CN105087772B - 一种液相基因芯片检测方法、液相基因芯片及试剂盒 - Google Patents

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本发明涉及核酸的检测方法，特别涉及一种液相基因芯片检测方法。本发明还涉及一种液相基因芯片及其制备方法；还涉及一种试剂盒及其制备方法。一种液相基因芯片检测方法，包括利用液相基因芯片获得液相基因芯片反应体系的过程，所述液相基因芯片包含微珠‑第一引物偶联物，所述液相基因芯片反应体系包含分子信标。本发明还涉及一种液相基因芯片，所述液相基因芯片包含所述微珠‑第一引物偶联物。本发明还涉及一种液相基因芯片检测方法所用的试剂盒，该试剂盒包括所述液相基因芯片。本发明解决了液相基因芯片检测中需要对PCR扩增产物管进行开盖及对PCR扩增产物进行移取的动作导致后续样本进行PCR扩增时被污染或存在被污染的风险的技术问题。

Description

一种液相基因芯片检测方法、液相基因芯片及试剂盒
技术领域：
本发明涉及核酸的检测方法，特别涉及一种液相基因芯片检测方法。本发明还涉及一种液相基因芯片及其制备方法；还涉及一种试剂盒及其制备方法。
背景技术：
核酸检测是现代生物分析的前沿技术，已被广泛应用于分子遗传学、免疫学、肿瘤学及微生物学等方面的临床诊断。常规的核酸检测有多种技术方法，如荧光定量PCR(QiY.Appl Environ Microbiol,2001,67(8):3720-3727)、RFLP(限制性酶切片段长度多态性，S.R.Klee.J.Applied Microbiology.2006,100,1364-5072)、基因芯片、DNA测序等。这些技术或操作繁琐，操作时间长，或检测通量低，不适合大样本多位点检测。
生物芯片包括基因芯片和蛋白芯片两大类，按寻址方式和最终检测载体又可分为固相芯片和液相芯片。液相芯片技术是生物芯片技术中的一种，也称悬浮阵列技术(suspension array)，是把微珠(或称微球)用荧光染料进行编码，然后将荧光染料编码的微珠交联上1种特定探针分子(探针分子通过氨基与羟基交联到微珠表面)。应用时，先把针对不同检测物的编码微珠混合，再加入微量待检样本DNA，如果待检样本DNA中存在目的分子，在悬液中目的分子与微珠表面交联的探针分子进行特异性结合，在1个反应孔内可同时完成多达100种不同的生物学反应(分子杂交或免疫反应)。最后用激光流式仪等鉴定微珠颜色以判断结果，同时通过目的分子上的报告分子完成反应的定量分析。由于分子杂交或免疫反应是在悬浮溶液中进行的，所以其检测速度极快，可在1个微量液相反应体系中同时检测100个指标。它同样具有固相芯片的高通量、高集成、微型化、连续化和自动化等优点，还具有液相反应的高敏感性、高重复性、检测线性范围宽、反应快速等优点，但是步骤比较复杂，操作时间长，不能闭管操作，反应液易受污染。
液相芯片方法核心内容是获得“微珠-探针分子-目的分子-报告分子复合物”，目前常规的方法需要经过三个步骤来获得。第一步，PCR扩增获得大量目的分子；第二步，微珠-探针分子(或称微珠-探针偶联物)与PCR扩增产物即目的分子结合，获得微珠-探针分子-目的分子复合物；第三步，微珠-探针分子-目的分子复合物与报告分子(PE，或称藻红蛋白)结合，获得微珠-探针分子-目的分子-报告分子复合物，用于信号检测。此种方法需要的步骤多，第一步后需要对PCR扩增产物管进行开盖和对PCR扩增产物进行移取。因为PE在PCR的温度下会失活，所以只能在PCR扩增之后加入，第三步必定需要对PCR扩增产物管进行开盖。对PCR扩增产物管进行开盖和对PCR扩增产物进行移取增加了后续样本进行PCR扩增时被污染的风险，当后续样本进行PCR扩增被污染时，会发生假阳性。
公开号为CN102827948A、公开日为2012年12月19日的中国发明专利申请公开了基于磁性引物扩增的流式细胞术检测食源性病毒的方法及试剂盒。该方法包括模板的准备、设计合成用于扩增食源性病毒保守序列的引物、制备磁性引物、PCR反应、分离纯化、微珠与杂交探针杂交、检测等步骤。该方法也需要对PCR扩增产物管进行开盖及对PCR扩增产物进行移取的动作，可能导致后续样本进行PCR扩增时被污染。
发明内容
本发明的第一方面目的在于提供一种新的液相基因芯片检测方法，这种液相基因芯片检测方法在检测过程中，不需要对PCR扩增产物管进行开盖及对PCR扩增产物进行移取的动作，解决了目前需要对PCR扩增产物管进行开盖及对PCR扩增产物进行移取的动作导致后续样本进行PCR扩增时被污染或存在被污染的风险的技术问题。
本发明通过以下技术方案解决上述技术问题，达到本发明的目的。
一种液相基因芯片检测方法，包括利用液相基因芯片获得液相基因芯片反应体系的过程，以及在液相基因芯片检测系统中对所述液相基因芯片反应体系进行检测的过程，所述液相基因芯片包含微珠-核酸偶联物，所述液相基因芯片反应体系包含报告分子，其特征在于：所述微珠-核酸偶联物是微珠-第一引物偶联物；所述报告分子是分子信标；所述利用液相基因芯片获得液相基因芯片反应体系的过程，包括以下步骤：
A)、获得所述液相基因芯片：将微珠和第一引物偶联，获得所述微珠-第一引物偶联物，所述液相基因芯片包含一种或多种所述微珠-第一引物偶联物；
B)、获得所述液相基因芯片反应体系：将所述液相基因芯片、第二引物、模板和所述报告分子进行PCR扩增，模板为待检测样本DNA，获得所述液相基因芯片反应体系；
所述第一引物的5’端修饰有与所述微球偶联的功能基团；所述第二引物5’端含有一段所述报告分子的序列。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明所述的利用液相基因芯片获得液相基因芯片反应体系的过程中，利用既有探针功能又有引物功能的微珠-引物偶联物扩增待检测样本DNA，使传统方法中需要先PCR扩增获得目的分子再用探针进行杂交捕获目的分子的两个步骤得以在一个PCR反应内完成，省去杂交捕获目的分子的步骤；本发明还利用基于化学荧光素报告荧光信号的分子信标作为报告分子，使得报告荧光信号的来源由传统方法的藻红蛋白变为化学荧光素，而化学荧光素作为报告分子可以耐受PCR反应的温度，可以放在PCR体系中，克服了传统方法中藻红蛋白不耐受PCR反应的温度，必须单独进行标记反应的操作的缺陷。本发明利用带有双重功能的微珠-引物偶联物及利用基于化学荧光素报告荧光信号的分子信标作为报告分子，实现了一步免开盖获得微珠-目的分子-报告分子复合物，传统方法需要多个步骤来获得微珠-探针分子-目的分子-报告分子复合物，过程中需要对PCR产物管进行开盖及对PCR产物进行移取的动作；本发明在获得液相基因芯片反应体系过程中，不需要对PCR扩增产物管进行开盖及对PCR扩增产物进行移取的动作，不会导致后续样本进行PCR扩增时被污染或存在被污染的风险，杜绝了因此可能导致后续样本的假阳性的现象。与现有技术相比，本发明最重要的是降低了PCR产物污染风险，同时简便了操作，缩短了时间，减少人为操作误差，提高了工作效率。
在上述技术方案中，在所述步骤A)前，还包括所述引物的设计与合成步骤。
在上述技术方案中，在所述步骤B)前，还包括所述报告分子的设计与合成步骤。
在上述技术方案下的一个优选技术方案中，所述微珠是美国Luminex公司的表面羟基修饰的MagPlex磁珠；所述液相基因芯片检测系统是美国Luminex公司的MAGPIX或Luminex100/200液相悬浮芯片系统。确切地说，用荧光编码的，直径为6.5μm的表面羟基修饰的微珠，均可以用于本发明，优选用磁珠，磁珠因其磁性而便于收集。
在上述技术方案下的一个优选技术方案中，所述用于与所述微球偶联的功能基团是Aminolink C6～C18(又称amino-modifier C6-C18)，优选Aminolink C12。
在上述技术方案下的一个优选技术方案中，所述分子信标5’端连接荧光基团，3’端连接淬灭基团，所述荧光基团是可以激发绿色荧光的荧光素，所述淬灭基团是DABCYL。又进一步，所述可以激发绿色荧光的荧光素优选Alexa Fluor 532、HEX、TET或CY3，更优选CY3；所述DABCYL优选3'-DABCYL。
在上述技术方案下的一个优选技术方案中，所述分子信标的环状区具有长度为15～20个碱基的序列，茎干区具有5～8个碱基的互补序列；所述第二引物5’端含有一段所述报告分子的序列，是含有所述分子信标的环状区的相同序列。
本发明所述的液相基因芯片检测方法可以应用于核酸定性检测，也可以应用于基因分型检测。进一步优选，所述待检测样本DNA是大肠杆菌DNA，目的基因序列是大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因lacZ序列；
所述微珠是Luminex公司的表面羟基修饰的MagPlex磁珠；
所述第一引物是5'-NH2-(CH2)12-TGGTGTGGGCCATAATTCAATT-3'；
所述第二引物是5'-AAGGTTGATTGTATTTGGGATCTGCCATTGTCAGA-3'；
所述分子信标是5'CY3-GCGAGAAGGTTGATTGTATTCTCGC-3'DABCYL。
本发明的第二方面目的在于提出一种液相基因芯片，使用这种液相基因芯片，可以实现本发明的上述方法。
一种液相基因芯片，所述液相基因芯片包含微珠-核酸偶联物，其特征在于，所述微珠-核酸偶联物是微珠-第一引物偶联物。
进一步，所述第一引物的5’端修饰有用于与所述微球偶联的功能基团。又进一步，所述用于与所述微球偶联的功能基团Aminolink C6～18，优选Aminolink C12。
进一步，所述微珠是美国Luminex公司的表面羟基修饰的MagPlex磁珠；所述液相基因芯片检测系统是美国Luminex公司的MAGPIX或Luminex 100/200液相悬浮芯片系统。确切地说，用荧光编码的，直径为6.5μm的表面羟基修饰的微珠，均可以用于本发明，优选用磁珠，磁珠因其磁性而便于收集。
进一步，所述液相基因芯片是用于检测大肠杆菌DNA中的大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因lacZ序列的液相基因芯片，所述微珠是Luminex公司的表面羟基修饰的MagPlex磁珠；
所述第一引物是5'-NH2-(CH2)12-TGGTGTGGGCCATAATTCAATT-3'。
进一步，所述液相基因芯片是用于检测人基因组DNA中的SNP位点β珠蛋白ⅣS-Ⅱ-654(C>T)(rs34451549)的液相基因芯片，所述微珠是Luminex公司的表面羟基修饰的MagPlex磁珠；所述第一引物包括野生型第一引物和突变型第一引物，所述野生型第一引物是5'-NH2-(CH2)12-AACAGTGATAATTTCTGGGTTAAGGC-3'；
所述突变型第一引物是
5'-NH2-(CH2)12-AATAACAGTGATAATTTCTGGGTTAAGGT-3'
本发明的第三方面目的在于提出前述液相基因芯片的制备方法。
一种液相基因芯片的制备方法，包括制备微珠-核酸偶联物的过程，其特征在于，所述微珠-核酸偶联物是微珠-第一引物偶联物，制备所述微珠-第一引物偶联物的过程包括以下步骤：
a)、将所述微珠与MES溶液，混匀，得到偶联体系；
b)、在所述偶联体系中加入所述第一引物和新鲜配制的EDC，避光放置；
c)、加入新鲜配制的EDC，混匀，避光放置；
d)、用Tween-20溶液和SDS溶液洗涤，即得到所述微珠-第一引物偶联物。
进一步，将所获得的所述微珠-第一引物偶联物置于TE溶液中进行保存。优选所述TE溶液pH8.0，其中物质组成是10mMTris-HCl、1mM EDTA。
进一步，在所述步骤a)中，所述MES(2-(N-吗啉)乙磺酸)溶液是0.1M，pH4.5的MES溶液。
进一步，在所述步骤b)中，所述在所述偶联体系中加入所述第一引物是在含有5.0×106个微珠的偶联体系中加入0.2-0.5nanomole所述第一引物；所述新鲜配制的EDC在所述偶联体系中终浓度为0.5μg/μL，所述避光放置是避光放置30min～60min。
进一步，在所述步骤c)中，所述新鲜配制的EDC在所述偶联体系中终浓度为0.5μg/μL；所述避光放置是避光放置30min～60min。
所述SDS是指十二烷基磺酸钠。
在所述液相基因芯片含多种微珠-第一引物偶联物的情况下，每种微珠-第一引物偶联物的制备，均按上述步骤a)～步骤d)进行，然后再将各种微珠-第一引物偶联物混合。
本发明的第四方面目的在于提出一种液相基因芯片检测方法所用的试剂盒，使用这种试剂盒，可以实现本发明的上述方法。
一种液相基因芯片检测方法所用的试剂盒，其特征在于，包括：如前文所述的液相基因芯片，以及第二引物和报告分子，所述报告分子是分子信标。
进一步，所述液相基因芯片含多种微珠-第一引物，所述试剂盒相应地包括多种第二引物。又进一步，每种微珠-第一引物的数量均为2500个/反应，每种第二引物浓度范围在100-400nM，报告分子的浓度范围在200-800nM。
当所述液相基因芯片是用于检测大肠杆菌DNA中的大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因lacZ序列的液相基因芯片时，所述第二引物是5'-AAGGTTGATTGTATTTGGGATCTGCCATTGTCAGA-3'；所述分子信标是5'CY3-GCGAGAAGGTTGATTGTATTCTCGC-3'DABCYL。
当所述液相基因芯片是用于检测人基因组DNA中的SNP位点β珠蛋白ⅣS-Ⅱ-654(C>T)(rs34451549)的液相基因芯片时，所述第二引物是5'-AAGGTTGATTGTATTAATGGTAGCTGGATTGTAGCTGC-3'；
所述分子信标是5'CY3-GCGAGAAGGTTGATTGTATTCTCGC-3'DABCYL。
本发明的第五方面目的在于提出前述液相基因芯片检测方法所用的试剂盒的制备方法。
一种液相基因芯片检测方法所用的试剂盒的制备方法，包括液相基因芯片的制备过程，所述液相基因芯片的制备过程采用如前述的液相基因芯片的制备方法。
附图说明
图1是现有技术中获得微珠-探针分子-目的分子-报告分子复合物的流程图；
图2是本发明获得微珠-目的分子-报告分子复合物的流程图；
图3为本发明所述的液相基因芯片检测方法原理图；
图4为本发明所述的液相基因芯片检测方法应用于核酸定性检测的示意图；
图5为本发明所述的液相基因芯片检测方法应用于基因分型检测的示意图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的具体实施方式不限于此。
本发明的第一方面，提出了一种液相基因芯片检测方法。该液相基因芯片检测方法，包括利用液相基因芯片获得液相基因芯片反应体系的过程，以及在液相基因芯片检测系统中对所述液相基因芯片反应体系进行检测的过程，所述液相基因芯片包含微珠-核酸偶联物，所述液相基因芯片反应体系包含报告分子，所述微珠-核酸偶联物是微珠-第一引物偶联物，所述报告分子是分子信标。
所述液相基因芯片检测系统是美国Luminex公司的MAGPIX或Luminex 100/200液相悬浮芯片系统。
所述利用液相基因芯片获得液相基因芯片反应体系的过程，包括以下步骤：
所述引物的设计与合成步骤；
所述报告分子的设计与合成步骤；
获得所述液相基因芯片的步骤：将微珠和第一引物偶联，获得所述微珠-第一引物偶联物，所述微珠优选美国Luminex公司的表面羟基修饰的MagPlex磁珠；所述液相基因芯片包含一种或多种(2～100种)所述微珠-第一引物偶联物；在所述液相基因芯片包含一种所述微珠-第一引物偶联物的情况下，获得所述微珠-第一引物偶联物即获得所述液相基因芯片；在所述液相基因芯片包含多种所述微珠-第一引物偶联物的情况下，将获得的各种微珠-第一引物偶联物混合，即获得所述液相基因芯片；
获得所述液相基因芯片反应体系的步骤：将所述液相基因芯片、第二引物、分子信标进行PCR扩增，模板为待检测样本DNA，所述待检测样本DNA是待进行核酸定性检测的样本DNA，或待进行基因分型检测的样本DNA；如待检测样本DNA含有目的基因序列则获得微珠-目的分子-报告分子复合物(见图3，01代表微珠，02代表目的分子，03代表报告分子)，后续在液相基因芯片检测系统中对所述液相基因芯片反应体系进行检测的过程中，借助液相基因芯片检测系统能检测到报告分子荧光信号值；如待检测样本DNA不含有目的基因序列则无法获得所述微珠-目的分子-报告分子复合物，后续在液相基因芯片检测系统中对所述液相基因芯片反应体系进行检测的过程中，借助液相基因芯片检测系统检测不到报告分子荧光信号。
所述第一引物和所述第二引物是所述PCR扩增中用于合成所述目的分子的引物，所述第一引物的5’端修饰有用于与所述微球偶联的功能基团，所述用于与所述微球偶联的功能基团Aminolink C6～18，优选AminolinkC12；所述第二引物5’端含有一段所述报告分子的序列。
所述报告分子是分子信标。所述分子信标5’端连接荧光基团，3’端连接淬灭基团，所述荧光基团是可以激发绿色荧光的荧光素，所述淬灭基团是DABCYL。所述可以激发绿色荧光的荧光素优选Alexa Fluor 532、HEX、TET或CY3，更优选CY3；所述DABCYL优选3'-DABCYL。所述分子信标的环状区具有长度为15～20个碱基的序列，茎干区具有5～8个碱基的互补序列；所述第二引物5’端含有一段所述报告分子的序列，是含有所述分子信标的环状区的相同序列。
如图4所示，本发明应用于核酸定性检测，如果待检测样本DNA含有目的基因序列，所述获得所述液相基因芯片的步骤在理论上可以分为三个阶段，在B1阶段，模板3变性解开，微珠5和第一引物1偶联得到的微珠-第一引物偶联物、第二引物2与变性解开的模板3结合(复性)，第二引物2的5’端含有一段分子信标4的环状区的相同序列21，此时分子信标相对于模板3是游离的；在B2阶段，第一引物1、第二引物2延伸生成两条新链61、62，新链61是微珠-第一引物偶联物延伸而来，新链62是第二引物2延伸而来，所以新链61的3’端含有一段分子信标4的环状区的互补序列；在B3阶段，新链61、62变性解开，因新链61的3’端含有的一段分子信标4的环状区的互补序列与分子信标4的环状区的序列互补，且分子信标4作为短链核酸有杂交优势，所以新链61的3’端与分子信标4的环状区实现了结合，获得微珠-目的分子-报告分子复合物。当然，图4是示例性的，只给出了一种待检测样本DNA，实际上在一次检测中，可以针对多种待检测样本DNA进行检测，本说明书不予赘述。
如图5所示，本发明应用于基因分型检测，这种情况下，针对突变位点，设计两条第一引物，一条为野生型第一引物11，另一条为突变型第一引物12，微珠51和野生型第一引物11偶联得到微珠-野生型第一引物偶联物，微珠52(与微珠51颜色不同，为示区分，图中微珠51上标有“1”，微珠52上标有“2”)和突变型第一引物12偶联得到微珠-突变型第一引物偶联物；所述获得所述液相基因芯片的步骤在理论上可以分为三个阶段，在B1阶段，在待检测样本DNA的SNP位点是野生型的情况下，微珠-野生型第一引物偶联物、第二引物2与变性解开的模板3结合，第二引物2的5’端含有一段分子信标4的环状区的相同序列21，此时分子信标4相对于模板3是游离的，微珠-突变型第一引物偶联物也是游离的，因突变型第一引物的序列不匹配于模板3，不与模板3结合；在B2阶段，第一引物1、第二引物2延伸生成两条新链61、62，新链61是微珠-野生型第一引物偶联物延伸而来，新链62是第二引物2延伸而来，所以新链61的3’端含有一段分子信标4的环状区的互补序列；微珠-突变型第一引物偶联物未扩增形成新链；在B3阶段，新链61、62变性解开，因新链61的3’端含有的一段分子信标4的环状区的互补序列与分子信标4的环状区的序列互补，且分子信标4作为短链核酸有杂交优势，所以新链61的3’端与分子信标4的环状区实现了结合，获得野生型微珠-目的分子-报告分子复合物；因B2阶段微珠-突变型第一引物偶联物未延伸形成新链，所以B3阶段未获得突变型型微珠-目的分子-报告分子复合物。当然，图5是示例性的，只给出了一个SNP位点的情况，实际上在一次检测中，可以针对多个SNP位点进行检测，本说明书不予赘述。
本方法针对大多数核酸检测，包括病毒或菌种鉴定、已知SNP检测、已知缺失的检测，每种基因均有自己的特征基因片段，设计的与微珠偶联的第一引物，以及带有分子信标环状序列的的第二引物，在一定条件下可以扩增这些特征基因片段。当检测体系存在目的基因序列时，通过变性为单链，随后复性与分子信标杂交，形成微珠-目的分子-报告分子复合物，借助液相基因芯片检测系统检测报告分子荧光信号值；当检测体系不存在目的基因片段时，通过变性与复性步骤，不能形成微珠-目的分子-报告分子复合物，借助液相基因芯片检测系统检测不到报告分子荧光信号。
本方法可以用于疾病的诊断与治疗目的，也可以用于非疾病的诊断与治疗目的。用于疾病的诊断与治疗目的，如地中海贫血的检测、Y染色体微缺失检测、HPV检测等；用于非疾病的诊断与治疗目的，如检测大肠杆菌(E.coli)β-半乳糖苷酶基因lacZ等。
作为本发明的第二方面，本发明提出了一种液相基因芯片，使用这种液相基因芯片，可以实现本发明的上述方法。
一种液相基因芯片，所述液相基因芯片包含微珠-核酸偶联物，其特征在于，所述微珠-核酸偶联物是微珠-第一引物偶联物。
液相基因芯片是悬液，除了包含微珠-第一引物偶联物，还包括缓冲液，所述缓冲液是pH8.0TE(其中物质组成是10mMTris-HCl、1mM EDTA)溶液，所述微珠-第一引物偶联物有多种，每种微珠-第一引物偶联物在所述缓冲液中的浓度是125个/μl。
作为本发明的第三方面，本发明提出了一种液相基因芯片的制备方法，
一种液相基因芯片的制备方法，包括制备微珠-核酸偶联物的过程，其特征在于，所述制备微珠-核酸偶联物的过程包括以下步骤：
a)、将所述微珠与0.1M，pH4.5的MES(2-(N-吗啉)乙磺酸)溶液，混匀，得到偶联体系；
b)、在含有5.0×106个微珠的偶联体系中加入0.2-0.5nanomole所述第一引物和新鲜配制的EDC(二氯乙烷)，所述新鲜配制的EDC在偶联体系中终浓度为0.5μg/μL，避光放置30min～60min；
c)、加入新鲜配制的EDC，所述新鲜配制的EDC在偶联体系中终浓度为0.5μg/μL，混匀，避光放置30min～60min；
d)、用Tween-20溶液和SDS(十二烷基磺酸钠)溶液洗涤，即得到所述微珠-第一引物偶联物；
e)、将所获得的所述微珠-第一引物偶联物置于pH8.0TE溶液(其中物质组成是10mMTris-HCl、1mM EDTA)中进行保存。
在所述液相基因芯片含多种微珠-第一引物偶联物的情况下，每种微珠-第一引物偶联物的制备，均按上述步骤a)～步骤d)进行，然后再将各种微珠-第一引物偶联物混合。
作为本发明的第四方面，本发明提出了一种液相基因芯片检测方法所用的试剂盒，使用这种试剂盒，可以实现本发明的上述方法。
一种液相基因芯片检测方法所用的试剂盒，其特征在于，包括：如前文所述的液相基因芯片，以及第二引物和报告分子，所述报告分子是分子信标。
优选地，该试剂盒中，液相基因芯片含多种微珠-第一引物偶联物，该试剂盒相应地包括多种第二引物，报告分子可以只为一种。每种微珠-第一引物偶联物的数量均为2500个/反应，每种第二引物浓度范围在100-400nM，报告分子的浓度范围在200-800nM。
本发明的第五方面目的在于提出前述液相基因芯片检测方法所用的试剂盒的制备方法。
一种液相基因芯片检测方法所用的试剂盒的制备方法，包括液相基因芯片的制备过程，还包括加入所述第二引物、所述报告分子且混合均匀的过程，所述液相基因芯片的制备过程采用如前述的液相基因芯片的制备方法。
实施例1液相基因芯片检测大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因lacZ的方法
在本实施例中，待检测样本DNA是大肠杆菌(Escherichia coli str.K-12substr.MG1655，市售)DNA，目的基因序列是β-半乳糖苷酶基因lacZ(GenBank:U00096.3，Escherichia coli str.K-12substr.MG1655)序列；
微珠是Luminex公司的表面羟基修饰的MagPlex磁珠；
第一引物是5'-NH2-(CH2)12-TGGTGTGGGCCATAATTCAATT-3'；
第二引物是5'-AAGGTTGATTGTATTTGGGATCTGCCATTGTCAGA-3'；
报告分子是分子信标5'CY3-GCGAGAAGGTTGATTGTATTCTCGC-3'DABCYL。环状区的15个碱基序列是中间的AAGGTTGATTGTATT，5个碱基互补序列的茎干区是两头的GCGAG和CTCGC。
一种液相基因芯片检测大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因lac的方法，包括利用液相基因芯片获得液相基因芯片反应体系的过程，以及在液相基因芯片检测系统中对液相基因芯片反应体系进行检测的过程，液相基因芯片包含微珠-核酸偶联物，微珠-核酸偶联物是微珠-第一引物偶联物。
液相基因芯片检测大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因lacZ的方法，具体包括以下步骤：
1)、获取待检测样本DNA：按照常规方法，使用TIANamp Bacteria DNA Kit提取大肠杆菌DNA。
2)、引物的设计与合成步骤：第一引物合成时引入5'Aminolink C12修饰，目的在于引物氨基与微珠羟基偶联，形成微珠-第一引物偶联物，引入C12来降低微珠-第一引物偶联物的空间位阻效应及阻止向微珠方向的扩增反应。第一引物用纯水稀释至0.1mM，第二引物用纯水稀释至0.1mM，备用。
3)、分子信标的设计与合成步骤：分子信标用纯水稀释至0.1mM，备用。
4)、获得微珠-第一引物偶联物：将微珠和第一引物偶联；
具体操作过程如下：
取未偶联MagPlex磁珠5.0×106个，加入离心管，8000g离心2min后弃上清，加入50μl 0.1M pH4.5的MES溶液，涡旋20s；
继续在离心管中加入2μl第一引物(0.2nanomole)，涡旋混匀；
准备新鲜的10mg/ml EDC，取2.5μl加入上述离心管，涡旋混匀，避光放置30min；
再准备新鲜的10mg/ml EDC，取2.5μl加入上述离心管，涡旋混匀，避光放置30min；
加入1.0ml体积百分比为0.02％Tween-20至上述离心管中，8000g离心2min，去上清，加入1.0ml的质量体积比为0.1％的SDS，涡旋混匀，8000g离心2min；
去上清，加入100μl pH8.0TE(其中物质组成是10mMTris-HCl、1mM EDTA)溶液，涡旋20s，得到偶联好的微珠-第一引物偶联物。
使用血细胞计数器计数微珠数量(计数四角4个大方格的数目后换算为每微升微珠个数)，如需保存，应在2-8℃避光保存。
5)、获得液相芯片：将步骤4)获得的微珠-第一引物偶联物，分散在pH8.0TE缓冲液中，使偶联物的浓度为125个/μl，获得液相芯片。
6)、获得微珠-目的分子-报告分子复合物：将步骤5)获得的液相芯片以及第二引物、分子信标进行PCR扩增，模板为待检测样本DNA，具体操作如下：
0.2mlPCR反应管中加入步骤5)获得的液相芯片以及第二引物、分子信标，液相芯片含有2500个微珠-第一引物偶联物/反应，加入的第二引物的终浓度为400nM，加入的分子信标的终浓度为800nM；
PCR反应所用MIX，选用2×Taq Master Mix(将PCR反应所需的Taq酶、dNTP混合物、MgCl2以及反应缓冲液预先配置成2倍浓度的混合物)，优选ABI 4304437TaqMan UniversalPCR Master Mix；
加入提取的DNA 100ng，加入30μl 2×Taq Master Mix，补充纯水至PCR体系总体积为60μl；PCR反应扩增条件为：95℃10分钟；95℃15秒，60℃15秒，72℃15秒，35个循环；72℃延伸2分钟；95℃1分钟，60℃1分钟，获得微珠-目的分子-报告分子复合物。
7)、结果分析与判读：步骤6)完成后，取50μl产物(无需分离纯化)上MAGPIX液相悬浮芯片系统(美国Luminex公司)读取荧光信号值MFI，检测条件为常温；检测仪参数设置为Count 100；通过附带的XPonent 4.2数据收集软件获得荧光信号值进行判断分析检测结果，结果如表1所示。
表1
标本 信号值 分析判读结果
1 503 阳性
2 524 阳性
3 613 阳性
4 598 阳性
5 60 阴性
对比例1：
在本对比例中，待检测样本DNA是大肠杆菌(Escherichia coli str.K-12substr.MG1655，市售，与实施例同)，目的基因序列是β-半乳糖苷酶基因lacZ(GenBank:U00096.3，Escherichia coli str.K-12substr.MG1655)序列；
微珠是Luminex公司的表面羟基修饰的MagPlex磁珠；
第一引物是5'-TGGTGTGGGCCATAATTCAATT-3'；
第二引物是5'-TGGGATCTGCCATTGTCAGA-3'；
探针是5'-NH2-(CH2)12-CAGCGCAGACCGTTTTCGCT-3'
报告分子是SAPE。
现有技术中液相基因芯片检测大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因lac的方法，包括利用液相基因芯片获得液相基因芯片反应体系的过程，以及在液相基因芯片检测系统中对液相基因芯片反应体系进行检测的过程，液相基因芯片包含微珠-核酸偶联物，微珠-核酸偶联物是微珠-探针偶联物。
现有技术中液相基因芯片检测大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因lacZ的方法，包括以下步骤：
1)、获取待检测样本DNA：按照常规方法，使用TIANamp Bacteria DNA Kit提取大肠杆菌DNA；
2)、引物的设计与合成步骤：第二引物合成时需5'生物素标记；第一引物和第二引物均用纯水稀释至0.1mM，备用。
3)探针的设计与合成步骤：探针合成时引入5'Aminolink C12修饰，目的在于探针氨基与微珠羟基偶联，形成微珠-探针偶联物；探针用纯水稀释至0.1mM，备用。
4)、获得微珠-探针偶联物：将微珠和探针偶联，获得微珠-探针偶联物；
具体操作过程如下：
取未偶联MagPlex磁珠5.0×106个，加入离心管，8000g离心2min后弃上清，加入50μl 0.1M pH4.5的MES溶液，涡旋20s；
继续在离心管中加入2μl探针(0.2nanomole)，涡旋混匀；
准备新鲜的10mg/ml EDC，取2.5μl加入上述离心管，涡旋混匀，避光放置30min；
再准备新鲜的10mg/ml EDC，取2.5μl加入上述离心管，涡旋混匀，避光放置30min；
加入1.0ml体积百分比为0.02％Tween-20至上述离心管中，8000g离心2min，去上清，加入1.0ml的质量体积比为0.1％的SDS(十二烷基磺酸钠)，涡旋混匀，8000g离心2min；
去上清，加入100μl pH8.0TE(其中物质组成是10mMTris-HCl、1mM EDTA)溶液，涡旋20s，得到偶联好的微珠-探针偶联物；
使用血细胞计数器计数微珠数量(计数四角4个大方格的数目后换算为每微升微珠个数)，如需保存，应在2-8℃避光保存。
5)、获得液相芯片：将步骤4)获得的微珠-探针偶联物分散在1.5×TMAC溶液(组成：4.5MTMAC<四甲基氯化铵>，0.15％Sarkosyl<十二烷基肌氨酸钠>，75mM Tris，6mMEDTA)中，使偶联物的浓度为125个/μl，获得液相芯片。
6)、PCR扩增获得PCR产物：将第一引物、第二引物进行PCR扩增，模板为待检测样本DNA，具体操作如下：
0.2mlPCR反应管中加入第一引物、第二引物，加入的第一引物的终浓度为400nM，加入的第二引物的终浓度为400nM；
PCR反应所用MIX，选用2×Taq Master Mix(将PCR反应所需的Taq酶、dNTP混合物、MgCl2以及反应缓冲液预先配置成2倍浓度的混合物)，优选ABI 4304437TaqMan UniversalPCR Master Mix；
加入提取的DNA 100ng，加入30μl 2×Taq Master Mix，补充纯水至PCR体系总体积为60μl；PCR反应扩增条件为：95℃10分钟；95℃15秒，60℃15秒，72℃15秒，35个循环；72℃延伸2分钟；获得PCR产物。
7)、杂交获得微珠-探针-目的分子复合物：取步骤5)获得的液相芯片加入反应孔，使微珠-探针偶联物2500个/反应；取步骤6)获得的PCR产物3μl加入反应孔；最后加入TE，pH8.0，使总体积为50μl，轻轻混匀；
放入PCR仪，反应条件为：
95℃5分钟(变性步骤)；60℃15分钟(杂交步骤)；获得微珠-探针-目的分子复合物。
8)、报告分子混合液的配置：在杂交期间，配制报告分子混合液，使SAPE在1×TAMC杂交缓冲液中的终浓度为12μg/mL，获得报告分子混合液；
报告分子SAPE(streptavidin R phycoeryhtrin,藻红蛋白标记的链霉亲和素)；1×TAMC杂交缓冲液的组成：3M TMAC(四甲基氯化铵)，0.01％Sarkosyl(十二烷基肌氨酸钠)，50mM Tris，4mM EDTA。
9)、获得微珠-探针-目的分子-报告分子复合物：取25μl步骤8)所获得的报告分子混合液，加入步骤7)反应完成的反应孔里，轻轻混匀，60℃孵育5分钟；获得微珠-探针-目的分子-报告分子复合物。
10)、结果分析与判读：步骤9)完成后，取50μl在MAGPIX液相悬浮芯片系统(美国Luminex公司)上读取荧光信号值MFI，检测条件为60℃；检测仪参数设置为Count 100；通过附带的XPonent 4.2数据收集软件获得荧光信号值进行判断分析检测结果，结果如表2所示。
表2
标本 信号值 分析结果
1 658 阳性
2 671 阳性
3 710 阳性
4 603 阳性
5 97 阴性
从上面的实施例1和对比例1可见，使用本发明的检测方法，和使用现有技术的检测方法相比，结果一致率为100％。
实施例2液相基因芯片检测应用于基因分型检测的方法
在本实施例中，待检测样本DNA是人基因组DNA，SNP位点为β珠蛋白ⅣS-Ⅱ-654(C>T)(rs34451549)；
微珠是Luminex公司的表面羟基修饰的MagPlex磁珠；用于与野生型第一引物偶联的微珠编码区为Bead region 20#Beads，用于与突变型第一引物偶联的微珠编码区为Beadregion 47#Beads；
野生型第一引物是
5'-NH2-(CH2)12-AACAGTGATAATTTCTGGGTTAAGGC-3'；
突变型第一引物是
5'-NH2-(CH2)12-AATAACAGTGATAATTTCTGGGTTAAGGT-3'
第二引物是
5'-AAGGTTGATTGTATT AATGGTAGCTGGATTGTAGCTGC-3'；
报告分子是分子信标5'CY3-GCGAGAAGGTTGATTGTATTCTCGC-3'DABCYL。
一种液相基因芯片应用于基因分型检测的方法，包括利用液相基因芯片获得液相基因芯片反应体系的过程，以及在液相基因芯片检测系统中对液相基因芯片反应体系进行检测的过程，液相基因芯片包含微珠-核酸偶联物，微珠-核酸偶联物是微珠-第一引物偶联物。
液相基因芯片检测SNP位点β珠蛋白ⅣS-Ⅱ-654(C>T)的方法，具体包括以下步骤：
1)、获取待检测样本DNA：按照常规方法，使用TIANamp Genomic DNA Kit提取样本基因组DNA。
2)、引物的设计与合成步骤：第一引物合成时引入5'Aminolink C12修饰，目的在于引物氨基与微珠羟基偶联，形成微珠-第一引物偶联物，引入C12来降低微珠-第一引物偶联物的空间位阻效应及阻止向微珠方向的扩增反应。Aminolinker C12修饰的第一引物用纯水稀释至0.1mM，第二引物用纯水稀释至0.1mM，备用。
3)、分子信标的设计与合成步骤：分子信标用纯水稀释至0.1mM，备用。
4)、获得微珠-第一引物偶联物：将微珠和第一引物偶联；
将编码区为Bead region 20#Beads的微珠和野生型第一引物偶联，获得微珠-野生型第一引物偶联物，将编码区为Bead region 47#Beads的微珠和突变型第一引物偶联，获得微珠-突变型第一引物偶联物；
具体操作过程如下：
取未偶联MagPlex磁珠5.0×106个，加入离心管，8000g离心2min后弃上清，加入50μl 0.1M pH4.5的MES溶液，涡旋20s；
继续在离心管中加入2μl第一引物(0.2nanomole)，涡旋混匀；
准备新鲜的10mg/ml EDC，取2.5μl加入上述离心管，涡旋混匀，避光放置30min；
再准备新鲜的10mg/ml EDC，取2.5μl加入上述离心管，涡旋混匀，避光放置30min；
加入1.0ml体积百分比为0.02％Tween-20至上述离心管中，8000g离心2min，去上清，加入1.0ml的质量体积比为0.1％的SDS，涡旋混匀，8000g离心2min；
去上清，加入100μl pH8.0TE(其中物质组成是10mMTris-HCl、1mM EDTA)溶液，涡旋20s，获得偶联好的微珠-第一引物偶联物；
使用血细胞计数器计数微珠数量(计数四角4个大方格的数目后换算为每微升微珠个数)，如需保存，应在2-8℃避光保存。
5)获得液相芯片，将步骤4)获得的微珠-野生型第一引物偶联物与微珠-突变型第一引物偶联物分散于pH8.0TE中，使每种偶联物的浓度为125个/μl，获得液相芯片。
6)、获得微珠-目的分子-报告分子复合物：将步骤5)获得的液相芯片、第二引物、分子信标进行PCR扩增，模板为待检测样本DNA，具体操作如下：
0.2mlPCR反应管中加入液相芯片、第二引物、分子信标，使每种微珠-第一引物偶联物均为2500个/反应、加入的第二引物的终浓度为400nM，加入的分子信标的终浓度为800nM。
PCR反应所用MIX，选用2×Taq Master Mix(将PCR反应所需的Taq酶、dNTP混合物、MgCl2以及反应缓冲液预先配置成2倍浓度的混合物)，优选ABI 4304437TaqMan UniversalPCR Master Mix；
加入提取的DNA 100ng，加入30μl 2×Taq Master Mix，补充纯水至PCR体系总体积为60μl；PCR反应扩增条件为：95℃10分钟；95℃15秒，60℃15秒，72℃15秒，35个循环；72℃延伸2分钟；95℃1分钟，60℃1分钟，获得微珠-目的分子-报告分子复合物。
7)、结果分析与判读：步骤6)完成后，取50μl产物(无需分离纯化)上MAGPIX液相悬浮芯片系统(美国Luminex公司)读取荧光信号值MFI，检测条件为常温；检测仪参数设置为Count 100；通过附带的XPonent 4.2数据收集软件获得荧光信号值进行判断分析检测结果，结果如表3所示。
表3
对比例2：
在本对比例中，待检测样本DNA是人基因组DNA，SNP位点为β珠蛋白ⅣS-Ⅱ-654(C>T)(rs34451549)；
微珠是Luminex公司的表面羟基修饰的MagPlex磁珠；
用于与野生型探针偶联的微珠编码区为Bead region 20#Beads，用于与突变型探针偶联的微珠编码区为Bead region 47#Beads；
第一引物是5'-CTTTCAGGGCAATAATGATACAATGT-3'；
第二引物是5'-ATGGTAGCTGGATTGTAGCTGCTA-3'；
野生型探针是
5'-NH2-(CH2)12-TTTCTGGGTTAAGGCAATAGCAATATCTC-3'
突变型探针是
5'-NH2-(CH2)12-CTGGGTTAAGGTAATAGCAATATCTCTGCA-3'
报告分子是SAPE。
现有技术中液相基因芯片检测SNP位点基因分型方法，包括利用液相基因芯片获得液相基因芯片反应体系的过程，以及在液相基因芯片检测系统中对液相基因芯片反应体系进行检测的过程，液相基因芯片包含微珠-核酸偶联物，微珠-核酸偶联物是微珠-探针偶联物。
现有技术中液相基因芯片检测SNP位点β珠蛋白ⅣS-Ⅱ-654(C>T)的方法，具体包括以下步骤：
1)、获取待检测样本DNA：按照常规方法，使用TIANamp Genomic DNA Kit提取样本基因组DNA。
2)、引物的设计与合成步骤：第二引物合成时需5'生物素标记；第一引物和第二引物均用纯水稀释至0.1mM。
3)探针的设计与合成步骤：探针合成时引入5'Aminolink C12修饰，目的在于探针氨基与微珠羟基偶联，形成微珠-探针偶联物；探针1和探针2均用纯水稀释至0.1mM。
4)、获得微珠-探针偶联物：将微珠和探针偶联，获得微珠-探针偶联物；编码区为Bead region20#Beads的微珠和野生型探针偶联，获得微珠-野生型探针偶联物，编码区为Bead region 47#Beads的微珠和突变型探针偶联，获得微珠-突变型探针偶联物；
具体操作过程如下：
取未偶联MagPlex磁珠5.0×106个，加入离心管，8000g离心2min后弃上清，加入50μl 0.1M pH4.5的MES溶液，涡旋20s；
继续在离心管中加入2μl探针(0.2nanomole)，涡旋混匀；
准备新鲜的10mg/ml EDC，取2.5μl加入上述离心管，涡旋混匀，避光放置30min；
再准备新鲜的10mg/ml EDC，取2.5μl加入上述离心管，涡旋混匀，避光放置30min；
加入1.0ml体积百分比为0.02％Tween-20至上述离心管中，8000g离心2min，去上清，加入1.0ml的质量体积比为0.1％的SDS，涡旋混匀，8000g离心2min；
去上清，加入100μl pH8.0TE(其中物质组成是10mMTris-HCl、1mM EDTA)溶液，涡旋20s，获得偶联好的微珠-探针偶联物；
使用血细胞计数器计数微珠数量(计数四角4个大方格的数目后换算为每微升微珠个数)，如需保存，应在2-8℃避光保存。
5)获得液相芯片，将步骤4)获得的微珠-野生型探针偶联物和微珠-突变型探针偶联物分散在1.5×TMAC溶液中，使每种偶联物的浓度为125个/μl，获得液相芯片。
6)、PCR扩增获得PCR产物：将第一引物、第二引物进行PCR扩增，模板为待检测样本DNA，具体操作如下：
0.2mlPCR反应管中加入第一引物、第二引物，加入的第一引物的终浓度为400nM，加入的第二引物的终浓度为400nM；
PCR反应所用MIX，选用2×Taq Master Mix(将PCR反应所需的Taq酶、dNTP混合物、MgCl2以及反应缓冲液预先配置成2倍浓度的混合物)，优选ABI 4304437TaqMan UniversalPCR Master Mix；
加入提取的DNA 100ng，加入30μl 2×Taq Master Mix，补充纯水至PCR体系总体积为60μl；PCR反应扩增条件为：95℃10分钟；95℃15秒，60℃15秒，72℃15秒，35个循环；72℃延伸2分钟，获得PCR产物。
7)、杂交获得微珠-探针-目的分子复合物：取步骤5)液相芯片加入反应孔，使每种微珠-探针偶联物在反应体系中为2500个/反应；取步骤6)获得的PCR产物3μl分别加入反应孔，最后加入pH8.0TE，使总体积为50μl。轻轻混匀。
放入PCR仪，反应条件为：
95℃5分钟(变性步骤)；60℃15分钟(杂交步骤)。
8)、报告分子混合液的配置：在杂交期间，配制报告分子混合液，使SAPE在1×TAMC杂交缓冲液中的终浓度为12μg/mL，获得报告分子混合液；
报告分子SAPE(streptavidin R phycoeryhtrin,藻红蛋白标记的链霉亲和素)；1×TAMC杂交缓冲液的组成：3M TMAC(四甲基氯化铵)，0.01％Sarkosyl(十二烷基肌氨酸钠)，50mM Tris，4mM EDTA。
9)、获得微珠-探针-目的分子-报告分子复合物：取25μl步骤8)所获得的报告分子混合液，加入步骤7)反应完成的反应孔里，轻轻混匀，60℃孵育5分钟；获得微珠-探针-目的分子-报告分子复合物。
10)、结果分析与判读：步骤9)完成后，取50μl在MAGPIX液相悬浮芯片系统(美国Luminex公司)上读取荧光信号值MFI，检测条件为60℃；检测仪参数设置为Count 100；通过附带的XPonent 4.2数据收集软件获得荧光信号值进行判断分析检测结果，结果如表4所示。
表4
从上面的实施例2和对比例2可见，使用本发明的检测方法，和使用现有技术的检测方法相比，结果一致率为100％。
上述实例为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的具体实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种液相基因芯片检测方法，用于非疾病的诊断与治疗目的，包括利用液相基因芯片获得液相基因芯片反应体系的过程，以及在液相基因芯片检测系统中对所述液相基因芯片反应体系进行检测的过程，所述液相基因芯片包含微珠-核酸偶联物，所述液相基因芯片反应体系包含报告分子，其特征在于，所述微珠-核酸偶联物是微珠-第一引物偶联物；所述报告分子是分子信标；所述利用液相基因芯片获得液相基因芯片反应体系的过程，包括以下步骤：
A)、获得所述液相基因芯片：将微珠和第一引物偶联，获得所述微珠-第一引物偶联物，所述液相基因芯片包含一种或多种所述微珠-第一引物偶联物；
B)、获得所述液相基因芯片反应体系：将所述液相基因芯片、第二引物、模板和所述报告分子进行PCR扩增，模板为待检测样本DNA，获得所述液相基因芯片反应体系；所述第一引物的5’端修饰有用于与所述微珠偶联的功能基团；
所述第二引物5’端含有一段所述报告分子的序列；
所述待检测样本DNA是大肠杆菌DNA，目的基因序列是大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因lacZ序列；
所述微珠是Luminex公司的表面羟基修饰的MagPlex磁珠；
所述第一引物是5'-NH2-(CH2)12-TGGTGTGGGCCATAATTCAATT-3'；
所述第二引物是5'-AAGGTTGATTGTATTTGGGATCTGCCATTGTCAGA-3'；
所述分子信标是5'CY3-GCGAGAAGGTTGATTGTATTCTCGC-3'DABCYL。
2.如权利要求1所述的一种液相基因芯片检测方法，其特征在于，所述微珠是美国Luminex公司的表面羟基修饰的MagPlex磁珠；所述液相基因芯片检测系统是美国Luminex公司的MAGPIX或Luminex 100/200液相悬浮芯片系统。
3.如权利要求1所述的一种液相基因芯片检测方法，其特征在于，所述用于与所述微珠偶联的功能基团是Aminolink C6～18。
4.如权利要求1所述的一种液相基因芯片检测方法，其特征在于，所述分子信标5’端连接荧光基团，3’端连接淬灭基团，所述荧光基团是可以激发绿色荧光的荧光素，所述淬灭基团是DABCYL。
5.如权利要求4所述的一种液相基因芯片检测方法，其特征在于，所述可以激发绿色荧光的荧光素是CY3。
6.如权利要求1所述的一种液相基因芯片检测方法，其特征在于，所述分子信标的环状区具有长度为15～20个碱基的序列，茎干区具有5～8个碱基的互补序列；所述第二引物5’端含有一段所述报告分子的序列，是含有所述分子信标的环状区的相同序列。
7.如权利要求1所述的一种液相基因芯片检测方法，其特征在于，所述液相基因芯片检测方法应用于核酸定性检测，或应用于基因分型检测。
8.一种液相基因芯片检测方法所用的试剂盒，其特征在于，包括：微珠-核酸偶联物以及第二引物和报告分子，所述微珠-核酸偶联物是微珠-第一引物偶联物，所述第一引物是5'-NH2-(CH2)12-TGGTGTGGGCCATAATTCAATT-3'；所述第二引物是5'-AAGGTTGATTGTATTTGGGATCTGCCATTGTCAGA-3'；所述报告分子是分子信标，所述分子信标是5'CY3-GCGAGAAGGTTGATTGTATTCTCGC-3'DABCYL。
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