CN110205396B - 一种与黄瓜果实不规则条纹性状紧密连锁的snp标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供的一种与黄瓜果实不规则条纹性状紧密连锁的SNP标记的特征在于：该SNP标记与黄瓜果实不规则条纹基因紧密连锁，该标记正反向引物序列分别为：5′GACCTCCCAACCCCTGATTTTTT 3′和5′ATCGTTCGCCGTCTTACCTGACT 3′。标记扩增长度为675bp，所述SNP位点位于正向扩增第440bp位点，存在A/G多态性。GG基因型为有不规则条纹黄瓜，AA及AG基因型为无不规则条纹黄瓜。本发明公开的与黄瓜果实不规则条纹性状基因紧密连锁的SNP分子标记属于共显性标记，可靠且检测快捷，可用于黄瓜果实表皮相关性状的定向遗传育种。对于加快黄瓜品种的遗传改良进程，提高育种选择效率具有重要的理论和实践指导意义。

Description

一种与黄瓜果实不规则条纹性状紧密连锁的SNP标记及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程和分子生物学，属于分子遗传育种领域，提供了与黄瓜果实不规则条纹性状相紧密连锁的SNP分子标记及其应用，可用于黄瓜不规则条纹性状的分子标记辅助选择育种，以提高育种效率。

技术背景

黄瓜(Cucumis sativus L.2n＝2x＝14)属葫芦科甜瓜属一年生蔓生草本植物，是世界上十大蔬菜作物之一。果实表皮特征是黄瓜商业和营养价值最重要的决定因素之一，具有丰富的遗传多样性。近年来，许多遗传研究都集中在黄瓜的外皮特征上，包括果实表面色泽，表面纹理特征和刺瘤状态等。

果实条纹颜色是瓜类蔬菜作物的典型特征之一，尤其出现在甜瓜，西瓜及南瓜上。其出现的主要原因是色素在果皮上不同的积累程度所造成的。果实条纹的颜色、多少、分布均受到遗传水平的调控。在南瓜上，南瓜的果皮斑纹是由一系列基因所调控(宽条纹l-I^Bst，窄条纹l-I^st，不规则条纹l-I^ist)，且这些基因与果实深绿基因L-i及浅绿色基因l-I存在明显的显隐性关系(L-i＞l-I^Bst＞l-I^st＞l-I^ist＞l-I)。这种果实条纹性状的多基因调控模式同样存在于西瓜及西葫芦上。而在甜瓜上，薄皮甜瓜果皮花斑性状是由单基因控制的质量性状，有斑对无斑为显性，并命名该基因为CmSp-1。果实条纹同样存在于其他园艺作物，如苹果，柑橘等。而对于其他作物，条纹颜色主要出现在叶片或者茎秆上。并且与果皮转色类似，果实条纹也会随着发育阶段存在变化。而黄瓜果皮通常均一色的。但与均匀色外皮相反，一些黄瓜品种可能有网状或斑驳的外皮。已经确定了几种与表皮特征有关的遗传和调节机制，例如黄瓜成熟期网纹基因(H)以及黄瓜果实斑驳基因(U)，但如今对黄瓜果实不规则条纹性状的研究仍是空白的，这给黄瓜果实表皮相关性状的遗传改良和分子标记辅助育种带来了困难。

SNP标记一般只有两种等位基因型，可以较为容易的区分纯合基因型和杂合基因型，具有数量巨大、分布密度大、检测快速等优点。近几年来，高通量测序技术的发展(SLAF-seq，BSA-seq，RAD-seq等)，使得SNP标记的开发更加简便。利用高通量测序技术结合图位克隆等连锁分析手段开发与黄瓜果实不规则条纹性状相连锁的SNP标记，相信定会加快黄瓜果实表皮相关性状的定向遗传育种的进程。

发明内容

(一)技术问题

本发明涉及一个与黄瓜果实不规则条纹基因共分离的SNP分子标记，该SNP标记与黄瓜果实不规则条纹性状密切相关，可以为后续的果实不规则条纹基因的克隆与功能研究，以及果实不规则条纹黄瓜新材料的创制提供基础，显著提高其优质育种定向选择效率。

(二)技术方案

本发明提供的一种与黄瓜果实不规则条纹基因紧密连锁的分子标记的特征在于：有一个SNP标记与黄瓜果实不规则条纹基因紧密连锁，所述SNP分子标记引物SF-SNPI正向引物为：SEQ ID NO：2，反向引物：SEQ ID NO：3。

上述提供的用于检测黄瓜果实不规则条纹基因的分子标记方法为：

(1)提取待测黄瓜的基因组DNA。

(2)将所述的分子标记引物SF-SNPI加入PCR反应体系，并对黄瓜基因组的DNA进行PCR扩增；

PCR扩增反应体系为：PCR扩增反应的总体系为24μl，包括：2×Taq MasterMix12.0μL，ddH2O 9.0μL，正、反向引物各1μL，DNA1.0μL。反应程序为95℃预变性5min；94℃变性45s，60℃退火45s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

扩增产物进行一代Sanger测序，分析测序结果，扩增序列如SEQ ID NO：1所示，位于测序序列其正向扩增第440位点的A/G多态性，基于该位点SNP多态性判读基因型为AA、GG以及AG三种基因型，根据基因型确定黄瓜果实不规则条纹的有无：AA基因型为有不规则条纹黄瓜，GG及AG基因型为无不规则条纹黄瓜。

(三)有益效果

(1)通过筛选获得与黄瓜果实不规则条纹基因紧密连锁的分子标记SF-SNPI，为分子标记辅助育种和克隆基因奠定了基础。利用本发明与黄瓜果实不规则条纹基因紧密连锁的分子标记，进行果实不规则条纹基因的鉴定，在包含1578个单株的样品中选择效率均为100％。

(2)通过本发明分子标记定位的基因位点精确，鉴定方便。由于这个标记与黄瓜果实不规则条纹基因紧密连锁，因此，在苗期就可以用上述的分子标记方法测定植株的果实表型，有效解决了表型鉴定结果可靠性低、费时、成本高、难度大等问题，简便又快速。

(3)本发明提供的分子标记可广泛应用于分子辅助育种中果实不规则条纹基因的分子检测，实现基因的产业化分子育种。

附图说明

附图1为黄瓜果实不规则条纹突变体与野生型WT商品果实表型比对图。

附图2为引物SF-SNPI扩增序列测序结果峰图，图中箭头所指为其正向扩增第440核苷酸位点的不同的基因型，由上而下分别为GG、GA和AA型。

具体实施方式

黄瓜果实不规则条纹性状连锁分子标记，是通过以下方法获得的：

(1)黄瓜果实不规则条纹性状的获得及遗传分析

黄瓜果实不规则条纹突变体ist是于田间发现的自然突变体，其野生型亲本为北方密刺黄瓜品种‘长春密刺’，与野生型均一色果实不同，突变体果实表现为果实底色为黄绿色，一端密布深绿色条纹，一端条纹较为稀疏。利用这两个亲本材料配置F₁，F₁代自交产生F₂代。统计148个F₂群体的表型，并用卡方分析法进行验证，得出黄瓜果实不规则条纹基因为单基因控制的隐性性状。

(2)黄瓜基因组DNA的提取

按常规方法-CTAB法提取亲本，F₁及全部F₂分离群体的叶片总DNA。

(3)利用BSA-seq方法初定位黄瓜果实不规则条纹基因

利用群体分离法(BSA)从F2分离群体中分别随机选取果实不规则条纹突变单株和均一色单株个体各20株，建立果实不规则条纹(s)和均一色(u)的基因池。采用IllumineHiSEQ 2500测序平台对双亲及两混池进行全基因组重测序。去除低质量测序reads后，利用BWA和SAMtools软件将测序数据比对黄瓜参考基因组(‘Chinese Long’参考基因组)进行SNP指数计算。使用1Mb大小的窗口进行滑窗分析，每次步移100Kb，以窗口为横坐标，SNP-index为纵坐标，可以得到SNP-index在基因组上的分布曲线。并对所有染色体的SNP-index进行绘图，同时画出两个极端池在同一染色体同一窗口的ΔSNP-index绝对值在染色体上的分布，ΔSNP-index绝对值越大，表示与性状连锁的可能性也越大，同时作出置信区间为90％的阈值线，超过阈值线视为差异显著，认为是候选区域。结合SNP-index曲线与卡方分布的结果，我们确定了潜在的候选区域，为黄瓜1号染色体0-1.9Mb区域。

(4)候选基因的精细定位及连锁标记的开发

利用另一果皮均一色品种Hazerd与突变亲本ist进行杂交、自交后产生的F₂群体进行候选基因的精细定位。首先对双亲进行全基因组重测序。分析测序数据，在初定位区域内寻找Indel及SNP差异，提取差异位点两侧序列(各400bp)，采用引物设计软件PrimerPremier 5.0进行引物设计，在两个亲本间进行PCR扩增，Indel标记使用6％变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳检测，SNP标记采用一代Sanger测序进行多态性检测。其中19对引物有多态性(16对Indel标记及3对SNP标记)。用1578个F₂群体对18对多态性引物进行进一步筛选，寻找标记基因型与性状表现型的差别，获得标记与果实不规则条纹基因ist的交换单株。位于基因两侧的多态性标记向交换单株逐渐减少的方向步移，将目标区段缩小至引物SF-SNP-1和SF-SNP-17之间，而标记SF-SNPI重组株为0。用JoinMap 4软件对SSR标记的结果结合植株表型绘图，结果表明不规则条纹基因ist和标记SF-SNPI共分离。

(5)标记引物SF-SNPI在黄瓜果实不规则条纹基因与均一色黄瓜构建的F₂中的分子检测

利用标记引物SF-SNPI在双亲、F1和F2材料中进行PCR扩增测序检测(条件和方法同上)。结果表明：对于引物SF-SNPI，在果实不规则条纹基因亲本和果实不规则条纹基因F₂中都能检测出GG的基因型，而在果实均一色亲本检测出AA的基因型，在果实均一色F₂扩增检测出AA或者AG的基因型(图2)。

Claims (2)

1.一种SNP标记检测方法在黄瓜果实条纹性状鉴定中的应用，其特征在于，该SNP标记与黄瓜果实不规则条纹基因紧密连锁，所述的SNP标记的位点为黄瓜‘Chinese Long’基因组v2版本参考序列黄瓜1号染色体998383核苷酸位点上，具有A/G的多态性，所述的黄瓜品种为‘长春密刺’；

设计引物对，以黄瓜基因组DNA为模板进行PCR扩增，所述的引物对名称及正反向序列分别为：SF-SNPI，正向引物为：SEQ ID NO：2，反向引物：SEQ ID NO：3，扩增序列如SEQ IDNO：1所示，扩增长度为675bp，所述SNP标记位于扩增产物第440bp位点，存在A/G多态性；

所述SNP标记检测方法，包括以下步骤：

(1)提取黄瓜叶片组织样品总DNA；

(2)用已提取的黄瓜基因组DNA为模板，使用所述的引物对SF-SNPI进行PCR扩增；

(3)扩增产物进行测序，分析测序结果，分析位于扩增产物序列第440bp位点的A/G多态性；

(4)基于该位点SNP多态性判读基因型为AA、GG以及AG三种基因型；

(5)根据基因型确定黄瓜果实不规则条纹的有无：GG基因型为有不规则条纹黄瓜，AA及AG基因型为无不规则条纹黄瓜。

2.权利要求1所述的引物对在筛选黄瓜果实不规则条纹性状的辅助育种中的应用，所述引物对如序列SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示，使用所述的引物对进行PCR扩增，根据扩增产物判读如权利要求1所述SNP标记的基因型，根据基因型确定黄瓜果实不规则条纹的有无：GG基因型为有不规则条纹黄瓜，AA及AG基因型为无不规则条纹黄瓜，所述黄瓜品种为‘长春密刺’。

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