CN102827948A

CN102827948A - 基于磁性引物扩增的流式细胞术检测食源性病毒的方法及试剂盒

Info

Publication number: CN102827948A
Application number: CN2012102742100A
Authority: CN
Inventors: 周小明; 詹芳芳; 邢达
Original assignee: South China Normal University
Current assignee: South China Normal University
Priority date: 2012-08-02
Filing date: 2012-08-02
Publication date: 2012-12-19

Abstract

本发明公开了一种基于磁性引物扩增的流式细胞术检测食源性病毒的方法及检测轮状病毒的试剂盒。首先根据食源性病毒的保守性序设计助引物、荧光染料标记引物和磁性引物，通过PCR反应得到带有荧光染料的PCR产物的磁珠，然后用流式细胞仪检测带有荧光染料的PCR产物的磁珠的荧光信号即可确定样品中食源性病毒的种类。当检测体系里存在目标DNA或cDNA时，随着PCR过程的进行，磁珠上便直接带有荧光染料的PCR产物；当没有目标DNA或cDNA存在时，磁性引物不会发生扩增，因而不会出现带有荧光染料的磁珠，之后再通过磁分离和流式细胞术完成检测。该方法灵敏度高、特异性好、操作简便、检测时间短，具有很强的推广性和实用性。

Description

基于磁性引物扩增的流式细胞术检测食源性病毒的方法及试剂盒

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，特别涉及一种基于磁性引物扩增的流式细胞术检测食源性病毒的方法及试剂盒。

背景技术

食品安全是国家和人民密切关注的话题，食品安全问题会导致全球范围内的食源性疾病。食源性病毒是食源性疾病的重要病原，是引起食品安全事件的主要致病因子之一。食源性病毒主要有甲型病毒、禽流感病毒、轮状病毒、诺瓦克病毒、腺病毒等。调查发现，至少40%的生物性食物中毒病例是食源性病毒引起的。各国由食源性病毒引起的疫情屡见不鲜。自2011年11月以来，日本厚生劳动所确认由诺瓦克病毒引致的食物中毒事件共有213件、病人9650人，中毒人数已经大大超过历史上最为严重的2004年。2012年2月，马来西亚爆发轮状病毒疫情，造成2名儿童死亡，三千多人染病。近年来，由H5N1亚型禽流感病毒引起的疫情广泛传播对人类的健康造成全球性的重大威胁，中国以及其他国家都不断爆发禽流感疫情。食源性病毒一直难以得到及时有效的监控，不仅对食品卫生和人民健康构成严重威胁，也对食品工业和国民经济造成很大的影响。因此，发展一种快速，灵敏，特异，安全的检测食源性病毒的方法对食品安全体系的完善、预防人类食源性病毒病的发生具有重要意义。

传统的食源性病毒的检测方法主要有细胞培养、电子显微镜观察法、免疫学检测方法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法。细胞培养法的操作烦琐，需时较长，一般需要一周才能观察到细胞病理反应，另外许多肠道食源性病毒不能进行细胞培养，而其他方法具有灵敏度低、特异性不高、耗时长、需要昂贵仪器等缺点。

流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种对液流中排成单列的细胞或其它生物微粒（如微球，细菌，小型模式生物等）逐个进行快速定量分析和分选的技术，具有速度快、精度高、准确性好等特点。流式细胞仪被广泛的运用于从基础研究到临床实践的各个方面，涵盖了细胞生物学、免疫学、血液学、肿瘤学、药理学、遗传学及临床检验等领域，在各学科中发挥着重要的作用。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种基于磁性引物扩增与流式细胞术结合的快速、高灵敏度、准确、操作简便的检测食源性病毒的方法。

本发明的另一目的在于提供一种使用上述方法实现检测轮状病毒的试剂盒。

本发明的目的通过下述技术方案实现，基于磁性引物扩增的流式细胞术检测食源性病毒的方法，具体包括以下步骤：

（1）模板的准备：提取食源性病毒的DNA或RNA；对于RNA，需逆转录得到cDNA；

（2）设计合成用于扩增食源性病毒保守序列的引物：①磁珠连接引物：5’-3’方向依次为用于与磁珠反应的功能基团、用于隔开磁珠和核心序列的联结链（linker）和核心序列，核心序列根据模板序列设计得到；②助引物：为磁珠连接引物中的核心序列；③荧光标记引物：根据模板序列设计得到、且能与助引物进行PCR扩增得到食源性病毒保守序列的引物，其5’端标记有荧光染料；

（3）制备磁性引物：将步骤（2）中的磁珠连接引物与功能化磁珠反应得到磁性引物；

（4）PCR反应：将步骤（1）制备的模板，步骤（2）设计合成的荧光标记引物、助引物和步骤（3）制备的磁性引物进行PCR扩增反应，得到PCR产物；

（5）分离纯化：将步骤（4）所得的PCR产物进行分离纯化，得到带有荧光染料的PCR产物的磁珠；

（6）检测：对步骤（5）所得的带有荧光染料的PCR产物的磁珠用流式细胞仪检测荧光信号，荧光信号值高于阈值（阈值为3组以上阴性对照样品的平均光信号值加上其3倍标准偏差）即表明样品中含有食源性病毒，根据引物的种类即可判断样品中食源性病毒的种类。

由于本方法不需要再孵育等步骤，另外流式细胞仪本身具有操作简便快速的特点，因此可以实现样品的快速检测。

步骤（1）中所述的食源性病毒包括轮状病毒（rotavirus，双链RNA病毒）、诺瓦克病毒（norovirus，单链RNA病毒）、腺病毒（adenovirus，双链DNA病毒）、禽流感病毒（avian influenza virus，单链RNA病毒）、星状病毒（astroviridae，单链RNA病毒）、甲肝病毒（hapatitis A virus，单链RNA病毒）和脊髓灰质炎病毒（poliovirus，单链RNA病毒）等病毒；

步骤（2）中所述的食源性病毒保守序列优选为食源性病毒特异基因（特异基因是指只有该食源性病毒才具有的基因）的保守序列，如轮状病毒（rotavirus）编码强抗原性蛋白质的VP6基因、禽流感病毒（avian influenza virus）的核蛋白NP基因；

步骤（2）中所述的用于与磁珠反应的功能基团优选为氨基、羧基、磷酸基、生物素、链霉亲和素、羟基或巯基；

步骤（2）中所述的联结链为不影响PCR反应特异性的随机DNA序列；

步骤（2）中所述的荧光染料优选为FAM、FITC、Cy5或Alexa Fluor 488；

步骤（3）中所述的功能化磁珠的粒径为20nm～10μm；

步骤（3）中所述的功能化磁珠为表面修饰有功能基团的磁珠，所述的功能基团优选为氨基、羧基或巯基，能与磁珠连接引物的功能基团进行反应；

步骤（3）中所述的磁性引物优选为通过如下方法制备得到：将磁珠连接引物与处理后的功能化磁珠在连接反应液中孵育，纯化，得到磁性引物；其中磁珠连接引物与磁珠按2～20nmol/mg配比；

所述的处理的方式优选为先用0.01M氢氧化钠溶液清洗功能化磁珠，再用去离子水冲洗；

所述的连接反应液为：0.1M的2-吗啉乙磺酸（MES），体积百分比0.25%的吐温-20，10mM的碳二亚胺盐酸盐（EDC），pH值为5.0；

所述的孵育的条件优选为室温条件反应3～5小时；

所述的纯化优选通过磁分离器分离磁性引物，如DYNAL牌的MPC-S，并用纯化缓冲液清洗；所述的纯化缓冲液为：10mM、pH 7.4的PBS中加入吐温-20，吐温-20的终浓度为体积百分比0.25%；

步骤（4）中所述的PCR反应的体系包含：模板、Taq酶、Taq酶缓冲液、dNTP、磁性引物、助引物、荧光标记引物、TritonX-100、Tween-20和牛血清白蛋白（BSA）；所述的磁性引物的终浓度为0.1～0.3μg/μL；所述的助引物的终浓度为20～60nM，所述的荧光标记引物的终浓度为300～500nM，助引物与荧光标记引物按摩尔比1:5～1:25配比；所述的TritonX-100、Tween-20和牛血清白蛋白的终浓度分别为体积百分比0.1%、体积百分比0.5%和质量百分比0.05%；

步骤（5）中所述的分离纯化优选通过磁分离器进行分离，并用纯化缓冲液清洗；所述的纯化缓冲液为：10mM、pH 7.4的PBS中加入吐温-20，吐温-20的终浓度为体积百分比0.25%；

步骤（6）中所述的检测的方法为：将步骤（5）得到的磁珠用检测缓冲液冲洗，然后用检测缓冲液重悬磁珠，再转入流式细胞仪进行检测；所述的检测缓冲液为：1倍Taq酶缓冲液中加入吐温-20，吐温-20的终浓度为体积百分比0.25%；

使用上述方法检测轮状病毒，包括以下步骤：

（1）模板的准备：提取轮状病毒的RNA，进行逆转录反应得到cDNA；

（2）设计合成用于扩增轮状病毒VP6基因片段的引物：

磁珠连接引物：5’-NH₂-(CH₂)₆-TTTTTTTTTTTTGGCCTATAGCTCAGCTGGTTAGA-3’；

荧光标记引物：5’-FAM-GGTAAATTACCAATTCCTCCAG-3’；

助引物：5’-GGCCTATAGCTCAGCTGGTTAGA-3’；

（3）制备磁性引物：功能化磁珠为表面修饰有羧基的磁珠；将功能化磁珠先后用0.01M氢氧化钠溶液和去离子水清洗，再与磁珠连接引物混合，在连接反应液中孵育，纯化后得到；其中，功能化磁珠、磁珠连接引物和连接反应液的用量按1mg：2nmol：100μL配比；

（6）检测：对步骤（5）所得的带有荧光染料的PCR产物的磁珠用流式细胞仪检测荧光信号，荧光信号值高于阈值即表明样品中含有轮状病毒；

步骤（1）中所述的逆转录反应中所使用的逆转录引物为随机引物、Oligod（T）或根据模板设计得到的特异引物；

所述的逆转录引物优选为：5’-GGCCTATAGCTCAGCTGGTTAGA-3’或5’-GGTAAATTACCAATTCCTCCAG-3’；

步骤（3）中所述的磁珠的粒径优选为180nm；

步骤（3）中所述的孵育的条件优选为室温孵育5小时；

步骤（4）所述的PCR反应的条件优选为每100μL反应体系的组成如下：cDNA2×10⁸copies/μL、磁性引物10μg、荧光染料引物350nM、助引物40nM、Taq酶5U、Taq酶缓冲液、TritonX-100体积百分比0.1%、Tween-20体积百分比0.5%、BSA质量百分比0.05%、dNTP 0.1mM（每种脱氧核糖核苷三磷酸的浓度为0.1mM）；扩增条件优选为：94℃2分钟；94℃10秒，54℃30秒，72℃30秒，35个循环；72℃后延伸2分钟。

实现使用上述方法检测轮状病毒的试剂盒，主要包括引物、酶、缓冲液、RNA酶抑制剂、dNTP、TritonX-100、Tween-20和牛血清白蛋白，其中：

所述引物为：

荧光标记引物：5’-FAM-GGTAAATTACCAATTCCTCCAG-3’；

助引物：5’-GGCCTATAGCTCAGCTGGTTAGA-3’，（也作为逆转录引物）；

磁性引物：5’-磁珠-CONH-(CH₂)₆-TTTTTTTTTTTTGGCCTATAGCTCAGCTGGTTAGA-3’，所述的磁珠的粒径优选为180nm；

逆转录引物：5’-GGTAAATTACCAATTCCTCCAG-3’；

所述的酶包括逆转录酶M-MLV和Taq酶；

所述的缓冲液包括：M-MLV缓冲液、Taq酶缓冲液、纯化缓冲液和检测缓冲液，其中：

纯化缓冲液：10mM、pH 7.4的PBS中加入吐温-20，吐温-20的终浓度为体积百分比0.25%；

检测缓冲液：1倍Taq酶缓冲液中加入吐温-20，吐温-20的终浓度为体积百分比0.25%。

本发明中设计PCR引物序列应注意下列问题：（1）考虑到在磁珠上扩增，磁性引物与较大基因组片段退火结合会有一定的位阻效应，从而降低扩增效率，在磁珠连接引物的5’端设计联结链序列，降低磁性引物空间位阻效应；（2）引入普通PCR助引物，可以在扩增的最初阶段，与荧光标记引物在液相环境中首先预扩增出一定量的较小的DNA片段（一般小于200bp），磁性引物可以更容易与预扩增的小DNA片段退火结合，从而提高磁性引物的扩增效率，增强了检测灵敏度；（3）为了防止过多的扩增反应发生在液相环境的荧光标记引物和助引物之间，而没有使磁性引物发生扩增，助引物与荧光标记引物的物质的量比为1:5～1:25。

本发明的基本原理（如图1所示）：针对大多数食源性病毒都包含有自己特征基因序列，设计两条特异性的PCR功能引物（磁性引物和荧光标记引物），在一定条件下扩增这些特征片段，使用流式细胞术检测的手段即可达到灵敏、快速、特异的检测样品中食源性病毒的目的。当检测体系存在目的基因片段时，借助磁性引物的扩增，生成的带有荧光染料分子标记的产物会直接被富集在磁珠的表面；而不含目的片段时，磁性引物不会发生扩增，磁珠的表面并不会带有荧光染料信号分子。而后借助流式细胞仪进行检测，通过判断磁珠的平均荧光强度来检测目的基因的有无达到检测食源性病毒的目的。

本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：

（1）由于本发明所使用的聚合酶链式反应和流式细胞术的效率都很高，所以检测的灵敏度很高。

（2）利用磁性引物的扩增，有机的将原位PCR的过程与可靠的流式细胞术结合起来。

（3）简便快速。本发明避免了传统PCR过程完成后所需的耗时的电泳检测等手段，将扩增与之后的富集过程同时在磁珠完成，2个小时之内便能完成检测。

（4）本发明没有溴化已锭、同位素等有害物质的使用，没有安全隐患，使用安全。

附图说明

图1是基于磁性引物扩增的流式细胞术检测食源性病毒的原理图。

图2是扩增轮状病毒保守序列的琼脂糖凝胶电泳图。

图3是验证磁珠上PCR反应可行性的流式荧光峰图。

图4是验证磁珠上PCR反应可行性的流式荧光柱状图。

图5是本发明轮状病毒检测的流式荧光峰图。

图6是本发明对轮状病毒检测的流式荧光柱状图。

图7是本发明对轮状病毒检测的灵敏度的流式荧光峰图。

图8是本发明对轮状病毒检测的灵敏度的流式荧光柱状图。

图9是本发明针对轮状病毒检测的特异性的流式荧光峰图。

图10是本发明针对轮状病毒检测的特异性的流式荧光柱状图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

将本发明的方法应用于水样中轮状病毒的检测。如图1所示为基于磁原位扩增的流式细胞术检测食源性病毒的原理图。

实施例中所用到的引物如表1所示：

表1 引物列表

实施例1检测方法的建立

（1）水样品中轮状病毒RNA的提取：取1mL轮状病毒水样，用47mm，0.45μm的正电荷滤膜对水样进行过滤，吸附病毒；用pH 9、3wt%的牛肉提取物-0.05mol/L甘氨酸洗滤膜，将滤器上的病毒洗下来；再用1mol/L HCl溶液将病毒液的pH值调到7.0～7.4，涡旋振荡15min；然后在4℃下，7000r/min离心30min后，弃上清得到病毒沉淀；加入500μLTrizol试剂至病毒沉淀，按常规的Trizol方法提取RNA。

（2）引物设计：根据轮状病毒编码强抗原性蛋白质的VP6基因设计可以扩增出186bp的DNA片段（如图2所示，M为DL 2000，C为对照组，1～3分别为50℃、52℃、54℃退火温度下的扩增条带）的引物，引物如表1所示。

（2）逆转录：

①于PCR管中配制下列RNA/引物混合液：模板RNA 2μL、助引物和逆转录引物（10μM）各1μL和灭菌超纯水2μL，总体积6μL；

②70℃孵育10分钟后迅速置于冰上2分钟以上；

③短暂离心收集PCR管壁水珠；

④在上述PCR管中加入以下逆转录反应液：5×M-MLV缓冲液2μL、dNTP（每种10mM）0.5μL、RNA酶抑制剂（40U/μL）0.25μL、M-MLV逆转录酶（200U/μL）0.45μL、灭菌超纯水0.8μL；

⑤42℃孵育40分钟；

⑥70℃孵育15分钟后置于冰上冷却，得到的cDNA溶液可直接用于PCR扩增。

（3）制备磁性引物：取1mg粒径180nm的表面修饰有羧基的磁珠，用200μL、0.01M的氢氧化钠溶液以及去离子水在室温条件分别清洗磁珠一次；往洗涤干净后的磁珠中加入2nmol磁珠连接引物和100μLpH 5.0的连接反应液（0.1M 2-吗啉乙磺酸，0.25%（v/v）吐温-20，10mM碳二亚胺盐酸盐）在室温中共孵育5小时，混匀器轻微摇动；反应完成后，使用磁分离器将制备的磁性引物分离出来，并使用纯化缓冲液（10mM，pH 7.4的PBS，体积百分比0.25% 吐温-20）清洗两次；最后将合成的磁性引物置于4℃的100μL保存缓冲液中（宝生物公司1倍PCR标准缓冲液，另加入吐温和BSA，吐温的终浓度为体积百分比0.25%的，BSA的终浓度为质量百分比0.5%），备用。

（4）PCR反应：将步骤（2）逆转录所得的cDNA、助引物、磁性引物、荧光染料引物、PCR反应缓冲液及其他常规PCR反应物加入反应器，进行聚合酶链式反应。反应具体参数为：在100μL PCR反应体系里包含有cDNA 2×10⁸copies/μL^-1、磁性引物10μg、荧光染料引物350nM、助引物40nM，宝生物工程（大连）有限公司Taq酶（5U）及Taq酶缓冲液、TritonX-100体积百分比0.1%、Tween-20体积百分比0.5%、BSA质量百分比0.05%、dNTP 0.1mM（每种脱氧核糖核苷三磷酸0.1mM），扩增条件为：94℃2分钟；94℃10秒，54℃30秒，72℃30秒，35个循环；72℃后延伸2分钟，得到带有荧光染料的PCR产物的磁珠。

（5）分离纯化：用磁分离器将扩增后的磁珠分离出来，使用纯化缓冲液（10mM，pH 7.4的PBS加入体积百分比0.25%吐温-20）冲洗2次。

（6）磁珠与杂交探针杂交：具体反应参数为：PBS缓冲液（100mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na₂HPO₄、2mM KH₂PO₄，pH7.4）中加入步骤（5）分离纯化后的磁珠、500nM杂交探针和体积百分比0.5%的吐温-20的体系在93℃变性4分钟然后在50℃孵育30分钟；将杂交产物重复分离纯化步骤，再用检测缓冲液冲洗和重悬，再转入流式细胞仪进行检测；检测结果见图3（左：对照组、右：实验组）和图4，由图3可知实验组82.4%的磁珠荧光强度明显增强，远远大于对照组（检测过程中用水代替cDNA）的8.5%；由图4可知，实验组的平均荧光强度远大于阀值，表明标记有FAM的杂交探针与磁珠上的PCR产物杂交了，验证了本发明成功克服了位阻效应在磁珠上能够顺利进行PCR反应。

（7）将步骤（5）得到的磁珠用检测缓冲液冲洗（宝生物工程有限公司1倍Taq酶缓冲液，另加入体积百分比0.25%的吐温-20）2遍，最后用该缓冲液400μL重悬磁珠，再转入流式细胞仪进行检测。

检测结果见图5（A：对照组、B：实验组）和图6，由图5可知，实验组轮状病毒水样中提取的RNA所得的检测结果中，67.9%磁珠的荧光强度明显增强，该比例远大于对照组（检测过程中用水代替cDNA）的7.7%；由图6可知，实验组的平均荧光强度420a.u远大于阀值134a.u，由此可判断本发明的方法检测轮状病毒具有非常好的准确性。

实施例2轮状病毒检测灵敏度实验

分别取2×10⁸copies/μL、2×10⁷copies/μL、2×10⁶copies/μL、2×10⁵copies/μL、2×10⁴copies/μL轮状病毒（rotavirus）cDNA，按照实施例1所建立的方法所得的流式检测峰图和柱状图分别为图7和图8，可知当轮状病毒目的基因组片段浓度等于2×10⁴copies/μL时，磁珠的平均荧光强度依然大于阈值112a.u（3组阴性样品的发光平均值为76a.u，样品间3倍标准偏差为36a.u），因此可以判断本发明检测轮状病毒具有非常好的灵敏度。

实施例3轮状病毒检测特异性的荧光验证实验

按照实施例1所建立的方法检测分别含腺病毒、甲型肝炎病毒和轮状病毒的水样品，检测结果如图9（A：对照组、B：腺病毒样品、C：甲型肝炎病毒样品2、D：轮状病毒样品）和图10所示，由图9可知，轮状病毒水样中提取的RNA所得的检测结果中，86.7%磁珠的荧光强度明显增强，该比例远大于对照组（6.5%）以及其他两种样品（7.9%和8.0%）；由图10可知，轮状病毒样品的平均荧光强度远大于阀值，其他样品低于阀值，由此可判断本发明的方法检测轮状病毒具有非常好的特异性。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种基于磁性引物扩增的流式细胞术检测食源性病毒的方法，其特征在于包括以下步骤：

（2）设计合成用于扩增食源性病毒保守序列的引物：①磁珠连接引物：5’-3’方向依次为用于与磁珠反应的功能基团、用于隔开磁珠和核心序列的联结链和核心序列，核心序列根据模板序列设计得到；②助引物：为磁珠连接引物中的核心序列；③荧光标记引物：根据模板序列设计得到、且能与助引物进行PCR扩增得到食源性病毒保守序列的引物，其5’端标记有荧光染料；

（6）检测：对步骤（5）所得的带有荧光染料的PCR产物的磁珠用流式细胞仪检测荧光信号，荧光信号值高于阈值即表明样品中含有食源性病毒，根据引物的种类即可判断样品中食源性病毒的种类。

2.根据权利要求1所述的基于磁性引物扩增的流式细胞术检测食源性病毒的方法，其特征在于：

步骤（2）中所述的食源性病毒保守序列为食源性病毒特异基因的保守序列；

步骤（2）中所述的用于与磁珠反应的功能基团为氨基、羧基、磷酸基、生物素、链霉亲和素、羟基或巯基；

步骤（2）中所述的荧光染料为FAM、FITC、Cy5或Alexa Fluor 488。

3.根据权利要求1所述的基于磁性引物扩增的流式细胞术检测食源性病毒的方法，其特征在于：

步骤（3）中所述的功能化磁珠的粒径为20nm～10μm；

步骤（3）中所述的功能化磁珠为表面修饰有功能基团的磁珠，所述的功能基团为氨基、羧基或巯基；

步骤（3）中所述的磁性引物的制备方法为：将磁珠连接引物与处理后的功能化磁珠在连接反应液中孵育，纯化，得到磁性引物；其中，磁珠连接引物与磁珠按2～20nmol/mg配比；所述的处理的方式为先用0.01M氢氧化钠溶液清洗功能化磁珠，再用去离子水冲洗；所述的连接反应液为：0.1M的2-吗啉乙磺酸，体积百分比0.25%的吐温-20，10mM的碳二亚胺盐酸盐，pH值为5.0；所述的孵育的条件为室温条件反应3～5小时；所述的纯化为通过磁分离器分离磁性引物，并用纯化缓冲液清洗，所述的纯化缓冲液为：10mM、pH 7.4的PBS中加入吐温-20，吐温-20的终浓度为体积百分比0.25%。

4.根据权利要求1所述的基于磁性引物扩增的流式细胞术检测食源性病毒的方法，其特征在于：步骤（4）中所述的PCR反应的体系包含：模板、Taq酶、Taq酶缓冲液、dNTP、磁性引物、助引物、荧光标记引物、TritonX-100、Tween-20和牛血清白蛋白；所述的磁性引物的终浓度为0.1～0.3μg/μL；所述的助引物的终浓度为20～60nM，所述的荧光标记引物的终浓度为300～500nM，助引物与荧光标记引物按摩尔比1:5～1:25配比；所述的TritonX-100、Tween-20和牛血清白蛋白的终浓度分别为体积百分比0.1%、体积百分比0.5%和质量百分比0.05%。

5.根据权利要求1所述的基于磁性引物扩增的流式细胞术检测食源性病毒的方法，其特征在于：步骤（5）中所述的分离纯化为通过磁分离器进行分离，并用纯化缓冲液清洗；所述的纯化缓冲液为：10mM、pH 7.4的PBS中加入吐温-20，吐温-20的终浓度为体积百分比0.25%。

6.根据权利要求1所述的基于磁性引物扩增的流式细胞术检测食源性病毒的方法，其特征在于：步骤（6）中所述的检测的方法为：将步骤（5）得到的磁珠用检测缓冲液冲洗，然后用检测缓冲液重悬磁珠，再转入流式细胞仪进行检测；所述的检测缓冲液为：1倍Taq酶缓冲液中加入吐温-20，吐温-20的终浓度为体积百分比0.25%。

7.根据权利要求1所述的基于磁性引物扩增的流式细胞术检测食源性病毒的方法，其特征在于：所述的食源性病毒为轮状病毒时，包括以下步骤：

（2）设计合成用于扩增轮状病毒VP6基因片段的引物：

荧光标记引物：5’-FAM-GGTAAATTACCAATTCCTCCAG-3’；

助引物：5’-GGCCTATAGCTCAGCTGGTTAGA-3’；

（6）检测：对步骤（5）所得的带有荧光染料的PCR产物的磁珠用流式细胞仪检测荧光信号，荧光信号值高于阈值即表明样品中含有轮状病毒。

8.根据权利要求7所述的基于磁性引物扩增的流式细胞术检测食源性病毒的方法，其特征在于：

步骤（3）中所述的磁珠的粒径为180nm；

步骤（3）中所述的孵育的条件为室温孵育5小时；

步骤（4）所述的PCR反应的条件为每100μL反应体系的组成如下：cDNA2×10⁸copies/μL、磁性引物10μg、荧光染料引物350nM、助引物为40nM、Taq酶5U、Taq酶缓冲液、TritonX-100体积百分比0.1%、Tween-20体积百分比0.5%、BSA质量百分比0.05%、dNTP 0.1mM；扩增条件为：94℃2分钟；94℃10秒，54℃30秒，72℃30秒，35个循环；72℃后延伸2分钟。

9.根据权利要求8所述的基于磁性引物扩增的流式细胞术检测食源性病毒的方法，其特征在于：所述的特异引物为：5’-GGCCTATAGCTCAGCTGGTTAGA-3’或5’-GGTAAATTACCAATTCCTCCAG-3’。

10.实现权利要求1～9任一项所述的方法检测轮状病毒的试剂盒，主要包括引物、酶、缓冲液、RNA抑制剂、dNTP、TritonX-100、Tween-20和牛血清白蛋白，其特征在于：

所述引物为：

荧光标记引物：5’-FAM-GGTAAATTACCAATTCCTCCAG-3’；

助引物：5’-GGCCTATAGCTCAGCTGGTTAGA-3’；

磁性引物：5’-磁珠-CONH-(CH₂)₆-TTTTTTTTTTTTGGCCTATAGCTCAGCTGGTTAGA-3’，所述的磁珠的粒径为180nm；

逆转录引物：5’-GGTAAATTACCAATTCCTCCAG-3’；

所述的酶包括逆转录酶M-MLV和Taq酶；

所述的缓冲液包括：M-MLV缓冲液、Taq酶缓冲液、纯化缓冲液和检测缓冲液；

所述的纯化缓冲液为：10mM、pH 7.4的PBS中加入吐温-20，吐温-20的终浓度为体积百分比0.25%；

所述的检测缓冲液为：1倍Taq酶缓冲液中加入吐温-20，吐温-20的终浓度为体积百分比0.25%。