CN102220417A

CN102220417A - 基于磁原位扩增的电化学发光基因传感器检测食品致病菌的方法

Info

Publication number: CN102220417A
Application number: CN2011101006035A
Authority: CN
Inventors: 邢达; 朱啸
Original assignee: South China Normal University
Current assignee: South China Normal University
Priority date: 2011-04-21
Filing date: 2011-04-21
Publication date: 2011-10-19
Anticipated expiration: 2031-04-21
Also published as: CN102220417B

Abstract

本发明公开了基于磁原位扩增的电化学发光基因传感器检测食品致病菌的方法。首先根据食品致病菌的高保守性DNA序列作为检测目的片段，设计三条PCR引物，然后由引物1制备得到磁性引物，由引物2制备得到TBR引物，引物3为普通的PCR引物，当检测体系里存在目标基因片段时，随着PCR过程的进行，磁性引物会发生扩增，磁性粒子上便直接带有三联吡啶钌分子修饰的双链核酸产物。当没有目的基因片段存在下，磁性引物不会发生扩增，因而不会出现带有信号分子的产物。之后再通过磁分离和原位的电化学发光检测手段，此方法实现了快速，高灵敏，安全，特异的检测目的基因片段的目的，很适合在实际检测的过程中得到推广。

Description

基于磁原位扩增的电化学发光基因传感器检测食品致病菌的方法

技术领域

本发明属于电化学发光基因检测技术领域，特别涉及一种基于磁原位扩增的电化学发光基因传感器检测食品致病菌的方法。

背景技术

食源性致病菌作为一个严重的公共卫生问题是影响食品安全的主要原因之一。它严重危害人们的生命健康并造成重大经济损失。据世界卫生组织2002年3月公布的信息表明，全球每年发生食源性疾病达到数十亿例，全球每年因食源性致病菌污染引起的腹泻而死亡的儿童约170万。我国每年报告的食源性疾病病例约2-4万人，但据专家估计这一数字尚不到实际数字10％。2008年的广东省卫生厅的数据也显示，省内食物中毒死亡人数为884人，其中细菌性污染引起的食物中毒死亡占60.97％。我国的外贸出口也因为食品安全问题而面临严峻的外部环境。特别需要引起重视的是进口国，用贸易技术壁垒限制中国产品出口，保护其本国产业的趋势越来越明显。发展一种快速，灵敏，特异，安全的检测食源性致病菌的方法一直是研究的热点。综合传统的食源性的致病菌的检测方法，主要有基因检测方法，免疫学检测方法，涂平板检测法，以及电子显微镜观察法。相对于基因水平的检测方式，这些方法往往有着特异性不高，灵敏度低，耗时长，仪器昂贵的缺点。

目前，常规的基因检测手段包括有聚合酶链式反应(PCR)-电泳方法，分子灯塔技术，荧光能量传递技术(Taqman探针技术，LightCycler探针技术，Amlisensors探针技术，复合探针技术)。这些方法却存在各自的不足，如性噪比不高，荧光背景干扰，需要使用有毒的物质，步骤繁琐等。

发明内容

为了克服现有的方法存在的不足，本发明的目的在于提供一种基于磁原位PCR与电化学发光检测技术结合的快速、高灵敏度、准确、操作简便的食品致病菌分析方法。该技术通过针对靶基因设计三条PCR功能引物。当存在检测的目的基因片段时，借助磁性粒子表面上的引物(即磁性引物)的扩增，生成的带有三联吡啶钌(Ru(bpy)₃ ²⁺，即TBR)信号分子标记的产物会直接被富集在磁性粒子的表面；而不含目的片段时，磁性引物不会发生扩增，磁性粒子的表面并不会带有三联吡啶钌信号分子；而后借助原位的电化学发光检测装置进行检测，通过电化学发光值的强弱即可判断目的基因片段的有无。

本发明的目的通过以下技术方案实现，基于磁原位扩增的电化学发光基因传感器检测食品致病菌的方法，具体包括以下步骤：

基于磁原位扩增的电化学发光基因传感器检测食品致病菌的方法，其特征在于具体包括以下步骤：

(1)设计引物：根据食品致病菌的保守序列进行设计，每种食品致病菌的检测引物为3条，分别命名为引物1、引物2和引物3，其中：

引物1的5’端修饰有功能基团和连接子，连接子为不影响PCR反应特异性的随机DNA序列；

引物2的5’端修饰有功能基团；

引物3为普通的PCR引物；

(2)制备磁性引物和TBR引物：引物1通过其功能基团与功能化的磁性粒子上的功能基团反应，得到磁性引物；引物2通过其功能基团与活化的三联吡啶钌进行反应，得到TBR引物；

(3)PCR反应：模板为待测样品DNA，引物为引物3以及步骤(2)制备的磁性引物和TBR引物；

(4)分离纯化：将步骤(3)所得的PCR产物进行分离纯化，得到带有三联吡啶钌的PCR产物的磁性粒子；

(5)检测：在带有三联吡啶钌的PCR产物的磁性粒子中加入分析液，电化学发光检测仪器检测带有三联吡啶钌的PCR产物的磁性粒子的电化学发光信号即ECL信号，ECL信号值高于阈值即表明样品中含有食品致病菌，根据引物的种类即可判断样品中的食品致病菌的种类。由于避免了电极修饰等步骤，样品池实现反复利用，可以快速的进行下一组样品的检测。

步骤(1)中所述的食品致病菌的保守序列优选为食品致病菌的16S-23S启动子间基因片段或某一细菌的毒力基因片段，如单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)表达溶素O的基因(HlyA)，沙门氏杆菌(Salmonella enterica)的侵袭基因A(invA)；

引物1中所述的功能基团优选为氨基、羧基、磷酸基、生物素、链霉亲和素、羟基或巯基；

引物2中所述的功能基团优选为氨基；

引物3为核苷酸序列，其与引物2预扩增得到的片段包含或相同于引物1与引物2扩增得到的片段；

步骤(1)中所述的食品致病菌为单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)时，针对其16S-23S启动子间基因片段所设计的三条PCR引物分别是；

引物1为5’-NH2-(CH₂)₆-TTTTTTTTGGCCTATAGCTCAGCTGGTTAGA-3’，TTTTTTTT为降低磁性引物空间位阻效应的聚胸腺嘧啶的链接子(poly-thymine linker)，

引物2为5’-NH₂-(CH₂)₆-GCTGAGCTAAGGCCCCGTAAA-3’，

引物3为5’-GGCCTATAGCTCAGCTGGTTAGA-3’；

步骤(2)中所述功能化的磁性粒子中的功能基团优选为氨基、羧基或巯基；其功能基团是能与引物1上的功能基团进行反应；

步骤(2)中所述功能化的磁性粒子粒径为20nm-10μm；

步骤(2)中所述的磁性引物的具体制备方法如下：将引物1与处理后的功能化的磁性粒子在连接反应液中孵育，纯化，清洗，得到磁性引物；

所述功能化的磁性粒子的处理步骤优选为先用0.01M氢氧化钠溶液清洗，然后用去离子水冲洗；

所述的连接反应液的各组分及各组成在体系中的终浓度如下所示：2-吗啉乙磺酸(MES)0.1M，吐温-20体积的分比0.25％，碳二亚胺盐酸盐(EDC)10mM，pH值为5.0；

所述的孵育的条件优选为室温条件反应3小时；

所述的纯化优选通过磁性分离笔分离磁性引物，如Bio-Nobile牌的Pickpen；

所述的清洗的溶液如下：10mM，pH7.4的PBS中加入吐温-20，吐温-20的终浓度为体积百分比0.25％；

步骤(2)中所述的TBR引物的具体制备方法如下：将引物2与三联吡啶钌的N-羟基琥珀酰亚胺脂(TBR-NHS ester)按摩尔比1∶2～1∶3在碱性条件下避光孵育，以使引物2中的功能基团和TBR-NHS ester进行连接反应，得到TBR引物，洗涤并沉淀标记TBR引物，最后用纯水再次溶解TBR引物。

所述的孵育的条件为10～60℃，3小时；

所述的洗涤的溶液优选为体积比70％-100％的乙醇溶液。

步骤(3)中所述的磁性引物的质量与PCR缓冲液的体积比为0.2μg/μL，引物3的物质的量是TBR引物物质的量的5％；

PCR反应缓冲液为与所用Taq酶相配的缓冲液，另外加入如下物质以及如下物质在PCR反应缓冲液中的终浓度为：TritonX-100体积百分比0.1％，Tween-20体积百分比0.5％，牛血清蛋白(BSA)质量百分比0.05％；

步骤(3)中所述的PCR反应的条件优选为93℃ 2分钟；93℃ 10秒，56℃15秒，72℃ 15秒，45个循环，72℃后延伸2分钟。

步骤(4)中所述的分离纯化优选通过磁性分离笔进行分离，使用的纯化缓冲液为如下：10mM，pH7.4的PBS中含有终浓度为体积百分比0.25％的吐温-20。

步骤(5)中所述的分析液的组成如下：112mM KH₂PO₄，88mMK₂HPO₄·3H₂O，50μM NaCl，6.5mM NaN₃，0.8μM Tirton X-100，0.4mMTween-20，100mM TPA；

步骤(5)中所述的检测条件为电压1.25V；

所用电化学发光检测仪器(见本申请人在先申请，申请号：02227608.4，发明名称：电化学发光检测仪，见图2)包括样品池、恒电位仪2、光纤3、光电倍增管4、模数转换器5、微型计算机6和数据处理软件；其中样品池1由进样管1-1、对电极1-2、工作电极1-3、参比电极1-4、出样管1-5组成。样品池可以用清洗液反复清洗。所述的计算机数据采集软件，如：National Instruments公司开发的LabVIEW软件。所述的光电倍增管，如PerkinElmer公司研制的光电倍增管系列。

所述步骤(2)中设计三条PCR引物序列应注意下列问题：1、考虑到在磁性粒子上扩增，磁性引物与较大基因组片段退火结合会有一定的位阻效应，从而降低扩增效率，在引物1的5’端设计连接子序列，降低磁性引物1空间位阻效应；2、引入普通PCR引物3作为助引物，可以在扩增的最初阶段，与TBR引物2在液相环境中首先预扩增出一定量的较小的DNA片段(一般小于200bp)，磁性引物1可以更容易与预扩增的小DNA片段退火结合，从而提高磁性引物1的扩增效率，增强了检测灵敏度；3、为了防止过多的扩增反应发生在液相环境的TBR引物2和引物3之间，而没有使磁性引物1发生扩增，引物3的物质的量是TBR引物物质的量的5％。

本发明的基本原理为(如图1所示)：

电化学发光方法由于极其高的灵敏度近年来在生物传感器领域得到了迅速的发展。电化学发光结合磁原位检测平台可导致检测灵敏度更高、检测过程更加简单快速，并且有将操作过程实现自动化的潜能。

本方法针对大多数食品致病菌都包含有自己特征基因序列，设计三条特异性的PCR功能引物，在一定条件下扩增这些特征片段，使用电化学发光检测的手段即可达到灵敏，快速，特异的检测样品中食品致病菌的目的。这三条引物包括：引物1在5’端修饰有功能基团并具有不影响PCR反应特异性的随机DNA序列，引物1与修饰后的磁性粒子通过化学反应后稳定连接在磁性粒子上，得到高效的磁性引物，引物2在5’端修饰有功能基团，与活化的三联吡啶钌进行键合制备得到三联吡啶钌标记的高效的TBR引物，引物3为普通的PCR引物，作为助引物，帮助提高PCR的效率，可以在扩增的最初阶段，与反向TBR引物2在液相环境中首先预扩增出一定量的较小的DNA片段，降低磁性引物1的空间位阻效应，使其更容易与预扩增的小DNA片段退火结合，从而提高磁性引物1的扩增效率。当检测体系存在目的基因片段时，借助磁性引物的扩增，生成的带有TBR分子标记的产物会直接被富集在磁性粒子的表面；而不含目的片段时，磁性引物不会发生扩增，磁性粒子的表面并不会带有TBR信号分子。而后借助原位的电化学发光检测装置进行检测，即在一定电压条件下，三联吡啶钌/三丙胺能够在电极表面发生电化学反应并发出光子，光子经过光纤收集到光电倍增管中，然后将其转化为电信号，经过模式转换器转化为数字信号，经计算机采集处理。通过判断电化学发光强度来检测转基因的有无。

本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：

(1)利用磁性引物的扩增，有机的将原位PCR的过程与可靠的电化学化学检测手段结合起来。

(2)由于本发明所使用的PCR扩增和电化学发光检测技术的效率都很高，并且采取了原位富集的检测平台，所以测量的灵敏度很高。

(3)本发明避免了传统PCR过程完成后，还需要利用耗时的电泳检测等手段，将扩增与之后的富集过程同时在磁性粒子完成，检测过程更加简单，快速。

(4)本发明操作方法安全，没有溴化己锭、同位素等有害物质的使用。

(5)本发明所利用的检测装置简单，投资少，实现容易，操作简便。由于采用原位检测技术，本方法有望实现自动化。

附图说明

图1为基于原位扩增的电化学发光基因传感器检测食品致病菌的原理图。

图2为本发明原位电化学发光检测仪器的装置示意图。

图3为本发明及装置可行性验证的电化学发光信号图。

图4为本发明对单增李斯特菌检测灵敏度电化学发光结果图。

图5为本发明针对单增李斯特菌检测的特异性的电化学发光结果图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

将本发明的方法应用于单增李斯特菌检测。如图1所示为基于原位扩增的电化学发光基因传感器检测食品致病菌的原理图。

实施例一

(1)按照常规方法，使用TIANamp Bacteria DNA Kit试剂盒提取牛奶样品中的DNA；

(2)取1mg粒径100nm的表面修饰有羧基的磁性粒子，用200μL，0.01M的氢氧化钠溶液在室温条件下清洗2遍，然后用去离子水冲洗一次。

(3)往洗涤干净后的磁性粒子中加入已设计的一条高特异性的5’端具有氨基修饰引物1(序列见表1)2nmol和100μL pH5.0的连接反应液(0.1M 2-吗啉乙磺酸(MES)，0.25％吐温-20，10mM碳二亚胺盐酸盐(EDC))在室温中共孵育5小时，混匀器轻微摇动。

(4)反应完成后，使用磁分离笔将制备的磁性引物分离出来，并使用冲洗缓冲液(1倍标准的10mM，pH7.4的PBS，0.25％吐温-20)清洗两次。最后将合成的磁性引物置于4℃的100μL保存缓冲液中(宝生物公司1倍PCR标准缓冲液，另加入0.25％吐温-20，和0.5％的BSA)，备用。

(5)将已设计的带有5’氨基修饰的引物2(序列见表1)与过量的三联吡啶钌的N-羟基琥珀酰亚胺脂(TBR-NHS ester)在碱性条件下10-60℃避光孵育3小时，以使氨基基团和TBR-NHS ester进行连接反应，得到TBR引物，随后，用体积比70％-100％的乙醇溶液洗涤并沉淀标记产物，最后用纯水再次溶解TBR引物，4℃保存，标记TBR引物，标记过程可参考文献(Analytical Chemistry，81(1)，255-261)。

(6)将提取的DNA 100ng和已设计的三条引物、PCR反应缓冲液及其他常规PCR反应物加入反应器，进行聚合酶链式反应。反应具体参数为：在100μL的Ex Taq PCR缓冲液反应体系里包含有20μg的磁性引物1，TBR引物为400nM，助引物3为20nM，宝生物Ex Taq(5U)，0.1％ TritonX-100，0.5％Tween-20，0.05％BSA，dNTP(每种0.1mM)and 100ng基因组，扩增条件为：93℃ 2分钟；93℃ 10秒，56℃ 15秒，72℃ 15秒，45个循环；72℃后延伸2分钟。

(7)用磁分离笔将扩增后的磁性粒子分离出来，使用分离缓冲液(1倍标准PBS，体积比0.25％吐温-20)冲洗2次。

(8)将步骤(7)中得到的磁性粒子转入到电化学发光检测仪器(见本申请人在先申请，申请号：02227608.4，发明名称：电化学发光检测仪，见图2)检测样品池中，进行电化学发光的检测。

(9)对于电化学发光检测，样品池中加入100μL ECL反应液，给定电压1.25V，打开光电倍增管，实施测量。

(10)比较样品检测的信号与阴性样品的信号，当样品信号大于阈值(即3组或以上的阴性对照样品的平均光信号值加上其3倍标准偏差)时可判断样品为被单增李斯特菌污染的样品。

表1 实施例中所用到的引物的序列

如图3所示，是本实施例测得的电化学发光信号图，由图3可知在没有目的基因片段时(a.ECL分析液本底；b.阴性对照)，都只有很低的电化学发光信号值，阴性对照平均值为230光子/秒(cps)，但当检测体系中存在单增李斯特菌基因组时，电化学发光值有了很大提高，平均值为1768cps，所以此样品存在单增李斯特菌的污染问题。

实施例二单增李斯特菌检测灵敏度实验

分别取10⁵pg、10⁴pg、10³pg、10²pg、50pg、10pg单增李斯特菌(Listeria monocytogenes，CMCC54007)基因组，按照实施例一所述方法测得电化学信号值如图4所示，由图4可知当单增李斯特菌目的基因组片段浓度等于0.5pg/ul时，电化学发光信号依然大于阈值299cps(3组阴性样品的发光平均值为230cps，样品间3倍标准偏差为66cps)，因此可以判断本发明检测目的基因具有非常好的灵敏度。

实施例三单增李斯特菌检测特异性的电化学发光验证实验

分别取100ng单增李斯特菌(Listeria monocytogenes，CMCC54007)基因组，100ng大肠杆菌(E.coli O157：H7，GW1.2020)基因组，100ng沙门氏菌(Salmonella enterica，CMCC50040)基因组，按照实施例一所述方法测得电化学信号值如图5所示，由图5可知，当样品中分别存在相同质量浓度的大肠杆菌、沙门氏菌和单增李斯特菌基因组时，只有存在目的基因组时，才会得到较高的电化学发光信号，由此可判断本发明的方法检测单增李斯特菌具有非常好的特异性。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110>华南师范大学

<120>基于磁原位扩增的电化学发光基因传感器检测食品致病菌的方法

<130>1

<160>3

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>31

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>引物1

<220>

<221>5′端修饰基团为NH₂-(CH₂)₆

<222>(1)..(1)

<400>1

ttttttttgg cctatagctc agctggttag a 31

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>引物2

<220>

<221>5′端修饰基团为NH₂-(CH₂)₆

<222>(1)..(1)

<400>2

gctgagctaa ggccccgtaa a 21

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>引物3

<400>3

gctgagctaa ggccccgtaa a 21

Claims

1.一种基于磁原位扩增的电化学发光基因传感器检测食品致病菌的方法，其特征在于包括以下步骤：

引物2的5’端修饰有功能基团；

(5)检测：在带有三联吡啶钌的PCR产物的磁性粒子中加入分析液，电化学发光检测仪器检测带有三联吡啶钌的PCR产物的磁性粒子的ECL信号，ECL信号值高于阈值即表明样品中含有食品致病菌，根据引物的种类即可判断样品中的食品致病菌的种类。

2.根据权利要求1所述的基于磁原位扩增的电化学发光基因传感器检测食品致病菌的方法，其特征在于：

引物1中所述的功能基团为氨基、羧基、磷酸基、生物素、链霉亲和素、羟基或巯基；

引物2中所述的功能基团为氨基。

3.根据权利要求1所述的基于磁原位扩增的电化学发光基因传感器检测食品致病菌的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的食品致病菌的保守序列为食品致病菌的16S-23S启动子间基因片段或食品致病菌的毒力基因片段。

4.根据权利要求3所述一种基于磁原位扩增的电化学发光基因传感器检测食品致病菌的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的食品致病菌为单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)时，针对其16S-23S启动子间基因片段所设计的三条PCR引物分别是；

引物1为5’-NH₂-(CH₂)₆-TTTTTTTTGGCCTATAGCTCAGCTGGTTAGA-3’，

引物2为5’-NH₂-(CH₂)₆-GCTGAGCTAAGGCCCCGTAAA-3’，

引物3为5’-GGCCTATAGCTCAGCTGGTTAGA-3’。

5.根据权利要求1所述一种基于磁原位扩增的电化学发光基因传感器检测食品致病菌的方法，其特征在于：

步骤(2)中所述功能化的磁性粒子中的功能基团为氨基、羧基或巯基，其功能基团是能与引物1上的功能基团进行反应；

步骤(2)中所述功能化的磁性粒子粒径为20nm-10μm；

步骤(2)中所述的TBR引物的具体制备方法如下：将引物2与TBR-NHS ester按摩尔比1∶2～1∶3在碱性条件下避光孵育，得到TBR引物，洗涤，沉淀标记TBR引物，用纯水溶解TBR引物。

6.根据权利要求5所述一种基于磁原位扩增的电化学发光基因传感器检测食品致病菌的方法，其特征在于：

步骤(2)中所述的磁性引物的具体制备方法中：

所述的处理的步骤为：先用0.01M氢氧化钠溶液清洗功能化的磁性粒子，再用去离子水冲洗；

所述的连接反应液的各组分及各组成在体系中的终浓度如下所示：2-吗啉乙磺酸0.1M，吐温-20体积百分比0.25％，碳二亚胺盐酸盐10mM，pH值为5.0；

所述的孵育的条件为室温条件反应3小时；

所述的纯化通过磁性分离笔分离磁性引物；

所述的清洗的溶液如下：在10mM，pH7.4的PBS中加入吐温-20，吐温-20的终浓度为体积百分比0.25％。

7.根据权利要求5所述一种基于磁原位扩增的电化学发光基因传感器检测食品致病菌的方法，其特征在于：

步骤(2)中所述的TBR引物的具体制备方法中：

所述的孵育条件为10～60℃，3小时；

所述的洗涤的溶液为体积比70％-100％的乙醇溶液。

8.根据权利要求1所述一种基于磁原位扩增的电化学发光基因传感器检测食品致病菌的方法，其特征在于：步骤(3)中所述的磁性引物的质量与PCR缓冲液的体积比为0.2μg/μL，引物3的物质的量是TBR引物物质的量的5％；

步骤(3)中所述的PCR反应缓冲液为与所用Taq酶相配的缓冲液，另外加入如下物质以及如下物质在PCR反应缓冲液中的终浓度为：TritonX-100体积百分比0.1％，Tween-20体积百分比0.5％，牛血清蛋白质量百分比0.05％；

步骤(3)中所述的PCR反应的条件为93℃ 2分钟；93℃ 10秒，56℃ 15秒，72℃ 15秒，45个循环；72℃后延伸2分钟。

9.根据权利要求1所述一种基于磁原位扩增的电化学发光基因传感器检测食品致病菌的方法，其特征在于：步骤(4)中所述的分离纯化通过磁性分离笔进行分离，使用的纯化缓冲液为如下：10mM、pH7.4的PBS中含有终浓度为体积百分比0.25％的吐温-20。

10.根据权利要求1所述一种基于磁原位扩增的电化学发光基因传感器检测食品致病菌的方法，其特征在于：步骤(5)中所述的分析液的组成如下：112mM KH₂PO₄，88mM K₂HPO₄·3H₂O，50μM NaCl，6.5mM NaN3，0.8μM Tirton X-100，0.4mM Tween-20，100mM TPA；

步骤(5)中所述的检测条件为电压1.25V。