CN108060162B - 与黄瓜抗疫病性状紧密连锁的snp分子标记及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了与黄瓜抗疫病性状紧密连锁的SNP分子标记及其应用。本发明筛选的分子标记Cs3419019与黄瓜抗疫病性状紧密连锁，可直接用于黄瓜抗疫病辅助育种工作。根据该标记设计的CAPs标记扩增引物可以简便快捷的用于黄瓜抗疫病材料的筛选。本发明不仅能够加快育种进程，降低育种成本，提高育种效率，还能够推进传统育种向分子育种的转变。本发明技术方法具有快速、准确、操作简单等优点，具有较大的应用前景。

Description

与黄瓜抗疫病性状紧密连锁的SNP分子标记及其应用
技术领域
本发明属于农业生物技术领域，具体涉及与黄瓜抗疫病性状紧密连锁的SNP分子标记及其应用。
背景技术
疫病是黄瓜的重要病害之一，由瓜类疫霉(PhytophthoramelonisKatsura)引起，在全国各黄瓜产区均有发生，特别是华南地区春、夏季节雨水多、湿度大，易引起疫病的暴发和传播。该病一旦发生，化学药剂难以控制，损失严重，一般年份减产30％，病害流行年份则几乎绝收，对黄瓜生产和育种构成严重威胁。目前，黄瓜资源中抗疫病材料及其匮乏，对黄瓜的抗疫病育种工作带来极大困难。
传统抗病育种，一般采用人工接种的方法鉴定黄瓜抗感性状，但是作为繁殖或者转育的材料，如果接种后将其移植大田，病原菌会很快传播到其他材料，后期防治困难，会给育种及生产工作造成很大损失。随着生物技术的快速发展，分子辅助育种已经开始应用，能够在苗期对植株进行分子检测，选择含有与目标性状连锁的分子标记的植株，从而加速育种进程，提高育种效率。
发明内容
本发明的目的在于公开一种与黄瓜抗疫病性状紧密连锁的SNP分子标记及其应用。
本发明所采取的技术方案是：
与黄瓜抗疫病性状紧密连锁的SNP分子标记，其为分子标记Cs3419019，其特征在于，所述分子标记定位与黄瓜第5号染色体上，位于抗疫病基因的一侧。
根据权利要求1所述的与黄瓜抗疫病性状紧密连锁的SNP分子标记，其特征在于，所述分子标记Cs3419019包含SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，所述SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列自5’端起第174位碱基为SNP位点，其碱基为C或者T；当碱基全为T时或者为T/C时，与分子标记连锁的性状表现为抗病；当碱基全为C时，植株性状表现为感病。
用于扩增权利上述SNP分子标记的引物对。
优选的，该引物对为CAPs引物对。
优选的，该引物对的序列是：
Cs-CAPs-F:5’-GATTGATGTCGGGGAAGATG-3’(SEQ ID NO:2)；
Cs-CAPs-R:5’-TTTCCTTGGCCGTCATATCT-3’(SEQ ID NO:3)。
一种黄瓜抗疫病能力的检测试剂盒，试剂盒中含有检测SNP分子标记Cs3419019的试剂。
一种黄瓜抗疫病辅助育种的方法，包括如下步骤：
1)提取待测黄瓜基因组DNA；
2)用特定的引物对进行PCR扩增；
3)用限制性内切酶进行酶切，根据酶切结果，判断植株的抗病性。
本发明的有益效果是：本发明可对黄瓜的育种后代进行苗期抗病性检测，有效地将含有抗疫病性状的植株保留下来。本发明不仅能够加快育种进程，降低育种成本，提高育种效率，还能够推进传统育种向分子育种的转变。本发明技术方法具有快速、准确、操作简单等优点，具有较大的应用前景。
附图说明
图1是F2群体中部分植株的SNP检测情况；J为母本JSH，B为父本B80，1-18为抗性单株；19-33为感病单株。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
实施例1
1、遗传群体的构建
供试材料抗病亲本JSH为本单位搜集的地方资源经多年鉴定选育而成的高代自交系。感病材料B80为华北型高代自交系。JSH和B80杂交获得F1代，F1自交获得F2群体，用于抗病性状遗传分析和定位群体。
2、供试材料抗疫病性状的确定及遗传规律分析
以抗病亲本JSH和感病亲本B80构建F1和F2遗传分离群体，以P.melonis疫霉菌接种进行表型鉴定。结果显示：接种24h后50z株感病亲本绝大部分根部开始溢缩。接种72h全部死亡。而50株抗病亲本JSH死亡2株，50株F1群体，死亡2株，260株F2群体中191株表现抗病，69株表现感病，抗感分离比符合3:1(χ2＝0.33，P>0.05)。分析结果表明，JSH抗疫病性状由1个单显性基因控制。
3、基于SLAF-seq super BSA技术，对黄瓜抗疫病基因的精细定位
本项目利用SLAF-seq super技术结合集群分离分析方法(BSA)，将黄瓜JSH抗性基因进行定位，在黄瓜第5号染色体上，定位到一个关联区域，命名为Cs3419019，关联区域的大小约为200Kb，其序列是：
GCTTCCTTGTCCAAGACATAGATTCTCCTAGTTCTGAAGACGTGGTTAGTGCCAGAGAATCCCTTTCAAGCGAAGAAAGGTGCTCCAATGTTGAATTTTTAGATGAAGCCTTCTGCTCTTTGTTGGAAGGGGAGGGGAGTTCAAGACGGATCACAGCTGATAGTTCATTGGTACTGAATTCGGACTCCTCTGACTCAGACTCCTCGGATGATCTGGATCTTAGTCAGACCTTTCCCTCCACTGATGGAATGGAAGAGCCCTATCTAG(SEQ ID NO:1)。
4、CAPs标记的开发、扩增。
在定位区间内获得69个SNP位点，下载69个SNP位点上下游300bp的核苷酸序列，寻找可酶切的CAP标记位点。完成SNP到CAPs标记的转化。
用于扩增Cs3419019标记的引物对序列如下：
Cs-CAPs-F:5’-GATTGATGTCGGGGAAGATG-3’(SEQ ID NO:2)；
Cs-CAPs-R:5’-TTTCCTTGGCCGTCATATCT-3’(SEQ ID NO:3)
如果SNP碱基位点为C时，会被MspA1Ⅰ识别并切割，被切成174bp和131bp两条片段。当出现不被切开或者部分切开的片段时，植株表现为抗病性状，当出现被完整切成两条较短片段时，植株表现为感病性状。
PCR体系(20μl)
DNA模板：5ng
引物正向：0.5μl
引物反向：0.5μl
dNTP:2.0μl(使用浓度2.0Mm)
Mg2+:1.2μl(使用浓度2.5mM)
10×PCR buffer:2.0μl
Taq酶：0.2μl
ddH20:补足20μl
PCR扩增程序：
94℃预变性5min后，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸40s，40个循环后，72℃保持7min，然后置于16℃保存待检测。
酶切体系10μl，内切酶0.3μl，buffer1μl，PCR产物5μl，ddH2O补足10μl。
在亲本间进行PCR扩增，酶切后在浓度为3％琼脂糖凝胶电泳检测，亲本间表现特异性，并在F2代群体中筛选出抗感极端株共33株进行检测(图1)。后代表型与亲本表现差异一致。可以用来鉴定黄瓜的抗疫病性状。
效果检测
随机取F2代分离群体61株，进行人工接种鉴定，确定表型后，提取基因组DNA，用实例1的方法进行PCR扩增，并用内切酶进行酶切。结果，在抗病株中，有4株基因型为感病株，感病株中有2株表现为抗病基因型。因此检测效率为90.2％。可以用于分子辅助育种。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东省农业科学院蔬菜研究所
<120> 与黄瓜抗疫病性状紧密连锁的SNP分子标记及其应用
<130>
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 267
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gcttccttgt ccaagacata gattctccta gttctgaaga cgtggttagt gccagagaat 60
ccctttcaag cgaagaaagg tgctccaatg ttgaattttt agatgaagcc ttctgctctt 120
tgttggaagg ggaggggagt tcaagacgga tcacagctga tagttcattg gtactgaatt 180
cggactcctc tgactcagac tcctcggatg atctggatct tagtcagacc tttccctcca 240
ctgatggaat ggaagagccc tatctag 267
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gattgatgtc ggggaagatg 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tttccttggc cgtcatatct 20

Claims (3)

1.SNP分子标记在检测黄瓜抗疫病性状中的应用，所述SNP分子标记为SEQ ID NO:1所示核苷酸序列自5’端起的第174位碱基，其碱基为C或者T，所述SNP分子标记定位于黄瓜第5号染色体上，位于抗疫病基因的一侧；当所述分子标记碱基全为T时或者为T/C时，与分子标记紧密连锁的性状表现为抗病；当所述分子标记碱基全为C时，与分子标记紧密连锁的性状表现为感病。
2.一种黄瓜抗疫病能力的检测试剂盒，试剂盒中含有检测权利要求1中所述的SNP分子标记的试剂；所述检测权利要求1中所述的SNP分子标记的试剂为CAPS引物对，其序列是：
Cs-CAPs-F: 5’- GATTGATGTCGGGGAAGATG -3’；
Cs-CAPs-R: 5’- TTTCCTTGGCCGTCATATCT-3’。
3.一种黄瓜抗疫病辅助育种的方法，包括如下步骤：
1）提取待测黄瓜基因组DNA；
2）用权利要求2中所述引物对进行PCR扩增；
3）用限制性内切酶MspA1Ⅰ对PCR扩增产物进行酶切，根据酶切结果，判断植株的抗病性；当出现不被切开或者部分切开的片段时，植株表现为抗病性状，当出现被完整切成两条较短片段时，植株表现为感病性状。
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