CN101205560A

CN101205560A - 基于磁性纳米粒子与通用标签技术的高通量单核苷酸多态性检测方法

Info

Publication number: CN101205560A
Application number: CNA2007101924577A
Authority: CN
Inventors: 李松; 何农跃; 刘洪娜; 田岚
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2007-11-30
Filing date: 2007-11-30
Publication date: 2008-06-25

Abstract

本发明公开了一种利用磁性纳米粒子作为载体以及与通用标签探针技术相结合，针对基因组中单核苷酸多态性(SNP)进行多样本多位点分型的方法。其特征在于通过标记物之间的共价结合，直接将标记的PCR产物固定在磁性纳米粒子上，或者将标记的引物固定在磁性纳米粒子上直接进行固相PCR扩增，构成磁性纳米粒子－DNA复合体(MNPs－ssDNA)。然后通过MNPs－ssDNA与对应位点的检测探针以及标记的通用标签探针杂交，从而实现多样本多位点的高通量SNP检测。该方法最大的优势是利用通用标签技术实现了多位点分型时只需要一对经过标记的探针，大大降低了分型成本，同时利用了磁性纳米粒子易于分离等优点，克服了现有技术中对待检测靶序列进行纯化、浓缩而导致的成本高、费时、费力等缺陷，从而使该方法具有简便、高效、准确地对大量样品进行分型的优点。

Description

基于磁性纳米粒子与通用标签技术的高通量单核苷酸多态性检测方法

所属技术领域

本发明涉及一种应用磁性纳米粒子作为载体，与通用标签探针相结合的基因检测技术，尤其是一种适用于自动化、多位点、多样本、高通量、低成本的单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms，SNPs)检测方法。

背景技术

随着人类基因组计划(Human Genome Project，HGP)工作的完成，基因测序提供了研究遗传信息秘密的平台，把人类的全基因研究列入了视野范围，大大方便了基因家族的研究，基因结构的研究等。而SNPs标记的确立，不仅便利了遗传病的原因基因的克隆工作，也便利了单基因、多基因病等各种遗传病的研究工作。SNPs标记对临床医学也有重大意义，SNPs标记作为一种有效的遗传多态性标记物为临床医学服务的，比其它的遗传标记物更能真实的反映人种、人群及个体之间的遗传差异。

SNP是人类基因组中最常见的变异形式，一类较为普遍的多态性是基因组中散在的单个碱基的不同，这种不同虽然也含有单个碱基的缺失和插入，但更多的是单个碱基的置换，它在基因组中出现频率很高，据估计每300-1000个碱基中即出现一次，分布密度远大于微卫星重复序列等，因而成为目前最常用的第三代遗传标志物。理论上讲，SNP既可能是二等位多态性，也可能是3个或4个等位多态性，但实际上，后两者非常少见，几乎可以忽略。因此，通常所说的SNP都是二等位多态性的。SNP为数众多，分布广泛等自身的特性决定了它比其他多态性标记更适合于对复杂性状与疾病关系的遗传解剖和基于群体的基因识别等方面的研究。因此，对SNP检测方法的开发具有时间上的紧迫性。

随着对SNPs研究的广泛关注，检测技术得到了迅速的发展，出现了许多SNPs检测技术。目前对SNPs研究的热点集中于SNP与复杂疾病的易感性研究，SNPs与疾病的关联研究，SNPs与药物基因组学等各方面的研究中，由于有众多基因和环境因素的参与，有必要对来自不同种群的大量样本的不同的SNPs位点同时进行检测。因此，建立一种高通量、低成本且适用于多样本、多位点的分型方法是非常必要的。传统的SNP检测方法是采用一些已有的成熟技术，如DNA测序、限制性酶切片段长度多态性(RFLP)、等位基因特异的寡聚核苷酸杂交(ASO)等。传统的RFLP只能检测到SNP的一部分，但必须通过凝胶电泳进行检测，测序技术既费时费力，又不易实现自动化，而且DNA链的二级结构还容易造成人工假象，使测序结果出现偏差，不适宜于SNP的检测；通过序列结构不同对SNP检测的方法(如SSCP等)，则很难满足自动化的需要，难以大规模开展工作。而DNA列阵的微测序法、动态等位基因特异的杂交、寡聚核苷酸特异的连接以及TaqMan系统等都必须首先进行靶序列的扩增，然后才能进行其它检测，费时又费力，且这些方法难以满足高通量分型的要求。

随着纳米技术的迅速发展，纳米材料逐渐被应用到生命科学领域，为其研究和发展提供了新的技术和手段。由于磁性纳米粒子分离生物分子时具有分离速度快、效率高、可重复使用、操作简单、不需要昂贵的仪器以及不影响分离物质的活性等特殊的物理化学性质和生物相容性，目前已被广泛应用于细胞的分离、免疫测定、蛋白质和酶的固定以及DNA检测等。磁性钠米粒子在溶液中较好的扩散型，高的表面积以及特殊的磁分离性质使其作为载体在核酸检测方面具有非常广阔的应用前景。

基因芯片技术在高通量的核酸检测方面也具有独特的优势。从目前已有的报道来看，高通量SNPs检测方法主要集中在综合利用生物芯片技术、多重PCR技术，通过与各种荧光标记的等位基因特异性探针杂交来实现对大量样本的高通量检测。通过荧光探针杂交方法进行SNPs分型的方法，需要对每个SNPs位点设计两条经过标记的探针，而经过标记的探针价格昂贵，大大增加了对大量位点分型时的成本。

发明目的

本发明的目的是为了提供一种利用磁性纳米粒子作为载体，并运用带有通用标签的特异性检测探针和经标记的通用标签探针对基因组中多样本多位点进行高通量SNPs检测方法。该方法利用了磁性纳米粒子特殊的理化性质，克服了现有技术中对待检测靶序列进行纯化、浓缩而导致的成本高、费时、费力等缺陷，同时可以借助核酸自动工作站系统实现自动化操作。应用通用标签技术实现了对于多位点的SNPs检测只需设计一对标记的通用检测探针，大大降低了对大量样本进行分型检测的成本，该方法具有高通量、低成本、快速、高效等优点。

发明内容

本发明的目的通过下述方案实现：

基于磁性纳米粒子与通用标签技术的高通量SNP分型方法，包括下述步骤：

(1)选取多个待检测的功能SNPs位点。

(2)针对步骤(1)中选取的SNPs位点，为每个待检测位点需要设计两条检测探针。检测探针的结构为，一端为与待检测靶序列互补的等位基因特异性互补序列，中间连接若干个连续碱基的间隔序列以减小杂交时的空间位阻，而探针的另一端连接有通用标签序列。等位基因特异型互补序列分为野生型和突变型，野生型互补序列与野生型靶序列完全互补，突变型互补序列与突变型靶序列完全互补，野生型与突变型互补序列有一个碱基的不同。通用标签序列分为野生型和突变型两种，野生型通用标签对应连接野生型等位基因特异型探针，突变型通用标签对应连接突变型等位基因特异型探针。同时设计经过标记的野生型和突变型通用检测探针，野生型通用标签探针与野生型标签互补，突变型通用标签探针与突变型标签序列完全互补。野生型和突变型通用标签序列之间无互补，且均与人类基因组无交叉同源。所有的检测探针和通用标签探针经优化设计去除了四个碱基以上的发夹和回文结构，无交叉同源。

(3)针对步骤(1)中对每个SNPs位点进行扩增，扩增产物的选择有以下几种：①对于每个SNPs位点需要设计一对扩增引物，其中一条引物5’端经过标记。在96或者384孔PCR板中通过PCR扩增出包含有待测SNPs位点的靶序列；②将经过标记的下游引物共价固定在功能化的磁性纳米粒子表面，在96或者384孔PCR板中通过固相PCR直接扩增出包含有待测SNPs位点的靶序列。

(4)针对步骤(3)①中扩增的经过标记的靶序列，加入适量的经过功能化修饰的磁性纳米粒子，通过共价结合，将扩增出的产物固定在磁性纳米粒子上，构成磁性纳米粒子-DNA复合物。

(5)上述步骤(4)磁性纳米粒子-DNA复合物变性、洗涤后与步骤(2)中的通用标签检测探针以及经过标记的通用检测子标签探针杂交，野生纯合型样本只与野生型标签检测探针匹配，然后与标记的野生通用标签探针检测子杂交；突变纯合型样本只与突变型标签检测探针匹配，然后与标记的突变通用检测子标签探针杂交；杂合型样本与两种通用探针均匹配，然后与Cy3、Cy5两种标记的野生型和突变型通用标签探针均能杂交。

(6)将杂交有通用标签探针的磁性纳米粒子经洗涤、变性、磁分离后，通过检测变性下来探针上的标记物来实现对样本的SNPs分型。

所述步骤(6)中SNP检测方法，其中当所述的步骤(2)两条通用标签探针为双色荧光标记物时，对应检测样本基因型的方法为双色荧光检测法，则可实现样本的SNPs分型。

所述步骤(2)通用标签探针的标记物为发光酶时，对应步骤(3)中一个样本的PCR反应在两个单独的反应管中进行，对应步骤(5)中两种检测探针分别加入到两管进行杂交，对应步骤(6)检测样本基因型的方法为化学发光法。

所述步骤(2)标记物为胶体金时，对应步骤(3)中一个样本的PCR反应在两个单独的反应管中进行，对应步骤(5)中两种检测探针分别加入到两管进行杂交，对应步骤(6)检测样本基因型的方法为金标银染法。

所述步骤(3)PCR产物的标记物为生物素时，对应功能化的磁性纳米粒子表面修饰为亲合素。

所述步骤(3)PCR产物的标记物为氨基基团时，对应功能化的磁性纳米粒子表面修饰为醛基基团。

本发明相比现有技术具有如下优点：

1、本发明使用了磁性纳米粒子作为杂交靶序列载体，克服了现有技术中对待检测靶序列进行纯化、浓缩而导致的成本高、费时、费力等缺陷。

2、在对于多个SNPs位点的检测时，只需设计一对经过标记的通用标签探针，大大降低了多位点分型时的成本，且没有增加任何分型步骤。

3、本发明中通过使用磁性纳米粒子作为反应载体，在整个分型步骤都可以在96或384孔板中利用核酸自动化工作站实现自动操作，对于样本的分型信号能够借助芯片法实现检测，因此最终能够实现对大量样本的高通量自动化检测。

附图说明

图1为实施方案的流程图。

图中标号说明如下：

1为功能化(如链霉亲合素、醛基)的磁性纳米粒子，2为标记(如生物素、氨基)的PCR产物(可以为常规扩增的PCR产物，也可以是基于磁性纳米粒子表面固相扩增的PCR产物)，3为标记的野生通用标签探针(发光酶、胶体金或者荧光标记)，4为野生型检测探针，5为标记的突变通用标签探针(发光酶、胶体金或者荧光标记)，6为突变型检测探针。

具体实施方式

实施方案I：

本发明涉及一种利用磁性纳米粒子为载体以及通用标签技术进行高通量SNPs分型的方法。具体如下：1、选取若干重要的功能SNP位点，设计相应的引物(其中一侧引物为生物素标记)、一对野生及突变型检测探针4、6(序列包括与靶序列互补的等位基因特异性序列，中间连接11个碱基的Poly T间隔序列以及与通用标签序列)以及一对带有标记物的(荧光、纳米金、发光酶)通用标签检测探针3、5(通用检测探针长度在13个碱基左右，与检测探针的通用标签序列互补)。2、通过PCR扩增出包含有待测SNPs位点的生物素标记的靶序列，生物素标记的靶序列可以是常规PCR扩增的产物，也可以是在磁性纳米粒子表面固相扩增PCR的产物。3、如果生物素标记的靶序列2为常规扩增产物，则需要将适量的链亲合素标记的磁性纳米粒子1加入PCR产物中孵浴、洗涤后，双链PCR产物固定在磁性纳米粒子表面；如果生物素标记的靶序列2为基于磁性纳米粒子固相扩增的PCR产物则只需要充分洗涤。4、经过95℃变性、骤冷后，磁性粒子表面的双链PCR产物变为单，构成磁性纳米粒子-ssDNA复合体。5、将磁性纳米粒子-ssDNA复合体平均分到两个独立的PCR管中，每管中磁性纳米粒子-DNA复合体分别与野生、突变检测探针以及一对标记的通用标签探针进行杂交。通过控制杂交温度，使野生型样本只与野生型检测探针杂交，然后与标记的野生通用标签探针杂交；突变型样本只与突变检测探针杂交，然后与标记的突变通用标签探针杂交；杂合型样本与两种检测探针均能杂交，然有与两种通用标签检测杂交。洗涤后，将磁性粒子均匀分散到3×SSC缓冲液中。6、变性，磁分离后，磁性纳米粒子被磁富集在反应管底部，溶液的上清液中含有变性下来的检测探针。7、通过荧光检测、银染法或者化学发光法对变性下来的探针进行检测，实现对样品的分型。

实施方案II：

具体如下：1、选取若干重要的功能SNP位点，设计相应的引物(其中一侧引物经过标记)、一对野生及突变型检测探针4、6(序列包括与靶序列互补的等位基因特异性序列，中间连接11个碱基的Poly T间隔序列以及与通用标签序列)以及一对双色荧光标记的(野生型Cy3，突变型Cy5)通用标签检测探针3、5(通用检测探针长度在13个碱基左右，与检测探针的通用标签标签序列互补)。2、通过PCR扩增出包含有待测SNPs位点的经标记的靶序列，标记的靶序列可以是常规PCR扩增的产物，也可以是在磁性纳米粒子表面固相扩增PCR的产物。3、如果标记的靶序列2为常规扩增产物，则需要将适量的功能化的磁性纳米粒子1加入PCR产物中，通过共价结合将PCR产物固定在磁性纳米粒子表面；如果经过标记的靶序列2为基于磁性纳米粒子固相扩增的PCR产物则只需要充分洗涤。4、经过95℃变性、骤冷后，磁性粒子表面的双链PCR产物变为单，构成磁性纳米粒子-ssDNA复合体。5、将反应管中磁性纳米粒子-DNA复合体分别与野生、突变型检测探针以及双色荧光标记的通用标签探针进行杂交。通过控制杂交温度，使野生型样本只与野生型检测探针杂交，然后与标记的野生通用标签探针杂交；突变型样本只与突变检测探针杂交，然后与标记的突变通用标签探针杂交；杂合型样本与两种检测探针均能杂交，然有与两种通用标签检测杂交。洗涤后，将磁性粒子均匀分散到3×SSC缓冲液中。6、变性，磁分离后，磁性纳米粒子被磁富集在反应管底部，溶液的上清液中含有变性下来的检测探针。7、通过检测两种荧光信号强度，实现对样品的分型。

Claims

1.一种基于磁性纳米粒子与通用标签技术的高通量单核苷酸多态性分型方法，包括下述步骤：

(a)选取多个待检测功能SNP位点。对于每一个SNP位点需要设计一对扩增引物(其中一条5’端经过标记)以及两条野生、突变通用标签探针，标记的通用检测子一对(发光酶、胶体金或者荧光标记)。

(b)针对步骤(a)中选取的SNPs位点，为每个待检测位点需要设计两条检测探针。检测探针的结构为，一端为与待检测靶序列互补的等位基因特异性互补序列，中间连接若干个连续碱基的间隔序列以减小杂交时的空间位阻，而探针的另一端连接有通用标签序列。等位基因特异型互补序列分为野生型和突变型，野生型互补序列与野生型靶序列完全互补，突变型互补序列与突变型靶序列完全互补，野生型与突变型互补序列有一个碱基的不同。通用标签序列分为野生型和突变型两种，野生型通用标签对应连接野生型等位基因特异型探针，突变型通用标签对应连接突变型等位基因特异型探针。同时设计经过标记的野生型和突变型通用检测探针，野生型通用标签探针与野生型标签互补，突变型通用标签探针与突变型标签序列完全互补。野生型和突变型通用标签序列之间无互补，且均与人类基因组无交叉同源。

(c)待检测的靶序列可以通过两种方法获得：①利用常规PCR的方法扩增出标记的PCR产物；②将一端标记的引物固定在表面功能化的磁性纳米粒子上，通过固相PCR扩增，直接在磁性纳米粒子表面扩增出包含有待测SNP位点的靶序列，构成磁性纳米粒子-DNA复合物。

(d)磁性纳米粒子-DNA复合物变性后，与检测探针以及标记的通用标签探针杂交。通过控制杂交温度，使野生型样本只与野生型通用标签探针杂交，然后与标记的野生通用标签探针杂交；突变型样本只与突变检测探针杂交，然后与标记的突变通用标签探针杂交；杂合型样本与两检测探针均能杂交，然有与两种通用标签探针杂交。

(e)将杂交有检测探针的磁性纳米粒子经洗涤、变性、磁分离后，通过检测变性下来通用标签探针上的标记物来实现对样本的SNPs分型。

2.根据权利要求1所述的分型方法，对每个SNPs位点的检测，其特征在于设计包含有等位基因特异性序列、间隔序列和通用标签序列的检测探针，以及经过标记的通用标签探针，对多个SNPs位点检测时所需要的检测探针不同，而所用的经过标记的通用标签探针相同。

3.根据权利要求1、2所述的SNP分型方法，其特征在用于SNPs分型检测的野生型和突变型通用标签探针，可以选择不同的标记物，如纳米金、化学发光物、荧光标记物等。当选择荧光标记物时，可以使用同种荧光标记，也可以使用双色荧光标记。

4.根据权利要求1所述的SNPs分型方法，其特征在于所述步骤中靶序列可以是常规PCR扩增的产物也可以是将在一条引物固定在的磁性纳米粒子上，通过PCR直接在磁性纳米粒子表面扩增出来的。

5.根据权利要求1、2、3所述的SNPs分型方法，其特征在于所述步骤(b)中标记引物的方法可以是生物素或者氨基，修饰磁性纳米粒子的标记物相对应是亲合素、醛基，通过生物素-亲合素或氨基-醛基之间的共价结合，将引物固定在磁性纳米粒子上。

6.根据权利要求1、2、3、4、5所述的SNP分型方法，其特征在于所述的磁性纳米粒子-DNA复合物与检测探针以及标记的通用标签探针在液相体系中完成杂交。

7.根据权利要求1、2、3、4、5、6所述的SNP分型方法，其特征在于所述步骤(d)中检变性下来的探针上的标记物的方法，根据标记物的不同对应选择选荧光检测法、化学发光法、银染法中的一种。