CN106119397B - 番茄斑萎病抗性基因Sw-5b紧密连锁SNP位点获得及标记开发 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了番茄斑萎病抗性基因Sw‑5b紧密连锁SNP位点获取及标记开发。本发明提供了检测番茄基因组中SNP724位点的多态性或基因型的物质在鉴定或辅助鉴定番茄基因组中是否含有抗斑萎病Sw‑5b基因中的应用；或检测番茄基因组中SNP724位点的多态性或基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定番茄基因组中是否含有抗斑萎病Sw‑5b基因产品中的应用；本发明的实验证明了，本发明开发了与番茄斑萎病抗性基因Sw‑5b连锁的SNP标记SNP724，该SNP标记可以用于高通量的分子检测平台，与第二代分子标记相比，检测方式更为简便、准确，检测效率更高。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及基因组序列及植物生物技术领域，具体涉及番茄斑萎病抗性基因Sw-5b紧密连锁SNP位点获取及标记开发。
背景技术
番茄斑萎病是由番茄斑萎病毒侵染引起的一种严重病害，威胁番茄正常生产。选育番茄抗斑萎病品种是防治番茄斑萎病的最为有效的方法之一。在传统抗斑萎病品种选育过程中，每代都需要采用田间接种病菌的方法鉴定中间材料的基因型，而且环境条件会影响到正确中间材料的选择，这样势必影响选育进程；同时如果接种过程操作不当还会造成病毒扩散，不利于斑萎病的综合防治，因此抗病品种选育难的问题一直没有彻底解决。
分子标记辅助选择技术(Marker-assisted Selection，MAS)是现代分子生物学和传统遗传育种相结合的新型育种模式，可以利用分子标记在植物发育的任何时期从DNA水平对目标植株进行选择(Tanksley等，RFLP mapping in plant breeding:New tools foran old science.1989,Biotechnology,7:257-263)，从而弥补传统育种中出现的诸多弊端，因此成为解决抗病品种选育难这一问题的有效途径。其中，利用高通量分子检测平台进行分子标记辅助选择则是增加抗病育种准确度与提高育种效率的有效手段。
单核苷酸多态性(Single-nucleotide polymorphism，SNP)是指基因组核苷酸序列中由单个核苷酸水平上的变异而引起的基因组水平上的DNA序列多态性，主要包括单个碱基的缺失、插入、转换及颠换等(唐立群等，SNP分子标记的研究及其应用进展.2012,中国农学通报,28(12):154-158.)。SNP标记即为在此基础上发展起来的第三代分子标记，该标记类型具有突变频率低，遗传稳定性高；位点丰富，分布广泛；检测快速，筛选规模化等特点。与第二代分子标记相比，SNP标记不需要根据DNA片段大小进行分型，能够摆脱传统凝胶电泳这种步骤相对繁琐，低通量，价格又较贵的检测方法。因此，更加适用于现阶段飞速发展的高通量分子检测平台。
在番茄斑萎病抗性基因中，Sw-5对斑萎病毒具有广谱抗性，是抗病育种中使用最为广泛的基因。该基因是由Sw-5a到Sw-5e五个相互连锁的基因拷贝组成的基因家族，其中Sw-5a和Sw-5b已经被克隆且序列已经登录到GenBank中，登录号AY007366(Spassova等，Thetomato gene Sw5 is a member of the coiled coil,nucleotide binding,leucine-rich repeat class of plant resistance genes and confers resistance to TSWV intobacco.2001,Molecular Breeding,7(2):151-161)。2016年，已经发现针对Sw-5基因已经开发了不同类型的连锁标记，包括RFLP(restriction fragment length polymorphism)标记CT71和CT220，RAPD(random amplified polymorphic DNA)标记421R，SCAR(sequencecharacterized amplified regions)标记Sw-5-2以及CAPs(cleaved amplifiedpolymorphic sequence)标记等(Stevens等，Mapping the Sw-5locus for Tomatospotted wilt virus resistance in tomatoes using RAPD and RFLP analyses.1995，Theoretical and Applied Genetics,90:451-456；Chague等，Identification andmapping on chromosome 9of RAPD markers linked to Sw-5in tomato by bulkedsegregant analysis.1996,Theoretical and Applied Genetics,92:1045-1051；Smiech等，New RAPD markers of tomato spotted wilt virus(TSWV)resistance inLycopersiconesculentum Mill.2000,ActaPhysiologiaeApalantarum,22:299-303；Langella等，Molecular marker assisted transfer of resistance to TSWV in tomatoelite lines.2004,Journal of Horticultural Science&Biotechnology,79:806-810；Dianese等，Development of a locus-specific,co-dominant SCAR marker forassisted-selection of the Sw-5(Tospovirus resistance)gene cluster in a widerange of tomato accessions.2010,Molecular Breeding,25(1):133-142.)。上述已经开发的Sw-5基因连锁标记虽然可以用于分子标记辅助选择，但检测效率相对较低，并不适用于高通量的分子检测平台。
因此，开发适合于高通量分子检测平台的番茄抗斑萎病SNP标记对于推广普及分子标记技术的应用、提高我国的育种效率和育种水平具有重要意义。
发明内容
本发明一个目的是提供检测番茄基因组中SNP724位点的多态性或基因型的物质的用途。
本发明提供了检测番茄基因组中SNP724位点的多态性或基因型的物质在鉴定或辅助鉴定番茄基因组中是否含有抗斑萎病Sw-5b基因中的应用；
或检测番茄基因组中SNP724位点的多态性或基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定番茄基因组中是否含有抗斑萎病Sw-5b基因产品中的应用；
所述SNP724位点为序列1第59位，所述SNP位点的基因型为A/A纯合、G/G纯合或A/G杂合。
本发明第二个目的是提供检测番茄基因组中SNP724位点的多态性或基因型的物质的用途。
本发明提供了检测番茄基因组中SNP724位点的多态性或基因型的物质在鉴定或辅助鉴定番茄是否抗斑萎病中的应用；
或检测番茄基因组中SNP724位点的多态性或基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定番茄是否抗斑萎病产品中的应用；
所述SNP724位点为序列1第59位，所述SNP位点的基因型为A/A纯合、G/G纯合或A/G杂合。
上述应用中，所述检测番茄基因组中SNP724位点的多态性或基因型的物质为如下1)或2)：
1)、扩增所述SNP724位点的成套引物；
2)、含有所述成套引物的PCR试剂或试剂盒。
上述应用中，所述成套引物由序列2-4所示的单链DNA分子组成。
本发明第3个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测番茄基因组中是否含有抗斑萎病Sw-5b基因的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：检测待测番茄基因组SNP724位点基因型为A/A纯合、G/G纯合或A/G杂合，若所述待测番茄基因组SNP724位点基因型为A/A纯合或A/G杂合，则所述待测番茄含有或候选含有抗斑萎病Sw-5b基因；若所述待测番茄基因组SNP724位点基因型为G/G纯合，则所述待测番茄不含有或候选不含有抗斑萎病Sw-5b基因；
所述SNP724位点为序列1第59位。
本发明第4个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测番茄是否抗斑萎病的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：检测待测番茄基因组SNP724位点基因型为A/A纯合、G/G纯合或A/G杂合，若所述待测番茄基因组SNP724位点基因型为A/A纯合或A/G杂合，则所述待测番茄抗斑萎病或候选抗斑萎病；若所述待测番茄基因组SNP724位点基因型为G/G纯合，则所述待测番茄不抗斑萎病或候选不抗斑萎病；
所述SNP724位点为序列1第59位。
上述方法中，所述检测待测番茄基因组SNP724位点基因型为A/A纯合、G/G纯合或A/G杂合的方法为如下：
1)直接测序；
2)用权利要求1-3任一所述应用中的所述检测番茄基因组中SNP724位点的多态性或基因型的物质对待测番茄进行PCR扩增，得到扩增产物，检测扩增产物中SNP724位点基因型。
上述方法中，所述检测扩增产物中SNP724位点基因型采用ArrayTape平台检测或荧光定量PCR仪检测。
本发明第5个目的是提供鉴定或辅助鉴定番茄是否抗斑萎病的试剂盒。
本发明提供的试剂盒，包括上述应用中的所述检测番茄基因组中SNP724位点的多态性或基因型的物质。
上述应用中的所述检测番茄基因组中SNP724位点的多态性或基因型的物质在培育抗斑萎病番茄或抗斑萎病番茄育种中的应用也是本发明保护的范围。
本发明开发了与番茄斑萎病抗性基因Sw-5b连锁的SNP标记SNP724，该标记与抗性基因之间的物理距离为3.8kb，与标记Sw-5-2的一致性结果可达到92.4％，分子标记鉴定结果与田间抗病表型一致性可达到90％以上，说明上述SNP标记可以用于番茄抗斑萎病抗性基因Sw-5b的分子标记辅助育种；该SNP标记可以用于高通量的分子检测平台，与第二代分子标记相比，检测方式更为简便、准确，检测效率更高。
附图说明
图1为SNP标记SNP724在番茄Chr9上的物理位置图谱。
图2为SNP标记SNP724检测48份番茄材料的分型图，横坐标‘VIC’表示Allele1集合(红色荧光)；纵坐标‘FAM’表示Allele2集合(蓝色荧光)。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、与番茄抗斑萎病Sw-5b基因紧密连锁SNP位点及SNP标记的获得及鉴定
经过发明人大量的序列分析、发掘SNP位点，并对SNP位点与多个性状进行关联分析，发现1个与番茄抗斑萎病性状相关的SNP位点，命名为SNP724。
SNP724标记序列如下所示，多态性位点为如下序列1第59位核苷酸，为A或G；
5’-CTACTTTTTCCAATGGATAAAGCTTTGGAATGGAATCATGGACACAACTGGAGTTATT[A/G]CTATATATCTTTGAAACTTGTACAAGTAAAATTTGAAGAATGACTGTTG-3’(序列1)
根据SNP724进行引物设计、预实验比对效果，选出SNP724位点的特异引物组合：
FP1SNP724:5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCATGGACACAACTGGAGTTATTA-3’(序列2)
FP2SNP724:5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCATGGACACAACTGGAGTTATTG-3’(序列3)
RPSNP724:5’-CAGTCATTCTTCAAATTTTACTTGT-3’(序列4)
利用Douglas Scientific公司ArrayTape平台检测后，上述多态性良好的KASP引物用于后续验证：SNP724位点的特异引物组合与Sw-5b基因之间的物理距离为3.8kb(图1)。
实施例2、SNP位点及其特异引物组合在鉴定番茄是否含有抗斑萎病Sw-5b基因因中的应用
一、鉴定番茄是否含有抗斑萎病Sw-5b基因
1、基因组DNA的提取
提取表1所示的48份番茄材料的基因组DNA。
表1 48份番茄材料表型及标记基因型鉴定表
注：1.表中DNA编号为1-36的样品为番茄种质资源库登记样品(Tomato GeneticsResource Center http://tgrc.ucdavis.edu/index.aspx)；DNA标号为37-48的样品为商品种；
2.标记Sw-5-2列中‘R’表示斑萎病纯合抗病基因型，‘S’表示斑萎病纯合感病基因型，‘H’表示斑萎病杂合抗病基因型；
3.标记SNP724列中‘A/A’表示斑萎病纯合抗病基因型，‘G/G’表示斑萎病纯合感病基因型，‘A/G’表示斑萎病杂合抗病基因型。
2、PCR扩增
将上述各基因组DNA放入如下体系中扩增反应：
1.6μL PCR ArrayTape平台检测反应体系包括：含基因组DNA 50ng/μL 0.8μL，引物混液0.03μL(正向引物FP1、FP2在体系中的终浓度为12pmol·L-1，反向引物RP在体系中的终浓度为24pmol·L-1)，LGC公司2×KASP Mix(StdRox)0.8μL。
PCR扩增程序：95℃预变性10min，1个循环；95℃变性20s，55℃退火60s，设置40个循环。
Douglas Scientific公司ArrayTape平台检测，
上述正向引物FP1、FP2和反向引物RP分别为SNP724位点的特异引物组合中的FP1SNP724、FP2SNP724和RPSNP724；
将上述PCR扩增体系采用Douglas Scientific公司ArrayTape平台检测，实验设计2次重复。
数据记录：仪器自带软件读取的数据能够划分不同的基因型数据，纯合位点的基因型数据可以记录为Allele1/Allele1或者Allele2/Allele2，杂合位点的基因型数据可以记录为Allele1/Allele2，其中Allele1和Allele2分别代表该变异位点上的两个等位碱基A和G，因此，Allele1/Allele1代表的基因型为A/A，Allele2/Allele2代表的基因型为G/G，Allele1/Allele2代表的基因型为A/G。
判断：若待测番茄基因组上的SNP724位点基因型为A/A或A/G，则待测番茄基因组含有或候选含有抗斑萎病Sw-5b基因；若待测番茄基因组上的SNP724位点的基因型为G/G，则待测番茄基因组不含有或候选不含有抗斑萎病Sw-5b基因。
SNP724结果如图2和表1所示，检测到7种番茄为A/A基因型、39种番茄为G/G和2种番茄为A/G，A/A基因型和A/G基因型的番茄基因组含有抗斑萎病Sw-5b基因，G/G基因型番茄基因组不含有抗斑萎病Sw-5b基因。
经过测序，结果与SNP724鉴定一致，证明本发明的方法正确。
二、体系摸索
按照上述一的方法，将48个番茄的基因组DNA放入如下体系进行扩增：
5μL荧光定量PCR仪PCR扩增体系包括：基因组DNA 50ng，引物混液0.07μL(正向引物FP1、FP2在体系中的终浓度为12pmol·L-1，反向引物RP在体系中的终浓度为30pmol·L-1),LGC公司2×KASP Mix(Low Rox)2.5μL，ddH2O补足体积。
PCR扩增程序：95℃预变性10min，1个循环；95℃变性20s，55℃退火60s，设置40个循环。
将上述PCR扩增体系采用荧光定量PCR仪AB-Q6Flex检测，结果与表1无显著差异，表明用ArrayTape平台检测反应体系和用荧光定量PCR仪AB-Q6Flex检测无显著差异。
实施例3、SNP724位点及其特异引物组合在鉴定番茄抗斑萎病中的应用
一、番茄抗斑萎病表型检测
选择表1所示的48份不同来源的番茄材料，在田间种植后，进行了表型观察。每份材料种植10株，在斑萎病高发期进行抗病性表型统计，每份材料中有7株以上抗病，则这份材料记为抗病，统计结果见表1。
二、SNP位点及其特异引物组合鉴定番茄抗斑萎病
1、基因组DNA的获得
提取48份不同来源的番茄的基因组DNA。
2、PCR扩增
将上述基因组DNA分别在如下体系中扩增反应：
1.6μL PCR ArrayTape平台检测反应体系包括：含基因组DNA 50ng/μL 0.8μL，引物混液0.03μL(正向引物FP1、FP2在体系中的终浓度分别为12pmol·L-1，反向引物RP在体系中的终浓度为24pmol·L-1)，LGC公司2×KASP Mix(StdRox)0.8μL。
PCR扩增程序：95℃预变性10min，1个循环；95℃变性20s，55℃退火60s，设置40个循环。
Douglas Scientific公司ArrayTape平台检测，
上述正向引物FP1、FP2和反向引物RP分别为SNP724位点的特异引物组合中的FP1SNP724、FP2SNP724和RPSNP724；
将上述PCR扩增体系采用Douglas Scientific公司ArrayTape平台检测，实验设计2次重复。
若待测番茄基因组上的SNP724位点基因型为A/A或A/G，则待测番茄抗斑萎病或候选抗斑萎病；若待测番茄基因组上的SNP724位点的基因型为G/G，则待测番茄基因组不抗斑萎病或候选不抗斑萎病。
结果如表1所示，分子标记检测结果与田间抗病性表型进行方差分析结果表明，分子标记与表型之间显著相关(P<0.001)。
SNP724鉴定为A/A纯合抗性基因型的7种番茄抗斑萎病，田间表型也均为抗斑萎病；
SNP724鉴定为A/G杂合抗性基因型的2种番茄抗斑萎病，田间鉴定结果为1种抗斑萎病、1种不抗斑萎病；
SNP724鉴定为G/G纯合感性基因型的39种番茄不抗斑萎病，田间表型中有1种番茄为抗斑萎病，其余38种均为不抗斑萎病；本发明鉴定为G/G纯合感病基因型的感病情况准确率为97％。
对比例1、
以现有与Sw-5b基因连锁的SCAR标记Sw-5-2作为对照，具体如下:
提取48个番茄的基因组DNA作为模板，用标记Sw-5-2的特异引物Sw-5-2F和Sw-5-2R进行PCR扩增，得到550bp扩增片段的为抗番茄抗斑萎病材料，未得到550bp扩增片段的为不抗番茄抗斑萎病材料。
结果如表1所示，SCAR标记Sw-5-2鉴定结果与SNP724鉴定结果一致性达到93.7％。
将利用SNP724鉴定的结果与利用Sw-5-2鉴定的结果(表1)进行关联分析，结果表明SNP724与标记Sw-5-2之间的相关性能够达到92.4％。
表2关联分析结果表
对比例2、
利用Primer5.0对SNP724附近的其他SNP位点设计KASP引物组合如下：
FP1SNP715:5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCTCAAGGAGATCCCCCTTAGCT-3’
FP2SNP715:5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCTCAAGGAGATCCCCCTTAGCG-3’
RPSNP715:5’-CTCGCACCTAATCAACTTAATCT-3’
纯合位点的基因型数据可以记录为Allele1/Allele1或者Allele2/Allele2，杂合位点的基因型数据可以记录为Allele1/Allele2，其中Allele1和Allele2分别代表该变异位点上的两个等位碱基T和G，Allele1/Allele1代表的基因型为T/T，Allele2/Allele2代表的基因型为G/G，Allele1/Allele2代表的基因型为T/G。其中，纯合抗病基因型为G/G，纯合感病基因型为T/T,杂合抗病基因型为T/G。
若待测番茄基因组上的SNP715位点基因型为G/G或T/G，则待测番茄抗斑萎病或候选抗斑萎病；若待测番茄基因组上的SNP715位点的基因型为T/T，则待测番茄基因组不抗斑萎病或候选不抗斑萎病。
SNP724鉴定为A/A纯合抗病基因型的7种番茄，在此引物下的鉴定结果均为纯合感病基因型T/T，为不抗斑萎病，这与田间鉴定不一致；
SNP724鉴定为A/G杂合抗病基因型的2种番茄，在此引物下的鉴定结果均为纯合感病基因型T/T，为不抗斑萎病，这与田间鉴定不一致；
SNP724鉴定为G/G纯合感病基因型的39种番茄，在此引物下的结果为有2种番茄鉴定结果为纯合抗病基因型G/G，为抗斑萎病，37种番茄鉴定结果为纯合感病基因型T/T，为不抗斑萎病，这与田间鉴定结果存在差异。
可以看出，本发明SNP724鉴定引物组合的准确率高于对照。
因此，本发明的SNP724标记可用于番茄斑萎病抗性基因Sw-5b的分子标记辅助育种。
Claims (12)
1.检测番茄基因组中SNP724位点的多态性或基因型的物质在鉴定或辅助鉴定番茄基因组中是否含有抗斑萎病Sw-5b基因中的应用；
所述SNP724位点为序列1第59位，所述SNP位点的基因型为A/A纯合、G/G纯合或A/G杂合。
2.检测番茄基因组中SNP724位点的多态性或基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定番茄基因组中是否含有抗斑萎病Sw-5b基因的产品中的应用；
所述SNP724位点为序列1第59位，所述SNP位点的基因型为A/A纯合、G/G纯合或A/G杂合。
3.检测番茄基因组中SNP724位点的多态性或基因型的物质在鉴定或辅助鉴定番茄是否抗斑萎病中的应用；
所述SNP724位点为序列1第59位，所述SNP位点的基因型为A/A纯合、G/G纯合或A/G杂合。
4.检测番茄基因组中SNP724位点的多态性或基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定番茄是否抗斑萎病的产品中的应用；
所述SNP724位点为序列1第59位，所述SNP位点的基因型为A/A纯合、G/G纯合或A/G杂合。
5.根据权利要求1-4中任一所述的应用，其特征在于：
所述检测番茄基因组中SNP724位点的多态性或基因型的物质为如下1)或2)：
1)、扩增所述SNP724位点的成套引物；
2)、含有所述成套引物的PCR试剂或试剂盒。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述成套引物由序列2-4所示的单链DNA分子组成。
7.一种鉴定或辅助鉴定待测番茄基因组中是否含有抗斑萎病Sw-5b基因的方法，包括如下步骤：检测待测番茄基因组SNP724位点基因型为A/A纯合、G/G纯合或A/G杂合，若所述待测番茄基因组SNP724位点基因型为A/A纯合或A/G杂合，则所述待测番茄含有或候选含有抗斑萎病Sw-5b基因；若所述待测番茄基因组SNP724位点基因型为G/G纯合，则所述待测番茄不含有或候选不含有抗斑萎病Sw-5b基因；
所述SNP724位点为序列1第59位。
8.一种鉴定或辅助鉴定待测番茄是否抗斑萎病的方法，包括如下步骤：检测待测番茄基因组SNP724位点基因型为A/A纯合、G/G纯合或A/G杂合，若所述待测番茄基因组SNP724位点基因型为A/A纯合或A/G杂合，则所述待测番茄抗斑萎病或候选抗斑萎病；若所述待测番茄基因组SNP724位点基因型为G/G纯合，则所述待测番茄不抗斑萎病或候选不抗斑萎病；
所述SNP724位点为序列1第59位。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述检测待测番茄基因组SNP724位点基因型为A/A纯合、G/G纯合或A/G杂合的方法为如下：
1)直接测序；
或，2)用权利要求1-6任一所述应用中的所述检测番茄基因组中SNP724位点的多态性或基因型的物质对待测番茄进行PCR扩增，得到扩增产物，检测扩增产物中SNP724位点基因型。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述检测扩增产物中SNP724位点基因型采用ArrayTape平台检测或荧光定量PCR仪检测。
11.鉴定或辅助鉴定番茄是否抗斑萎病的试剂盒，包括权利要求1-6任一所述应用中的所述检测番茄基因组中SNP724位点的多态性或基因型的物质。
12.权利要求1-6任一所述应用中的所述检测番茄基因组中SNP724位点的多态性或基因型的物质在培育抗斑萎病番茄或抗斑萎病番茄育种中的应用。
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