CN109022605B - 一种用于药品制剂中控的大肠杆菌检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于药品制剂中控的大肠杆菌检测试剂盒,包括微孔板、与微孔板匹配的微孔板盖、可拆卸地设置在微孔板底部的主电磁吸盘、核酸提取用磁珠、连接有大肠杆菌pyrH正向引物的羧基磁珠和5’端带荧光标记的大肠杆菌pyrH反向引物;微孔板包括多个微孔;微孔的孔壁突出于微孔与相邻微孔之间的第一连接区域以及微孔与微孔板侧壁之间的第二连接区域;微孔板盖上设置有与微孔的内径匹配的环形凸起;微孔板与微孔板盖被设置为可放置入PCR仪中,起到代替PCR管和PCR架的作用。本发明的试剂盒灵敏度和特异性均高,且操作方便,快捷,无需电泳进行检测PCR结果。
Description
技术领域
本发明涉及药品制剂检控领域,尤其涉及一种用于药品制剂中控的大肠杆菌检测试剂盒。
背景技术
药品生产涉及将药材作为原料进行配制加工,而药品往往又可以成为培养微生物的培养基或培养液。药品存在注射剂、片剂、胶囊等多种剂型,涉及较多的生产环节,且生产区域所需范围较大,物料流转路线较长,从而物料被微生物污染的概率较大,有的甚至会污染到致病菌,造成产品的微生物项目检查不符合《中国药典》的规定,轻者造成药品质量不合格,重者威胁到患者的生命。细菌污染处于药品微生物污染的首位,其中大肠杆菌是一种常见的环境微生物。检测和控制药品制剂中的大肠杆菌有无十分重要。
对于大多数制剂,1克或1毫升不得检出大肠杆菌。对检测技术的灵敏度和特异性要求较高。比浊法等传统检测方法难以满足要求。PCR(聚合酶链式反应)可以将微量的DNA进行大幅的提升,但是其结果检测往往需要转板或跑电泳。在批次药品制剂高通量检测过程中,每增加一个环节就会带来许多重复操作,带来极大不便。
多种常见的传统微孔板包括开放式孔按8×12矩形阵列排列的96孔板,微孔数量更多的有16×24矩形阵列排列的384孔板和32×48矩形阵列排列的1536孔板。大量的微孔虽然满足了高通量检测的目的,由于每个微孔的容量非常小,难以实现物质的有效混合和分离。
基因芯片虽然可以快速地、高通量地检测到相关基因,从而判断出是否带有某种微生物,但是往往是先进行PCR,然后再将PCR产物加入基因芯片中来完成测定。而且基因芯片的价格非常昂贵。
发明内容
针对现有技术中存在的问题,本发明提供一种用于药品制剂中控的大肠杆菌检测试剂盒。
其具体方案是:一种用于药品制剂中控的大肠杆菌检测试剂盒,包括微孔板、与微孔板匹配的微孔板盖、可拆卸地设置在微孔板底部的主电磁吸盘、核酸提取用磁珠、连接有大肠杆菌pyrH正向引物的羧基磁珠和5’端带荧光标记的大肠杆菌pyrH反向引物;微孔板包括多个微孔;微孔的孔壁突出于微孔与相邻微孔之间的第一连接区域以及微孔与微孔板侧壁之间的第二连接区域;微孔板盖上设置有与微孔的内径匹配的环形凸起;微孔板与微孔板盖被设置为可放置入PCR仪中,起到代替PCR管和PCR架的作用。
进一步地,核酸提取用磁珠为表面包被二氧化硅的纳米磁珠。
进一步地,大肠杆菌pyrH正向引物由5’端的连接分子和3’端的核心引物组成;连接分子为-NH2-(CH2)n-(T)m-,n=4-8,m=10-18;核心引物的序列如SEQ ID NO.1所示;5’端带荧光标记的大肠杆菌pyrH反向引物的序列如SEQ ID NO.2所示;荧光标记为Cy3或Cy5。
进一步地,还包括编号为CMCC44102的大肠杆菌。用于作为阳性对照。
进一步地,还包括辅助引物、PCR缓冲液、dNTP和Taq DNA聚合酶;辅助引物的序列包含在大肠杆菌pyrH正向引物的序列中。辅助引物可在扩增初期与5’端带荧光标记的大肠杆菌pyrH反向引物先预扩增出一些DNA片段,以便于连接在磁珠上的正向引物更容易与预扩增的DNA片段退火结合,提高磁珠参与的PCR的效率,提高检测的灵敏度。
进一步地,5’端带荧光标记的大肠杆菌pyrH反向引物与辅助引物的物质的量的比例为10~20:1。由于5’端带荧光标记的大肠杆菌pyrH反向引物的量是辅助引物的10到20倍,因此没有与辅助引物搭配进行PCR扩增的5’端带荧光标记的大肠杆菌pyrH反向引物可以与羧基磁珠上的大肠杆菌pyrH正向引物匹配进行PCR扩增,从而将目的基因连接到羧基磁珠上,避免PCR扩增只发生在反向引物与辅助引物之间。
进步一地,还包括裂解液、洗涤液。
连接有大肠杆菌pyrH正向引物的羧基磁珠4℃保存在磁珠保存液中。
其中,磁珠保存液:20nmol/μl的Tris碱,20mmol/μl氯化镁,50mmol/μl氯化钾,0.25%(v/v)吐温-20,0.5%(m/m)的BSA。
裂解液:0.01%N-月桂酰肌氨酸钠、0.2N氢氧化钠、0.3M氯化钾、5mM EDTA、1%曲通X-100、0.3M Tris-HCL、5mM DTT和0.001wt%的溴酚蓝。
洗涤液:0.3M氯化钾、0.001wt%的石绿、用乙酸将pH值调至4。
进一步地,微孔板盖的顶面可拆卸地设置有辅电磁吸盘。
进一步地,还包括盒体和与盒体的内壁贴合的支架;支架上设置有微孔板槽、微孔板盖槽、主电磁吸盘槽、辅电磁吸盘槽和若干试剂管槽。
进一步地,试剂管槽的数量是4个,对应地用于放置装盛连接有大肠杆菌pyrH正向引物的羧基磁珠、阳性对照、裂解液、洗涤液的试剂管。
进一步地,支架上还设置有PCR试剂槽,用于放置PCR试剂(辅助引物、5’端带荧光标记的大肠杆菌pyrH反向引物、PCR缓冲液、dNTP和Taq DNA聚合酶)。
进一步地,微孔包括彼此连通的上混合区和下分选区;下分选区的顶面面积小于下分选区的最大横截面面积。
可选地,微孔板的一对互相平行的侧立面上均设置有槽口,用于机器手握持。
可选地,下分选区的纵剖面呈梯形或扇形。
可选地,下分选区呈顶面小底面大的圆台状。
可选地,微孔的孔壁内侧设置有侧壁凸起,使得下分选区的顶面面积小于下分选区的最大横截面面积。
可选地,微孔的底部内侧设置有底部凸起,使得下分选区的顶面面积小于下分选区的最大横截面面积。
可选地,底部凸起呈T字形、倒L字型或倒梯形。
进一步地,每个微孔中包括多个下分选区。
有益效果是:
引物连接在磁珠上比固定在容器底部更有利于提高PCR效率,因为相对于固定引物,磁珠仅在主电磁吸盘通电时产生的磁场作用下处于容器底部,一旦断开主电磁吸盘的电源,磁场消失,磁珠又可以很容易的离开容器底部,因此,磁珠上的引物可以更好的与其他试剂混合。
由于磁珠的参与,将PCR过程与可靠的流式细胞术结合起来。避免了传统PCR结束后需要耗时的电泳手段进行检测。
也可以在PCR结束后,采用酶标仪等能发出特定发射波长的检测设备进行荧光检测。本发明的试剂盒灵敏度和特异性均高,且操作方便,快捷。
主电磁吸盘和下分选区的顶面面积小于下分选区的最大横截面面积,这两个技术特征的设定使得磁珠在重力和磁场作用下进入下分选区,且不易从下分选区出来,从而有利于磁珠的固定吸附,将结合在磁珠上的物质与未结合上磁珠的物质进行分离,达到将PCR产物与其他物质有效分离的目的。
此外,主电磁吸盘还有利于微孔板中的物质混合。即可以采用能被主电磁吸盘吸住的机器手臂来混匀微孔内的反应物。
辅电磁吸盘和主电磁吸盘可互相吸引,使得微孔板盖盖的更紧。
使用时还可通过变换辅电磁吸盘和主电磁吸盘的电流方向,使得磁珠在微孔底部和微孔顶部之间来回运动,从而达到混匀的目的。下分选区较小的上表面面积有利于延长磁珠在微孔底部和顶部来回运动的时间,使得磁珠在微孔底部、微孔顶部和顶部底部之间的时间更加均衡,从而有利于混匀,提高了分选得率和检测灵敏度。
本发明的微孔构造有利于分离比重不同的物质,尤其是溶液中沉淀的分离,为改良生物医学检验领域的技术方法提供了新的基础。
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明,以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
图1是微孔板阵列模式图;
图2是实施例1的荧光检测结果示意图;
图3是本发明所涉及的微孔板、微孔板盖、主电磁吸盘、辅电磁吸盘的结构示意图;
图4是图3中的A-A剖视图用于展示一个具体实施例的微孔结构;
图5是图3中的A-A剖视图用于展示另一个具体实施例的微孔结构;
图6是本发明所涉及的微孔板盖的侧面结构示意图。
具体实施方式
下面具体实施例结合附图对本发明做进一步阐述本发明,但应理解为这些实施例仅限于说明本发明而不限制本发明的范围。大肠杆菌(Escherichia coli)是革兰氏阴性厌氧细菌。本实施方式以大肠杆菌的基因组中的尿苷单磷酸激酶基因(pyrH)作为扩增对象区域进行PCR扩增。检测其PCR产物,由此能够检测试样中的大肠杆菌的有无。根据pyrH基因序列(NCBI中的编号为Gene ID:944989)设计引物。
本发明所使用的大肠杆菌的编号是CMCC44102,购买自国家标准品网站(http:// www.gbw.org.cn/)。委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成引物。实施例1中所用到的试剂均可商业购买获得,比如Taq DNA聚合酶和dNTP购自天根生化有限公司。核酸提取用磁珠为市售的表面包被二氧化硅的纳米磁珠。羧基磁珠也为市售的羧基磁珠。在实施例1中,这两种磁珠均购自中科雷鸣(北京)科技有限公司。
主要仪器:Bio-Rad_Mycycler PCR仪、Bio-Rad iMark酶标仪。
实施例1
挑取LB固体培养基平板培养活化得到的大肠杆菌CMCC44102菌株的一个克隆菌落接种到LB液体培养基中,37℃,150rpm摇床培养过夜,用LB液体培养液梯度稀释,得到稀释100倍、500倍1000倍的阳性对照发酵液。分别对稀释100倍、500倍、1000倍的阳性对照发酵液涂板检测菌落数(取100μl涂布LB固体培养基平板,37℃培养12h后数平板上的菌落数)。每个稀释梯度涂板5块,其结果如表1所示:
表1阳性对照发酵液的浓度
*因为有不少菌落在平板上连成一片,故无法计数。
#由于菌落较多,有少部分菌落连在一起,故稀释100倍的计算有可能不准确。
取1g或1ml待检测的药品制剂到LB液体培养基中,37℃,150rpm摇床培养过夜,得到样品发酵液。
配置连接液:0.1M 2-吗啉乙磺酸,0.25%(v/v)吐温-20,10mM碳二亚胺盐酸盐,用盐酸和/或氢氧化钠调pH值至5。
配置纯化缓冲液:10mM pH7.4的PBS,0.25%(v/v)吐温-20。
配置磁珠保存液:20nmol/μl的Tris碱,20mmol/μl氯化镁,50mmol/μl氯化钾,0.25%(v/v)吐温-20,0.5%(m/m)的BSA。
配制裂解液:0.01%N-月桂酰肌氨酸钠、0.2N氢氧化钠、0.3M氯化钾、5mMEDTA、1%曲通X-100、0.3M Tris-HCL、5mM DTT和0.001wt%的溴酚蓝。
配制洗涤液:0.3M氯化钾、0.001wt%的石绿、用乙酸将pH值调至4。
(1)制备连接有大肠杆菌pyrH正向引物的羧基磁珠,以100μl的磁珠悬液为例:取1mg粒径200nm的表面修饰有羧基的磁珠,用200μl、0.01M的氢氧化钠溶液以及去离子水分别清洗磁珠;然后向磁珠中加入1nmol大肠杆菌pyrH正向引物和100μl的连接液,室温孵育5h,用混匀器轻微摇动;然后用磁分离器将连接有大肠杆菌pyrH正向引物的羧基磁珠分离出来,用纯化缓冲液清洗2次;最后将清洗后的连接有大肠杆菌pyrH正向引物的羧基磁珠4℃保存在100μl的磁珠保存液中备用。
(2)吸取裂解液到本发明提供的微孔板中,每个微孔加入100μl裂解液。按照磁珠与裂解液的1~2:100的比例(m/v)将核酸提取用磁珠加入到微孔中。
(3)取100μl发酵液加入到混合有磁珠、裂解液的微孔中,用吸头吹打混匀,室温静置10min。在本实施例中,微孔板为96孔板,其中5个孔(4个角和中间各1个,即图1中的孔A1、B12、G11、H2和E7)加入的发酵液是稀释100倍的阳性对照发酵液;又5个孔(4个角和中间各1个,即图1中的孔A2、B11、G12、H1和D7)加入的发酵液是稀释500倍的阳性对照发酵液;再5个孔(4个角和中间各1个,即图1中的孔B2、A11、H12、G1和D6)加入的发酵液是稀释1000倍的阳性对照发酵液;另设有5个孔(4个角和中间各1个,即图1中的孔B1、A12、H11、G2和E6)作为阴性对照,即采用灭菌双蒸水充当发酵液;其余微孔中的发酵液均为样品发酵液。
(4)将主电磁吸盘安装到上述微孔板底部,接通主电磁吸盘的电源,使得微孔板在磁场下静置2min后关掉主电磁吸盘的电源,用移液器将液体吸掉,注意勿吸掉磁珠。
(5)取200μl洗涤液加入到步骤(4)处理后的微孔中,然后用移液器吸弃洗涤液,需吸净残液。
(6)将2.0μl(1U/μl)Taq DNA聚合酶、10μg连接有大肠杆菌pyrH正向引物的羧基磁珠、4μl(1000nmol/μl)5’端带荧光标记的大肠杆菌pyrH反向引物、4μl(100nmol/μl)辅助引物,以及10μl PCR缓冲液(80nmol/μl的Tris碱,80mmol/μl氯化镁和200mmol/μl氯化钾)和20μl(400μmol/μl)dNTP混匀,加入到步骤(5)得到的微孔中,盖上微孔板盖,将辅电磁吸盘装到微孔板盖的上表面,主电磁吸盘的电源与辅电磁吸盘的电源交替开关,使得磁珠与PCR反应液彻底混匀。在本实施例中,荧光标记为Cy5,但不限于Cy5。引物序列如表2所示。大肠杆菌pyrH正向引物中的-NH2-基团有利于与羧基磁珠上的羧基相连从而与磁珠连接;-(CH2)6-和-TTTTTTTTTTTTTT-基团有利于增长长度,以减小大肠杆菌pyrH正向引物在磁珠上的位阻,其中-(CH2)-不限于6个,多聚T不限于14个。比如-(CH2)-可以为4-8个,多聚T可以为10-18个。
(7)取下主电磁吸盘和辅电磁吸盘,将上述得到的盖有微孔板盖的微孔板放置于PCR仪内进行扩增。扩增程序:95℃2min;进行40个循环的95℃10秒,61℃45秒,72℃30秒;72℃2min。PCR产物,4℃保存备用。
(8)检测荧光信号:将主电磁吸盘安装到PCR反应后的微孔板底部,接通主电磁吸盘的电源,静置2分钟,使得磁珠在磁场和重力作用下贴附在微孔底部,用移液器吸除微孔中的PCR反应液,对微孔板中的磁珠进行荧光信号检测,可以放入酶标仪进行检测,也可使用流式细胞仪进行检测。Cy5的激发光谱为640-660nm,荧光光谱为660-680nm。
表2引物序列
注*:由于序列表中无法显示-NH2-(CH2)6-,故序列表中的SEQ ID NO.3省略了-NH2-(CH2)6-。
放入酶标仪的检测结果示意图如图2所示,在扣除背景荧光信号之后,阳性对照除稀释1000倍的阳性对照发酵液中有一个重复(孔G1,其菌株浓度为2cfu/100μl)没有检测到荧光信号外,其余阳性对照均能检测到荧光信号;阴性对照均没有检测到荧光;有一个样品(孔C4)检测到荧光信号。以上结果说明,本试剂盒能够检测到的菌株浓度为12cfu/100μl,对于10cfu/100μl以下2cfu/100μl以上的检出率为80%,特异性和灵敏度均较高。利用磁珠将核酸提取、PCR扩增和荧光显色集合到了一起来进行处理,简化了实验步骤。
在本实施方式中,用于药品制剂中控的大肠杆菌检测试剂盒,包括微孔板、与微孔板匹配的微孔板盖、可拆卸地设置在微孔板底部的主电磁吸盘、可拆卸地设置在微孔板盖顶面的辅电磁吸盘、盒体、与盒体的内壁贴合的支架和试剂。本试剂盒中的试剂有:连接有大肠杆菌pyrH正向引物(序列见表2)的磁珠、5’端带荧光标记的大肠杆菌pyrH反向引物(序列如SEQ ID NO.2所示,荧光标记为Cy3或Cy5)、编号为CMCC44102的大肠杆菌(作为阳性对照)、辅助引物(序列如SEQ ID NO.1所示)、PCR缓冲液、dNTP、Taq DNA聚合酶、连接液、纯化缓冲液、磁珠保存液、裂解液和洗涤液。5’端带荧光标记的大肠杆菌pyrH反向引物与辅助引物的物质的量的比例为10~20:1。
微孔板、微孔板盖、主电磁吸盘和辅电磁吸盘构成微孔板套件(如图3所示)。微孔板包括多个微孔。
支架上设置有微孔板槽、微孔板盖槽、主电磁吸盘槽、辅电磁吸盘槽、PCR试剂槽和若干试剂管槽。试剂管槽的数量是4个,对应地用于放置装盛连接有大肠杆菌pyrH正向引物的羧基磁珠、阳性对照、裂解液、洗涤液的试剂管。PCR试剂槽用于放置PCR试剂(辅助引物、5’端带荧光标记的大肠杆菌pyrH反向引物、PCR缓冲液、dNTP和Taq DNA聚合酶)。连接有大肠杆菌pyrH正向引物的羧基磁珠4℃保存在磁珠保存液中。
如图4和3所示,微孔11的孔壁14突出于与相邻微孔11之间的第一连接区域13,也突出于与微孔板侧壁16之间的第二连接区域15。微孔板侧壁16突出于第二连接区域15。微孔板盖2上设置有与微孔11的内径匹配的环形凸起21(如图6所示)。微孔板1与微孔板盖2被设置为可放置入PCR仪中,起到代替PCR管和PCR架的作用。
本发明另外做的些小改进可以是:在一些实施例中,微孔板1的一对互相平行的侧立面上均设置有槽口12,用于机器手握持。
在一些实施例中,微孔板1包括多个微孔11。微孔11包括彼此连通的上混合区和下分选区。如图4和图5所示,微孔11中,虚线以上为上混合区,虚线以下为下分选区。下分选区的顶面面积小于下分选区的最大横截面面积。
在一些实施例中,下分选区的纵剖面呈梯形(如图4所示)或扇形。
在一些实施例中,如图4所示,微孔11的孔壁14内侧(即内侧壁141)设置有侧壁凸起17使得下分选区的顶面面积小于下分选区的最大横截面面积。
在一些实施例中,如图5所示,微孔11的底部内侧设置有底部凸起18使得下分选区的顶面面积小于下分选区的最大横截面面积,且底部凸起18呈T字形。
在图5所示的实施例中,每个微孔11中包括2个下分选区,1个上混合区。下分选区的数目不限于2个,可以是1个或3个及以上。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解,本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此,凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案,皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
序列表
<110> 宁波金未生物科技有限公司
<120> 一种用于药品制剂中控的大肠杆菌检测试剂盒
<130> 01002-18003PIX
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
cgctcgtctg atgtccgcta ttccattgaa t 31
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
accacgcagg caagctgctg agtcgg 26
<210> 3
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
tttttttttt ttttcgctcg tctgatgtcc gctattccat tgaat 45
Claims (6)
1.一种用于药品制剂中控的大肠杆菌检测试剂盒,其特征在于,包括微孔板、与所述微孔板匹配的微孔板盖、可拆卸地设置在所述微孔板底部的主电磁吸盘、核酸提取用磁珠、连接有大肠杆菌pyrH正向引物的羧基磁珠、5’端带荧光标记的大肠杆菌pyrH反向引物、辅助引物、PCR缓冲液、dNTP和Taq DNA聚合酶;所述微孔板包括多个微孔;所述微孔的孔壁突出于所述微孔与相邻所述微孔之间的第一连接区域以及所述微孔与所述微孔板侧壁之间的第二连接区域;所述微孔板盖上设置有与所述微孔的内径匹配的环形凸起;所述微孔板与所述微孔板盖被设置为可放置入PCR仪中,起到代替PCR管和PCR架的作用;
所述微孔包括彼此连通的上混合区和下分选区;所述微孔的底部内侧设置有底部凸起,使得所述下分选区的顶面面积小于所述下分选区的最大横截面面积;所述大肠杆菌pyrH正向引物由5’端的连接分子和3’端的核心引物组成;所述连接分子为-NH2-(CH2)n-(T)m-,n=4-8,m=10-18;所述核心引物的序列如SEQ ID NO.1所示;所述带荧光标记的大肠杆菌pyrH反向引物的序列如SEQ ID NO.2所示;所述荧光标记为Cy3或Cy5;所述辅助引物的序列包含在所述大肠杆菌pyrH正向引物的序列中;所述5’端带荧光标记的大肠杆菌pyrH反向引物与所述辅助引物的物质的量的比例为10~20:1;所述微孔板盖的顶面可拆卸地设置有辅电磁吸盘。
2.如权利要求1所述的用于药品制剂中控的大肠杆菌检测试剂盒,其特征在于,还包括编号为CMCC44102的大肠杆菌菌液。
3.如权利要求1所述的用于药品制剂中控的大肠杆菌检测试剂盒,其特征在于,还包括连接液、纯化缓冲液、磁珠保存液、裂解液、洗涤液。
4.如权利要求3所述的用于药品制剂中控的大肠杆菌检测试剂盒,其特征在于,还包括盒体和与所述盒体的内壁贴合的支架;所述支架上设置有微孔板槽、微孔板盖槽、主电磁吸盘槽、辅电磁吸盘槽和若干试剂管槽。
5.如权利要求4所述的用于药品制剂中控的大肠杆菌检测试剂盒,其特征在于,所述试剂管槽的数量是4个。
6.如权利要求4所述的用于药品制剂中控的大肠杆菌检测试剂盒,其特征在于,所述支架上还设置有PCR试剂槽。
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