 Capsicum annuum Nutrition 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000208292 Solanaceae Species 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000012271 agricultural production Methods 0.000 description 1
- 238000007844 allele-specific PCR Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000009730 ganji Substances 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种用于构建辣椒分子身份证的分子标记及其应用。本发明所涉SNPs分子标记共12个，分布于辣椒12条染色体。利用本发明提供的分子标记扩增引物对，结合特定的限制性内切酶处理，采用琼脂糖凝胶电泳检测即可方便快捷地鉴定辣椒种质基因型，以此构建具有代表性的辣椒分子身份证。本发明能够实现对不同辣椒种质身份和亲缘关系的鉴定，为辣椒种质资源管理和开发利用、品种保护及评价提供技术支持。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种用于构建辣椒分子身份证的SNP分子标记及其应用。
背景技术
辣椒(Capsicum annuum)是茄科辣椒属重要经济作物，在世界各地广泛种植。辣椒种质资源复杂多样，对辣椒进行身份和亲缘关系鉴定是种质资源保护和利用的重要前提。辣椒种质资源和品种在国内外频繁交流，育种者为了共同或相近的育种目标使用类似优良品系做亲本，造成种子市场中品种同质化现象严重，甚至出现盗取和冒充现象，严重损害了育种者和生产者的合法权益，不利于激发育种家的创新力，同时给种质资源保护、市场管理、品种选育和审定以及农业生产带来混乱。为了规范种子市场，保护育种者的合法权益，需要对辣椒种质和品种身份进行科学鉴定。
依靠形态学等传统方法鉴定辣椒身份易受辣椒生长状态、发育时期以及环境等因素影响。分子标记不受环境条件影响，具有检测快捷、可靠的特点。利用分子标记构建辣椒种质、品种分子身份证为辣椒种质资源的保护和管理、种子市场管理、新品种选育和审定提供技术支持。单核苷酸多态性(single-nucleotide polymorphisms，SNP)在2007年被国际植物品种保护联盟(UPOV)确定为植物新品种保护应用最广泛的分子标记体系之一，证明该分子标记体系的实用性和可靠性。本发明基于SNP分子标记构建辣椒分子身份证，其应用利于辣椒种质资源的精准鉴定、管理和开发利用，为新品种保护建立技术壁垒。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于构建辣椒分子身份证的SNP分子标记及其应用，还提供了用于构建辣椒分子身份证的SNP分子标记的引物对和一种利用SNP分子标记构建辣椒分子身份证的方法。
本发明通过下述技术方案来实现：用于构建辣椒分子身份证的SNP分子标记，分子标记为SNP分子标记组合，由ID1～ID12组成，分别对应分布于辣椒基因组12条染色体的12个SNPs。
具体地，ID1～ID12具体针对C.annuum cv.CM334 v1.6辣椒基因组以下12个SNPs：
分子标记ID1对应1号染色体第201,473,923位，且该位点核苷酸为C/T；
分子标记ID2对应2号染色体第144,714,139位，且该位点核苷酸为C/A；
分子标记ID3对应3号染色体第27,145,682位，且该位点核苷酸为T/C；
分子标记ID4对应4号染色体第177,008,362位，且该位点核苷酸为A/G；
分子标记ID5对应5号染色体第228,688,274位，且该位点核苷酸为T/C；
分子标记ID6对应6号染色体第1,125,699位，且该位点核苷酸为C/T；
分子标记ID7对应7号染色体第44,278,226位，且该位点核苷酸为C/T；
分子标记ID8对应8号染色体第126,056,000位，且该位点核苷酸为G/C；
分子标记ID9对应9号染色体第247,929,334位，且该位点核苷酸为G/A；
分子标记ID10对应10号染色体第220,212,838位，且该位点核苷酸为C/T；
分子标记ID11对应11号染色体第251,793,198位，且该位点核苷酸为G/A；
分子标记ID12对应12号染色体第250,259,251位，且该位点核苷酸为G/A。
进一步地，本发明提供用于构建辣椒分子身份证的SNP分子标记的引物对。
优选的，所述用于构建辣椒分子身份证的SNP分子标记的引物对具有如下核苷酸序列：
SEQ ID NO.1：CCTTTTCTTAGCATCTGCTTTATTC
SEQ ID NO.2：CCTATCAGTCTGACTATGTGAGCCA
SEQ ID NO.3：GGAACACACACACGTCAAAGTAGTATT
SEQ ID NO.4：ACTCCCAAACATGATTGAATTCC
SEQ ID NO.5：TGGTCACAACTGTTTCTCTGCC
SEQ ID NO.6：CCGACAGCTAACACAAATATACCA
SEQ ID NO.7：AAGGGTTAAAGGTAAGTGAACTAGGT
SEQ ID NO.8：CCACGTGATGGTACTCAAATACTATACTA
SEQ ID NO.9：AACAGCAGTTCATCTCTGGGA
SEQ ID NO.10：CAGTTGTTAATCCCTGACCCA
SEQ ID NO.11：CGGCTCAAATCTCTCTTCTTCTC
SEQ ID NO.12：AAAGCTTTGACACATACATTATAAGGAA
SEQ ID NO.13：CCGAAGTGAATAAAACCGCCT
SEQ ID NO.14：CATCGTGTGACGTTCTGGTTTC
SEQ ID NO.15：CCAGTGAGCCAATGACCAGC
SEQ ID NO.16：ACTCCGTACACCCTATCCCA
SEQ ID NO.17：GTTTCCGGTGATGGCCATATT
SEQ ID NO.18：AATCCCGTGCTACCTCTGTTT
SEQ ID NO.19：GAGATTATCCTTTTCGCGGCT
SEQ ID NO.20：GAACGTCAATTTTCTCAGCCAA
SEQ ID NO.21：AAGACGAGGCTCCAGTTGGTC
SEQ ID NO.22：CAGACTTCCCTCCAAACGGA
SEQ ID NO.23：TAGCAGGTTCACCCGTCAAT
SEQ ID NO.24：TGAAGGTAGTATTTGATGCAGGTG
具体地，SEQ ID NO：1～24按顺序每两个核酸序列构成一个引物对，依次对应分子标记ID1～12；分别对应分布于辣椒基因组12条染色体的12个SNPs。
优选的，ID1～ID12标记的引物对分别为ID1-F/R、ID2-F/R、ID3-F/R、ID4-F/R、ID5-F/R、ID6-3-F/R、ID7-F/R、ID8-F/R、ID9-4-F/R、ID10-F/R、ID11-2-F/R、ID12-F/R,分别具有SEQ ID NO：1～2、SEQ ID NO：3～4、SEQ ID NO：5～6、SEQ ID NO：7～8、SEQ ID NO：9～10、SEQ ID NO：11～12、SEQ ID NO：13～14、SEQ ID NO：15～16、SEQ ID NO：17～18、SEQ IDNO：19～20、SEQ ID NO：21～22、SEQ ID NO：23～24所示的核苷酸序列。
利用本发明提供的引物对，制作分子标记，可以实现辣椒分子身份证的快速构建。因此，本发明还提供了所述的用于构建辣椒分子身份证的的引物对在辣椒种质身份或亲缘关系鉴定、辣椒种质资源管理和开发利用、品种保护及评价中的应用。
本发明提供了含有所述引物对的检测试剂、基因芯片或含有所述检测试剂的试剂盒。
所述试剂盒还包含dNTPs、DNA聚合酶、PCR反应缓冲液、限制性内切酶和标准阳性模板中的一种或多种。
本发明还提供了一种利用SNP分子标记构建辣椒分子身份证的方法，包括以下步骤：
步骤1：提取待测辣椒的基因组DNA；
步骤2：以待测辣椒的基因组DNA为模板，利用SEQ ID NO：1～24按顺序每两个核酸序列构成的引物对扩增辣椒基因组12条染色体的12个SNPs位点，进行PCR扩增反应；
步骤3：分析扩增产物的SNP位点基因型，依据SNP位点基因型将各分子标记数字化，能被限制性内切酶TaqI识别的基因型记为“00”，不能被限制性内切酶TaqI识别的基因型记为“11”，杂合基因型记为“01”，按1～12号染色体顺序依次排列，串联成分子身份编码。
本领域技术人员应该理解，分析SNP位点碱基类型的方法有很多，包括测序分析、等位基因特异性PCR分析、酶切产物多态性分析等。
优选地，步骤3中分析所述扩增产物的SNP位点为采用限制性内切酶酶切PCR扩增产物后，对酶切产物进行特征条带电泳检测，判断所述SNPs位点碱基类型。
更优选地，所述限制性内切酶为特异性识别TCGA的限制性内切酶TaqI。
本发明具备如下有益效果：
(1)本发明提供的鉴定辣椒分子身份的SNP分子标记，为基于对220份具有代表性的辣椒种质的全基因组基因分型测序(genotyping by sequencing，GBS)筛选出的SNP位点，这些位点具有较高多态性，理论上12个SNP位点共有312＝531,441种基因型，可满足复杂多样辣椒种质资源的身份鉴定；
(2)本发明提供的鉴定辣椒分子身份的SNP分子标记，能够在分子水平对辣椒做出精准鉴定，能对辣椒种子、根、茎、叶、花、果实等组织进行快速、准确鉴定；
(3)本发明开发的基于SNP分子标记的辣椒分子身份证，能够实现对不同辣椒种质身份和亲缘关系的鉴定，为辣椒种质资源管理和开发利用、品种保护及评价提供技术支持。
附图说明
图1为实施例中利用本发明分子身份证为220份辣椒种质构建的NJ系统发育树；
图2为实施例中分子标记ID1的琼脂糖凝胶电泳结果。
图3为实施例中分子标记ID2的琼脂糖凝胶电泳结果。
图4为实施例中分子标记ID3的琼脂糖凝胶电泳结果。
图5为实施例中分子标记ID4的琼脂糖凝胶电泳结果。
图6为实施例中分子标记ID5的琼脂糖凝胶电泳结果。
图7为实施例中分子标记ID6的琼脂糖凝胶电泳结果。
图8为实施例中分子标记ID7的琼脂糖凝胶电泳结果。
图9为实施例中分子标记ID8的琼脂糖凝胶电泳结果。
图10为实施例中分子标记ID9的琼脂糖凝胶电泳结果。
图11为实施例中分子标记ID10的琼脂糖凝胶电泳结果。
图12为实施例中分子标记ID11的琼脂糖凝胶电泳结果。
图13为实施例中分子标记ID12的琼脂糖凝胶电泳结果。
图2～图13中M为DNA Marker，DNA Marker条带从上至下依次为2,000bp、1,000bp、750bp、500bp、250bp和100bp；1～14为辣椒材料：1，A198；2，A204；3，A264；4，C004；5，C001；6，B345；7，B438；8，WY231；9，C031；10，赣椒16号；11，赣椒26号；12，赣椒40号；13，CY54；14，CZ51。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。通过这些说明，本发明的特点和优点将变得更为清楚明确。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:aLaboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
对220份辣椒种质通过测序进行基因分型(Genotyping-by-sequencing，GBS)，用限制性内切酶EcoRI和NlaIII对基因组DNA进行酶切，给酶切片段加上带标签的测序接头后构建小片段文库，进行PE125双末端测序，经质量控制后共得到2,887,920个SNPs和InDel。为从中筛选出可构建辣椒分子身份证的SNP分子标记，首先，依据最小等位基因频率(minorallele frequency，MAF)>0.2、多态信息含量(polymorphism information content，PIC)>0.3、连锁不平衡(linkage disequilibrium，LD)值>0.2、缺失率<0.1、杂合度<0.05的标准进行初步筛选，得到2,374个SNPs位点；然后依据每条染色体一个SNPs位点，SNPs能被限制性内切酶TaqI识别，SNPs位点能被特异性扩增且扩增片段小于1000bp，扩增区段内TaqI酶切位点只有1个或2个，以及酶切后条带能在琼脂糖凝胶上具有区分度的标准，得到12个SNPs。
这12个SNPs分别为C.annuum cv.CM334 v1.6辣椒基因组1号染色体第201,473,923位核苷酸多态性为C/T的SNP；2号染色体第144,714,139位核苷酸多态性为C/A的SNP；3号染色体第27,145,682位核苷酸多态性为T/C的SNP；4号染色体第177,008,362位核苷酸多态性为A/G的SNP；5号染色体第228,688,274位核苷酸多态性为T/C的SNP；6号染色体第1,125,699位核苷酸多态性为C/T的SNP；7号染色体第44,278,226位核苷酸多态性为C/T的SNP；8号染色体第126,056,000位核苷酸多态性为G/C的SNP；9号染色体第247,929,334位核苷酸多态性为G/A的SNP；10号染色体第220,212,838位核苷酸多态性为C/T的SNP；11号染色体第251,793,198位核苷酸多态性为G/A的SNP；12号染色体第250,259,251位核苷酸多态性为G/A的SNP。
上述12个SNPs位点，能被限制性内切酶TaqI识别的基因型记为“00”，不能被限制性内切酶TaqI识别的基因型记为“11”，杂合基因型记为“01”，按1～12号染色体顺序依次排列，形成辣椒分子身份证编号。依据220份辣椒种质分子身份证编号，用邻接法(Neighbor-Joining)构建系统发育树(附图1)，220份辣椒种质能清楚的区分开，说明本发明辣椒分子身份证可用于鉴定和区分不同的种质。根据GBS-seq数据知种质B410和C167，WY288和A264，C012和C018，C189和WY284，C014和A196，以及A124和A204两两间亲缘关系较近，在利用本发明分子身份证构建的NJ系统发育树(附图1)中，这些种质两两间也聚在一起，证实本发明辣椒分子身份证在鉴定辣椒种质亲缘关系中的可靠性。
一种利用SNP分子标记构建辣椒分子身份证的方法，包括以下步骤：
步骤1：提取待测辣椒的基因组DNA；利用CTAB法提取辣椒A198、A204、A264、C004、C001、B345、B438、WY231、C031、赣椒16号、赣椒26号、赣椒40号、CY54和CZ51的基因组DNA。其中A198、A204、A264、C004、C001、B345、B438、WY231和C031包含在前述的220份辣椒种质中，赣椒16号为C004和C001的F1代，赣椒26号为B345和B438的F1代，赣椒40号为WY231和C031的F1代，CY54和CY51为A198与A204杂交后的F5代单株。
步骤2：以待测辣椒的基因组DNA为模板，利用SEQ ID NO:1～24按顺序每两个核酸序列构成的引物对扩增辣椒基因组12条染色体的12个SNPs位点，进行PCR扩增反应；以步骤1辣椒种质的基因组DNA为模板，12对引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO:1～24，其中按顺序每两个核酸序列构成一个引物对，依次对应分子标记ID1～12。ID1～ID12标记的引物对分别为ID1-F/R、ID2-F/R、ID3-F/R、ID4-F/R、ID5-F/R、ID6-3-F/R、ID7-F/R、ID8-F/R、ID9-4-F/R、ID10-F/R、ID11-2-F/R、ID12-F/R,分别具有SEQ ID NO：1～2、SEQ ID NO：3～4、SEQ IDNO：5～6、SEQ ID NO：7～8、SEQ ID NO：9～10、SEQ ID NO：11～12、SEQ ID NO：13～14、SEQID NO：15～16、SEQ ID NO：17～18、SEQ ID NO：19～20、SEQ ID NO：21～22、SEQ ID NO：23～24所示的核苷酸序列。利用引物对ID1-F/R、ID2-F/R、ID3-F/R、ID4-F/R、ID5-F/R、ID6-3-F/R、ID7-F/R、ID8-F/R、ID9-4-F/R、ID10-F/R、ID11-2-F/R、ID12-F/R扩增上述种质ID1～ID12标记位点。
PCR扩增反应使用的反应体系为：5μL 2×Taq Master Mix，0.2μL 10μM正向引物，0.2μL 10μM反向引物，100ng/μL DNA模板0.5μL，ddH2O 4.1μL。
PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性20s，55℃退火20s，72℃延伸60s，39个循环；72℃延伸5min。PCR产物用限制性内切酶TaqI酶切。
酶切体系为PCR产物5μL，CutSmart Buffer 0.7μL，限制性内切酶0.2μL，ddH2O4.1μL，酶切体系在PCR仪中于65℃孵育6h。采用3％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物酶切后条带大小(附图2～13)。
步骤3：分析扩增产物的SNP位点基因型，依据SNP位点基因型将各分子标记数字化，能被限制性内切酶TaqI识别的基因型记为“00”，不能被限制性内切酶TaqI识别的基因型记为“11”，杂合基因型记为“01”，按1～12号染色体顺序依次排列，串联成分子身份证编码。按以下标准给分子标记编号：
分子标记ID1 597bp大小条带记为“11”，442bp+155bp条带记为“00”，597bp+442bp+155bp条带记为“01”；
分子标记ID2 463bp大小条带记为“11”，317bp+146bp条带记为“00”，463bp+317bp+146bp条带记为“01”；
分子标记ID3 596bp大小条带记为“11”，329bp+267bp条带记为“00”，596bp+329bp+267bp条带记为“01”；
分子标记ID4 308bp大小条带记为“11”，190bp+118bp条带记为“00”，308bp+190bp+118bp条带记为“01”；
分子标记ID5 333bp大小条带记为“11”，186bp+147bp条带记为“00”，333bp+186bp+147bp条带记为“01”；
分子标记ID6 353bp大小条带记为“11”，195bp+158bp条带记为“00”，353bp+195bp+158bp条带记为“01”；
分子标记ID7 966bp大小条带记为“11”，495bp+471bp条带记为“00”，966bp+495bp+471bp条带记为“01”；
分子标记ID8 634bp大小条带记为“11”，438bp+196bp条带记为“00”，634bp+438bp+196bp条带记为“01”；
分子标记ID9 244bp+62大小条带记为“11”，211bp+62bp+33bp条带记为“00”，244bp+211bp+62bp+33bp条带记为“01”；
分子标记ID10 643bp大小条带记为“11”，541bp+102bp条带记为“00”，643bp+541bp+102bp条带记为“01”；
分子标记ID11 405bp大小条带记为“11”，240bp+165bp条带记为“00”，405bp+240bp+165bp条带记为“01”；
分子标记ID12 683bp大小条带记为“11”，458bp+225bp条带记为“00”，683bp+458bp+225bp条带记为“01”。
将分子标记ID1～ID12按上述标准依次编号并串联起来，得到辣椒A198、A204、A264、C004、C001、B345、B438、WY231、C031、赣椒16号、赣椒26号、赣椒40号、CY54和CZ51的分子身份证编号：
A198：111100110000000011001100
A204：000011110000111100111100
A264：110000110000000011000011
C004：001111110000110000110011
C001：001111000000000000001111
B345：001111000011110000110000
B438：001111111111110000110000
WY231：111100110000001100110000
C031：111100110000000011111100
赣椒16号：001111010000010000010111
赣椒26号：001111010111110100110000
赣椒40号：111100110000000101110100
CY54：110011110000001100001100
CZ51：110011110000111111111100
其中A198、A204、A264、C004、C001、B345、B438、WY231和C031的分子身份证与GBS-seq鉴定的基因型一致，说明本发明针对该12个SNPs开发的酶切扩增多态性序列(cleavedamplified polymorphic sequence，CAPS)分子标记可准确鉴定出辣椒种质的基因型，可准确快速鉴定辣椒的分子身份；辣椒品种赣椒16号、赣椒26号和赣椒40号的分子身份证编号在本发明鉴定的225份辣椒种质中具有唯一性，且均为其对应双亲的混合基因型，说明本发明构建的辣椒分子身份证可用于辣椒品种的身份鉴定及品种保护，即利用本发明方法鉴定的分子身份编号为001111010000010000010111的认定为赣椒16号或类似品种，分子身份证编号为001111010111110100110000认定为赣椒26号或类似品种，分子身份证编号为111100110000000101110100的认定为赣椒40号或类似品种；CY54和CZ51为利用A198和A204创制的辣椒新种质，其分子身份证编号在本发明鉴定的225份辣椒种质中具有唯一性，且每个位点均具有其双亲之一的基因型，说明本发明构建的辣椒分子身份证可用于辣椒新种质的鉴定和保护，即利用本发明方法鉴定的分子身份编号为110011110000001100001100的认定为辣椒种质CY54或类似种质，分子身份编号为110011110000111111111100的认定为辣椒种质CZ51或类似种质。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (8)
1.用于构建辣椒分子身份证的SNP分子标记的引物对，其特征在于，所述引物对具有SEQ ID NO：1~24所示的核苷酸序列；SEQ ID NO：1~24按顺序每两个核酸序列构成一个引物对，依次对应分子标记ID1~12；
所述SNP分子标记针对Capsicumannuum cv. CM334 v1.6辣椒基因组以下12个SNPs：
分子标记ID1对应1号染色体第201,473,923位，且该位点核苷酸为C/T；
分子标记ID2对应2号染色体第144,714,139位，且该位点核苷酸为C/A；
分子标记ID3对应3号染色体第27,145,682位，且该位点核苷酸为T/C；
分子标记ID4对应4号染色体第177,008,362位，且该位点核苷酸为A/G；
分子标记ID5对应5号染色体第228,688,274位，且该位点核苷酸为T/C；
分子标记ID6对应6号染色体第1,125,699位，且该位点核苷酸为C/T；
分子标记ID7对应7号染色体第44,278,226位，且该位点核苷酸为C/T；
分子标记ID8对应8号染色体第126,056,000位，且该位点核苷酸为G/C；
分子标记ID9对应9号染色体第247,929,334位，且该位点核苷酸为G/A；
分子标记ID10对应10号染色体第220,212,838位，且该位点核苷酸为C/T；
分子标记ID11对应11号染色体第251,793,198位，且该位点核苷酸为G/A；
分子标记ID12对应12号染色体第250,259,251位，且该位点核苷酸为G/A。
2.一种检测试剂或基因芯片或试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的引物对。
3.如权利要求1所述的用于构建辣椒分子身份证的SNP分子标记的引物对在构建辣椒分子身份证、辣椒种质亲缘关系鉴定、辣椒种质资源管理和开发利用、辣椒品种保护及评价中的应用。
4.一种利用权利要求1所述的SNP分子标记的引物对构建辣椒分子身份证的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：提取待测辣椒的基因组DNA；
步骤2：以待测辣椒的基因组DNA为模板，利用所述引物对扩增辣椒基因组12条染色体的12个SNPs位点，进行PCR扩增反应；
步骤3：分析PCR扩增产物的SNP位点基因型，依据SNP位点基因型将各分子标记数字化，能被限制性内切酶TaqI识别的基因型记为“00”，不能被限制性内切酶TaqI识别的基因型记为“11”，杂合基因型记为“01”，按1~12号染色体顺序依次排列，串联成分子身份证编码。
5.根据权利要求4所述的一种利用SNP分子标记构建辣椒分子身份证的方法，其特征在于，步骤3中所述的分析PCR扩增产物的SNP位点基因型为采用限制性内切酶酶切PCR扩增产物后，对酶切产物进行特征条带的电泳检测，判断所述SNPs位点碱基类型。
6.根据权利要求5所述的一种利用SNP分子标记构建辣椒分子身份证的方法，其特征在于，所述限制性内切酶为特异性识别TCGA的限制性内切酶TaqI。
7.一种辣椒种质、品种鉴定方法，其特征在于，利用权利要求4的方法所构建的分子身份证编码的唯一性确定对应的辣椒所属种质或品种。
8.用于构建辣椒分子身份证的SNP分子标记在构建辣椒分子身份证、辣椒种质亲缘关系鉴定、辣椒种质资源管理和开发利用、辣椒品种保护及评价中的应用,其特征在于，所述SNP分子标记由针对Capsicumannuum cv. CM334 v1.6辣椒基因组的以下12个SNPs组成：
分子标记ID1对应1号染色体第201,473,923位，且该位点核苷酸为C/T；
分子标记ID2对应2号染色体第144,714,139位，且该位点核苷酸为C/A；
分子标记ID3对应3号染色体第27,145,682位，且该位点核苷酸为T/C；
分子标记ID4对应4号染色体第177,008,362位，且该位点核苷酸为A/G；
分子标记ID5对应5号染色体第228,688,274位，且该位点核苷酸为T/C；
分子标记ID6对应6号染色体第1,125,699位，且该位点核苷酸为C/T；
分子标记ID7对应7号染色体第44,278,226位，且该位点核苷酸为C/T；
分子标记ID8对应8号染色体第126,056,000位，且该位点核苷酸为G/C；
分子标记ID9对应9号染色体第247,929,334位，且该位点核苷酸为G/A；
分子标记ID10对应10号染色体第220,212,838位，且该位点核苷酸为C/T；
分子标记ID11对应11号染色体第251,793,198位，且该位点核苷酸为G/A；
分子标记ID12对应12号染色体第250,259,251位，且该位点核苷酸为G/A。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210921698.5A CN116004882B (zh) | 2022-08-02 | 2022-08-02 | 一种用于构建辣椒分子身份证的snp分子标记及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210921698.5A CN116004882B (zh) | 2022-08-02 | 2022-08-02 | 一种用于构建辣椒分子身份证的snp分子标记及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116004882A CN116004882A (zh) | 2023-04-25 |
| CN116004882B true CN116004882B (zh) | 2023-12-08 |
Family
ID=86021791
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210921698.5A Active CN116004882B (zh) | 2022-08-02 | 2022-08-02 | 一种用于构建辣椒分子身份证的snp分子标记及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116004882B (zh) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108486276A (zh) * | 2018-06-01 | 2018-09-04 | 江西省农业科学院蔬菜花卉研究所 | 辣椒熟性snp分子标记及其应用 |
| KR20200001159A (ko) * | 2018-06-27 | 2020-01-06 | 서울대학교산학협력단 | 고추 과피의 신미 정도를 판별하기 위한 마커 및 이의 용도 |
| CN111270004A (zh) * | 2020-03-23 | 2020-06-12 | 北京市农林科学院 | 一种鉴定辣椒品种真实性的方法及其专用ssr引物组合 |
| CN112877453A (zh) * | 2021-01-26 | 2021-06-01 | 北京市农林科学院 | 一种鉴定辣椒品种真实性的方法 |
-
2022
- 2022-08-02 CN CN202210921698.5A patent/CN116004882B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108486276A (zh) * | 2018-06-01 | 2018-09-04 | 江西省农业科学院蔬菜花卉研究所 | 辣椒熟性snp分子标记及其应用 |
| KR20200001159A (ko) * | 2018-06-27 | 2020-01-06 | 서울대학교산학협력단 | 고추 과피의 신미 정도를 판별하기 위한 마커 및 이의 용도 |
| CN111270004A (zh) * | 2020-03-23 | 2020-06-12 | 北京市农林科学院 | 一种鉴定辣椒品种真实性的方法及其专用ssr引物组合 |
| CN112877453A (zh) * | 2021-01-26 | 2021-06-01 | 北京市农林科学院 | 一种鉴定辣椒品种真实性的方法 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| 48个辣椒地方品种SSR和SRAP标记的遗传多样性和指纹分析;何建文等;《分子植物育种》;第9卷;摘要，表3 * |
| Genome-wide SNP discovery and population structure analysis in pepper (Capsicum annuum) using genotyping by sequencing;F Taranto等;《BMC Genomics》;第17卷(第1期);943 * |
| SNP分子标记在作物品种鉴定中的应用和展望;王富强;樊秀彩;张颖;刘崇怀;姜建福;;植物遗传资源学报;21(5);第1308-1320页 * |
| 辣椒核心种质研究进展;朱雪梅等;《江西农业学报》;第34卷(第4期);第8-12页 * |
| 辣椒转录组SNP挖掘及多态性分析;刘峰等;《园艺学报》;第41卷(第02期);第343-348页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116004882A (zh) | 2023-04-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Agarwal et al. | Advances in molecular marker techniques and their applications in plant sciences | |
| KR101923647B1 (ko) | 쥬빌리 타입 또는 크림슨 타입 수박 품종 판별용 snp 마커 | |
| CN106191240A (zh) | 用于鉴定桃果实表皮毛性状的单核苷酸多态性标记位点、引物、试剂盒及应用 | |
| CN105925721A (zh) | 用于鉴定桃果实表皮着色性状的单核苷酸多态性标记位点、引物、试剂盒及应用 | |
| CN106048042A (zh) | 用于鉴定桃果实肉色性状的单核苷酸多态性标记位点、引物、试剂盒及应用 | |
| KR20180077873A (ko) | 수박 분자마커이용여교잡 선발용 snp 마커 | |
| Pootakham et al. | Development of genomic‐derived simple sequence repeat markers in Hevea brasiliensis from 454 genome shotgun sequences | |
| CN106119397B (zh) | 番茄斑萎病抗性基因Sw-5b紧密连锁SNP位点获得及标记开发 | |
| Zuo et al. | Primer development and functional classification of EST-SSR markers in Ulmus species | |
| CN108220473B (zh) | 利用叶绿体InDel标记鉴别玉米S型胞质不育材料 | |
| CN112143829B (zh) | 一组普适性snp标记的分型及应用 | |
| de Miguel et al. | Annotated genetic linkage maps of Pinus pinaster Ait. from a Central Spain population using microsatellite and gene based markers | |
| KR20190055491A (ko) | 배 품종 식별용 조성물 | |
| CN116004882B (zh) | 一种用于构建辣椒分子身份证的snp分子标记及其应用 | |
| CN116515858A (zh) | 花生早斑病抗性主效基因AhELSR1及其分子标记的应用 | |
| KR102524050B1 (ko) | 다래의 성 판별용 분자마커 및 이의 용도 | |
| Jakše et al. | Application of microsatellite markers in grapevine and olives | |
| WO2019117704A1 (en) | Methods for detecting pathogenicity of ganoderma sp. | |
| CN113789407A (zh) | 一种用于油莎豆基因分型的snp分子标记组合及其应用 | |
| CN107354201B (zh) | 用于鉴定烤烟云烟97的引物组合及试剂盒、应用及检测方法 | |
| KR102526682B1 (ko) | 고추 착과 방향성 예측용 분자마커 및 이의 용도 | |
| Singh et al. | Molecular markers in plants | |
| Nuroniah et al. | Development of SCAR markers for species identification in the genus Shorea (Dipterocarpaceae) | |
| CN107858448A (zh) | 用于鉴定桃花粉育性性状的单核苷酸多态性标记位点、引物对、试剂盒及应用 | |
| KR102487648B1 (ko) | 중국 접종배지 표고버섯 품종 판별용 caps 마커 및 이의 용도 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |