CN102094091B

CN102094091B - 基于琼脂糖凝胶变性复性及生物素亲和吸附的自发突变基因的分离检测方法

Info

Publication number: CN102094091B
Application number: CN 201010591216
Authority: CN
Inventors: 李春雨; 易干军; 孙清明
Original assignee: Pomology Research Institute Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Pomology Research Institute Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2010-12-15
Filing date: 2010-12-15
Publication date: 2013-01-02
Anticipated expiration: 2030-12-15
Also published as: CN102094091A

Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及一种突变基因的分离检测方法，用生物素标记野生型DNA片段，将生物素标记的野生型DNA片段与待检测的DNA片段混合，进行变性和复性；此时含有突变位点的DNA片段因为没有相同迁移率的生物素标记野生型DNA片段与之杂交而无法形成异源双链DNA分子；而不含有突变位点DNA片段与相应的生物素标记野生型DNA片段杂交，形成异源双链DNA分子，从而带有生物素标记；再采用链霉亲和素磁珠吸附，将带有生物素标记的分子吸附回收，实现含有突变位点的DNA片段的分离。本发明方法相对于现有方法更加简便而灵敏，可以准确识别检测突变位点，可靠性强。

Description

基于琼脂糖凝胶变性复性及生物素亲和吸附的自发突变基因的分离检测方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种基于琼脂糖凝胶变性复性及生物素亲和吸附的自发突变基因的分离方法。

背景技术

香蕉是仅次于水稻、小麦和玉米的全世界第四大粮食作物。据联合国粮农组织(FAO)统计，近10年来，世界香蕉种植面积总体上呈增长的趋势， 2007年种植面积为6615.75万亩，产量达到8126.34万吨，创历史新高。2007年中国香蕉收获面积为458.25万亩，列世界第5位；总产量732.50万吨，排世界第2位。但是该产业的发展正遭受到枯萎病的毁灭性威胁，病原菌为尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp. cubense)。病原菌从香蕉幼根或根部损伤部位侵入球茎、假茎，引起维管束褐变和系统侵染, 造成植株整株枯死。病原菌属于土传真菌，在土壤中可以存活长达30年。

香蕉枯萎病已经造成相当大的危害。上个世纪，病原菌1号（Foc1）生理小种破环了中美洲数千个香蕉园，现在世界范围内对香蕉产业的发展造成毁灭性的威胁为4号（Foc4）生理小种，已经导致我国台湾地区香蕉种植面积锐减为原来的十分之一。大陆地区种植的香（大）蕉中，90%以上为易感Foc4的香牙蕉品种，2003年发病面积已经达到2万公顷，并有迅速蔓延的趋势。

目前还没有找到一种有效的防治香蕉枯萎病的化学药剂, 香蕉只能在不含病菌的土壤上生长。抗病育种是当前解决香蕉枯萎病比较有希望的途径。现在生产上已经筛选到一些抗病突变体，如果能够克隆这些突变基因，再进一步转化到一些优良品种中，就可以控制该病害。

对于这样的自然突变，目的基因的染色体位置、序列以及产物的序列和功能等信息都是未知的，克隆该类基因的一个方法是图位克隆法，即先构建杂交群体，进行染色体定位，最后通过染色体步行法分离该基因。但是图位克隆法较为适合那些生育周期比较短、有饱和遗传连锁图谱、染色体比较小、基因组中重复序列不多、已经构建了成熟的遗传转化系统的物种。香蕉显然不具备这些条件，虽然现已构建了一些群体，但其遗传图谱的饱和度还比较低，分子标记间的平均距离在10cM以上，较长的童期影响了F2代群体的构建，香蕉基因组大小为600M以上，重复序列多影响了染色体步行的进行。所以利用图位克隆法分离该突变基因还存在很大的困难。另外一个方法是表型克隆法，仅仅根据有关基因的突变产生的表型变化就直接分离该基因的克隆策略，而不必事先探知其生化功能或图谱定位，甚至也不需假设基因的数目或其相互作用的方式，即将表型与基因结构或基因表达的特征联系起来，从而分离特定表型相关基因。但是现有的表型克隆方法，如基因组扣除法，由于不能解决酶切片段间的特异性杂交问题，从而限制了它们的进一步应用。

发明内容

本发明的目的在针对现有技术的不足，提供一种利用MutS蛋白在基因组范围内检测单核苷酸多态性或小的插入和缺失的方法。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

发明提供了一种突变基因的识别和分离方法，包括以下步骤：用生物素标记野生型DNA片段，将生物素标记的野生型DNA片段与待检测的DNA片段混合，进行变性和复性；此时含有突变位点的DNA片段因为没有相同迁移率的生物素标记野生型DNA片段与之杂交而无法形成异源双链DNA分子，而裸露在外；而不含有突变位点DNA片段与相应的生物素标记野生型DNA片段杂交，形成异源双链DNA分子；再采用链霉亲和素磁珠吸附，将带有生物素标记的分子吸附回收，实现不带有生物素的含有突变位点的DNA片段的分离。

在将生物素标记的野生型DNA片段与待检测的DNA片段混合时，需要采用过量的野生型DNA片段与少量的待检测的DNA片段混合，两者摩尔比例为20-50:1。

被分离出来的突变位点的DNA片段，可以根据两端连接的接头序列，而被扩增出来，可以根据序列分析其突变的机理。

上述的野生型DNA片段与待检测的DNA片段，是将野生型和突变体基因组DNA分别提取并采用限制性内切酶进行消化，并进一步连接接头获得的。该限制性内切酶采用可以利用识别4或6碱基的，并且能够产生粘性末端的限制性内切酶，以便连接接头。

将野生型和突变体基因组酶切后获得的DNA片段分别连接接头，所采用的接头均为SEQ ID NO:1（5‘-CATGCTTGTAGACTCACA-3’）和SEQ ID NO:2（3’-ACGAACATCTGAGTGTGC-5’），不同的是其中野生型DNA片段连接的是经生物素标记的接头，而突变体DNA片段连接的是经非生物素标记的接头。

之后，再将野生型DNA片段与待检测的DNA片段进行混合和变性、复性处理。生物素标记的野生型DNA片段与待检测的DNA片段的变性和复性过程，可以采用琼脂糖凝胶电泳法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法、毛细管电泳法、或液相色谱法来实现。优选采用琼脂糖凝胶电泳法，其步骤为：

琼脂糖凝胶电泳法的步骤为：（1）电泳：在2.0-2.5%的琼脂糖凝胶上电泳，电压为20-30V，至溴酚蓝指示线到达凝胶中前部；（2）杂交：切取含有DNA的凝胶部分，放置在变性液（0.5M NaOH, 0.6M NaCL）中，室温下变性30-40分钟，再利用新鲜的变性液重复一次，用蒸馏水清洗2次，放置于复性缓冲液50%（W/V）甲酰胺， 25mM 磷酸钠缓冲液（PH6.8），1M NaCL, 5mM EDTA, 10% （W/V）聚乙二醇PEG8000）内，室温下复性20-30分钟，重复复性3次，每次均为20-30分钟，并用新鲜的缓冲液，最后凝胶块放置在复性缓冲液中24-36小时，温度为45℃，最后用TE缓冲液冲洗2-3次。

复性处理后，含有突变位点的DNA片段将不带有生物素标记，此时利用链霉亲和素磁珠吸附：利用过量的磁珠吸附回收生物素标记的片段，并重复吸附回收2-3次，即可实现带有生物素DNA片段与含有突变位点的DNA片段的分离，获得这些含有突变位点的DNA片段。

进一步将这些片段进行生物信息学分析测序结果，可分析与突变分子机理。

可以采用以下优选方法进行突变基因分离检测：

1、提取野生型和突变体基因组DNA；

2、取5μg野生型基因组DNA和0.1μg突变体基因组DNA；

3、利用适量的Taq I限制性内切酶完全消化上述基因组DNA；

4、连接接头，接头序列为：

SEQ ID NO:1 5‘-CATGCTTGTAGACTCACA-3’

SEQ ID NO:2 3’-ACGAACATCTGAGTGTGC-5’

接头的下链要利用T4 多核苷酸激酶，反应体系根据不同公司的产品进行确定。连接体系为50μl，野生型基因组DNA连接体系具体成分如下：5.0μl 10x反应缓冲液，3x10³pmol生物素标记的接头,基因组酶切片段。连接反应时间在10小时以上。突变体基因组DNA连接体系具体成分如下：5.0μl 10x反应缓冲液，60pmol非生物素标记的接头,基因组酶切片段。连接反应时间在10小时以上；

5、混合：将上述连接了接头的野生型基因组DNA片段和突变体基因组DNA片段混合；

6、电泳：在2.0%的琼脂糖凝胶上电泳，电压为20-30V，至溴酚蓝指示线到达凝胶中前部；

7、杂交：切取含有DNA的凝胶部分，放置在变性液（0.5M NaOH, 0.6M NaCL）中，室温下变性30分钟，再利用新鲜的变性液重复一次，用蒸馏水清洗2次，放置于复性缓冲液（50%甲酰胺， 25mM 磷酸钠缓冲液（PH6.8），1M NaCL, 5mM EDTA, 10% （W/V）聚乙二醇PEG8000）内，室温下复性20分钟，重复复性3次，每次均为20分钟，并用新鲜的缓冲液，最后凝胶块放置在复性缓冲液中24小时，温度为45℃，最后用TE缓冲液冲洗两次；

8. DNA片段的回收：利用凝胶回收试剂盒回收DNA片段；

9、链霉亲和素磁珠吸附：利用过量的磁珠吸附回收生物素标记的片段，并重复吸附回收2-3次；

10、重复步骤7、8和9一次；

11、PCR扩增：以上述吸附回收后的溶液为模板，进行PCR扩增，引物序列为SEQ ID NO:3：CATGCTTGTAGACTCACA，退火温度为55℃，延伸时间为1.0分钟；电泳检测电泳结果，并回收扩增片段，进行测序；

12、生物信息学分析测序结果，分析与突变分子机理。

本发明方法中，最关键的一步在于能够实现两个相似的基因组DNA限制性消化片段特异性的杂交，其原理是根据序列一致或相似的DNA片段在凝胶的电泳迁移率相同或基本相同，变性并复性后能够特异性地形成含有错配单链区域的异源双链DNA分子，该错配单链区域能够被Mut S蛋白特异性地识别并结合，进而通过生物素进行亲和吸附。本发明采用的杂交条件是在多次试验摸索下总结出来的优化选择，在该条件下可进行充分杂交，再结合链霉亲和素磁珠吸附回收，可以提高突变位点的识别检测的准确率高，准确率达到80%。

本发明的创造性在于克服了现有突变检测技术仅仅能够检测单基因已知或未知的突变，实现了全基因范围内对变异位点的准确而又快速的扫描。

现有能够克隆自发突变基因的技术有图位克隆法，但是该方法需要建立一个比较大的杂交群体，以靠无性繁殖的苹果为例，建立一个F2代杂交群体需要20年的时间，香蕉也需要4-5年，癌症也是一种自发突变，克隆原癌基因对于人类健康尤其重要，但是由于伦理的原因，不能够建立人的F2代群体，另外该方法还要求研究对象的基因组比较小、重复序列少、有高密度的遗传图谱等，因此现有条件限制了该方法高效地克隆自发突变基因，本发明方法可以有效地解决以上方法的局限性，仅仅需要3-5天的时间，就能对突变体基因组DNA实现完全扫描，找到突变的SNP或INDEL位点。

具体实施方式

以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案。

实施例1 突变位点的识别检测

1、从叶片中提取巴西蕉和农科1号香蕉的基因组DNA。

2、取5μg野生型基因组DNA（2.59x10^-17mol）和0.1μg突变体基因组DNA（DNA的分子量=碱基数＊324.5），作为研究对象；

3、利用适量的Taq I限制性内切酶完全消化上述基因组DNA（野生型基因组DNA消化成约62.16pmol个片段，突变体基因组DNA消化成约1.24pmol个片段）；

4、连接接头，接头序列为：

SEQ ID NO:1 5‘-CATGCTTGTAGACTCACA-3’

SEQ ID NO:2 3’-ACGAACATCTGAGTGTGC-5’

接头的下链要利用T4 多核苷酸激酶，反应体系根据不同公司的产品进行确定。连接体系为50μl，野生型基因组DNA连接体系具体成分如下：5.0μl 10x反应缓冲液，3x103pmol生物素标记的接头,基因组酶切片段。连接反应时间在10小时以上。突变体基因组DNA连接体系具体成分如下：5.0μl 10x反应缓冲液，60pmol非生物素标记的接头,基因组酶切片段。连接反应时间在10小时以上。

7、杂交：切取含有DNA的凝胶部分，放置在变性液（0.5M NaOH, 0.6M NaCL）中，室温下变性30分钟，再利用新鲜的变性液重复一次，用蒸馏水清洗2次，放置于复性缓冲液（50%甲酰胺， 25mM 磷酸钠缓冲液（PH6.8），1M NaCL, 5mM EDTA, 10% （W/V）聚乙二醇PEG8000）内，室温下复性20分钟，重复复性3次，每次均为20分钟，并用新鲜的缓冲液，最后凝胶块放置在复性缓冲液中24小时，温度为45℃，最后用TE缓冲液冲洗两次。

8. DNA片段的回收：利用凝胶回收试剂盒回收DNA片段；

9、连霉亲和素磁珠吸附：利用过量的磁珠吸附回收生物素标记的片段，并重复吸附回收2-3次；

重复步骤7、8和9一次。

试验结果：按照上述步骤进行操作，分离到20个DNA片段。

实施例2 突变位点测序

PCR扩增：以上述吸附回收后的溶液为模板，进行PCR扩增，引物序列为SEQ ID NO:3：CATGCTTGTAGACTCACA，退火温度为55℃，延伸时间为1.0分钟；电泳检测电泳结果，并回收扩增片段，进行测序。

测序结果：根据获得的序列设计引物，分别扩增上述两者的基因组DNA，扩增结果进行测序并进行比对，发现一个NBS-LRR类的抗病基因片段存在变异，序列如下(xxx代表缺失的序列)：

巴西蕉：SEQ ID NO:4 gggaatgggt ggagttggta agaccactct ggcacgtxxx atattcaatg atgaaaggat

农科1号蕉：SEQ ID NO:5 gggaatgggt ggagttggta agaccactct ggcacgtaaa atattcaatg atgaaaggat

巴西蕉：SEQ ID NO:6 cagagtcaat tttcccattc agaaatggtt gtatatctct aagaattatt cggagacg

农科1号蕉：SEQ ID NO:7 cagagtcaat tttcccattc agaaatggtt gtatatctct aagaattatt cggagacg

突变位点的识别检测和突变位点测序过程所需总时间仅5天。经3次验证结果准确无误。

<110> 广东省农业科学院果树研究所

<120> 基于琼脂糖凝胶变性复性及生物素亲和吸附的自发突变基因的分离检测方法

<130>

<160> 7

<170> PatentIn version 3.2

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

catgcttgta gactcaca 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

acgaacatct gagtgtgc 18

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

catgcttgta gactcaca 18

<210> 4

<211> 57

<212> DNA

<213> 巴西蕉

<400> 4

gggaatgggt ggagttggta agaccactct ggcacgtata ttcaatgatg aaaggat 57

<210> 5

<211> 60

<212> DNA

<213> 农科1号蕉

<400> 5

gggaatgggt ggagttggta agaccactct ggcacgtaaa atattcaatg atgaaaggat 60

<210> 6

<211> 58

<212> DNA

<213> 巴西蕉

<400> 6

cagagtcaat tttcccattc agaaatggtt gtatatctct aagaattatt cggagacg 58

<210> 7

<211> 58

<212> DNA

<213> 农科1号蕉

<400> 7

cagagtcaat tttcccattc agaaatggtt gtatatctct aagaattatt cggagacg 58

Claims

1.基于琼脂糖凝胶变性复性及生物素亲和吸附的自发突变基因的分离检测方法，其特征在于用生物素标记的野生型DNA片段，将生物素标记的野生型DNA片段与待检测的DNA片段混合，进行变性和复性；此时含有突变位点的DNA片段因为没有相同迁移率的生物素标记的野生型DNA片段与之杂交而无法形成异源双链DNA分子；而不含有突变位点的DNA片段与相应的生物素标记的野生型DNA片段杂交，形成异源双链DNA分子，从而带有生物素标记；再采用链霉亲和素磁珠吸附，将带有生物素标记的分子吸附回收，实现含有突变位点的DNA片段的分离；

所述生物素标记的野生型DNA片段与待检测的DNA片段两者混合的摩尔比例为20-50:1；

所述的野生型DNA片段和待检测的DNA片段分别是将野生型和突变体基因组DNA分别提取并采用限制性内切酶进行消化，并进一步连接接头获得的；

所述的野生型DNA片段和待检测的DNA片段所连接的接头均是SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，但野生型DNA片段连接的是经生物素标记的接头，而突变体DNA片段连接的是经非生物素标记的接头；

所述待检测DNA片段和野生型DNA片段的变性和复性，是采用琼脂糖凝胶电泳法来实现；

所述琼脂糖凝胶电泳法的步骤为：（1）电泳：在2.0-2.5%的琼脂糖凝胶上电泳，电压为20-30V，至溴酚蓝指示线到达凝胶中前部；（2）杂交：切取含有DNA的凝胶部分，放置在氢氧化钠-氯化钠变性液中，室温下变性30-40分钟，再利用新鲜的变性液重复一次，用蒸馏水清洗，放置于复性缓冲液内，室温下复性20-30分钟，再用新鲜的缓冲液重复复性3次，每次均为20-30分钟，最后凝胶块放置在复性缓冲液中24-36小时，温度为45℃，最后用TE缓冲液冲洗2-3次；

所述的变性液含有：0.5M NaOH, 0.6M NaCl；

所述的复性缓冲液含有：50%（W/V）甲酰胺， 25mM PH6.8的磷酸钠缓冲液，1M NaCl, 5mM EDTA, 10%（W/V）聚乙二醇PEG8000；

所述的方法不包括疾病的诊断和治疗方法。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的限制性内切酶采用利用识别4或6碱基的，并且能够产生粘性末端的限制性内切酶。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的限制性内切酶是Taq I限制性内切酶。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于实现所述的含有突变位点的DNA片段的分离后，将该片段进行PCR扩增和测序，检测分析突变基因。