CN107475454A - 基于电化学发光放大原理的寨卡病毒核酸检测方法 - Google Patents

基于电化学发光放大原理的寨卡病毒核酸检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种基于电化学发光放大原理的寨卡病毒核酸检测方法，属于寨卡病毒分子诊断技术领域。本发明分别提出了基于线性及树状三联吡啶钌聚合物电化学发光放大方法的寨卡病毒核酸检测方法。该方法具有如下优点：1)灵敏度高；2)探针稳定：线性及树状三联吡啶钌聚合物作为探针的电化学发光放大部分，性能稳定、聚合度及发光强度均一；3)检测过程简单、快速：经过简单的样品前处理及核酸提取过程即可进行寨卡病毒检测、耗时短，省去了扩增步骤，检测快速；4)成本低。本发明为寨卡病毒核酸检测技术体系，提供了新型基于电化学发光方法技术的分子诊断方法，有效的弥补了现有寨卡病毒检测技术单一，提供了无需扩增的寨卡病毒检测方法。

Description

基于电化学发光放大原理的寨卡病毒核酸检测方法
技术领域
本发明属于寨卡病毒分子诊断技术领域，特别涉及一种基于电化学发光放大原理的寨卡病毒核酸检测方法。
背景技术
寨卡病毒(Zika virus)，隶属于黄病毒科，为单正链RNA病毒。最早分离于乌干达维多利亚湖附近的寨卡森林中一只发热的恒河猴(1947年)，其主要通过蚊媒途径传播。2015年，寨卡病毒在巴西大面积爆发，造成150万人感染，以及4000多例小脑畸形的新生儿，截至2017年3月10日，全球84个国家都出现寨卡病毒感染案例。寨卡病毒感染后，患者多为流感样表现，一般能自愈，少数患者出现格林－巴利综合征，孕妇感染寨卡病毒和新生儿小头畸形有关，因此，开发新型寨卡病毒分子诊断新方法，对于降低寨卡病毒感染的危害具有重要意义，可有效预防新生儿小头畸形。
目前，寨卡病毒感染的诊断方法包括病原学诊断和血清学诊断。传统的病原学诊断方法是通过病毒的分离和培养来达到检测的目的，现主要通过反转录PCR(RT-PCR)或反转录－实时荧光定量PCR检测病毒核酸；血清学诊断方法包括酶联免疫吸附试验(ELISA)检测病毒特异性IgM抗体，和空斑减少中和试验(PRNT)检测病毒特异性中和抗体。然后，以上方法分别存在着耗时长、检测过程繁琐、价格昂贵以及抗体检测存在的时效性和交叉反应较强等缺点，都无法实现简单、快速的寨卡病毒的检测模式。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种基于电化学发光放大原理的寨卡病毒核酸检测方法。
发明人前期构建了基于聚合物电化学发光信号放大的核酸检测方法(ZL.201310721893.4)。本发明在前期研究基础上，分别提出了基于线性及树状三联吡啶钌聚合物电化学发光放大方法的寨卡病毒核酸检测方法，具有灵敏度高、简单快速、成本低等优点。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种基于线性及树状三联吡啶钌聚合物电化学发光放大方法的寨卡病毒核酸检测方法，且该方法用于非诊断目的，其主要包括以下步骤：
(1)寨卡病毒核酸提取
①收集一定的组织或者细胞样本，组织及细胞样品需为感染寨卡病毒的样品，单次提取组织重量在0.1g以下为宜，细胞样品单个样品不能超过107个细胞，避免样品数量过多导致细胞裂解无效；
②样本前处理：
a.组织样品
将组织在液氮中磨成粉末，加入sample protector 1mL，使用振荡器震荡3～5次(每次1～2秒)，静止30分钟，除尽细胞中的RNA酶，离心30分钟，除去上清；
b.单层贴壁细胞样品
除去培养板中的液体培养基，往培养板中加入胰酶，消化细胞1min，加入培养基终止消化，离心收集细胞并弃上清，加入sample protector 1mL，使用振荡器震荡3～5次(每次1～2秒)，静止30分钟，除尽细胞中的RNA酶；
c.悬浮培养细胞样品
直接离心收集细胞，弃上清，加入sample protector 1mL，使用振荡器震荡3～5次(每次1～2秒)，静止30分钟，除尽细胞中的RNA酶；
③往步骤②所得细胞中加入TRIzol裂解细胞：
a.组织样品
每50～100mg组织加入1mL TRIzol，样品体积不应超过TRIzol体积10％，室温放置6～10min；
b.细胞样品
每5～10×106细胞样品中加入1mL TRIzol，反复吸打，室温放置6～10min；
④往步骤③所得混合物加入氯仿。每使用1mL TRIzol加入0.2mL氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟；
⑤将步骤④所得的混合物4℃、12 000rpm离心10～15min，样品分成三层：红色的有机相，中间蛋白层和上层无色的水相，RNA主要在上层水相中；
⑥将步骤⑤离心所得物的上层水相转移到新管中；
⑦往步骤⑥所得溶液加入异丙醇，每使用1mL TRIzol加入0.5mL异丙醇，颠倒混匀，室温放置10分钟；
⑧将步骤⑦所得混合物2～8℃、12000×g离心10分钟，弃去上清；
⑨往步骤⑧所得沉淀物中加入75％乙醇，颠倒充分混匀，每使用1mL TRIzol至少加1mL 75％乙醇；
⑩将步骤⑨所得混合物2～8℃、7500×g离心5分钟，弃上清；
所得沉淀物室温放置5～10分钟，当沉淀变透明加入25～200μL DEPC水，震荡涡旋,使RNA充分溶解，-80℃低温保存；
(2)电化学发光信号放大探针的构建
本发明的电化学发光信号放大探针分别用线性、树状三联吡啶钌聚合物(聚合度为10至100为佳，可根据实际用途调整，优选为100)作为信号放大基团，并连接DNA识别域(5'-TCTGGTTCTTTCCTGGGCCT-3')，最终完成电化学发光信号放大探针的构建，其主要包含以下步骤：
①分别取10μM的线性、树状三联吡啶钌聚合物，加入DNA识别域(浓度为100μM)，并在37℃环境下孵育过夜(12小时)，完成信号放大基团与DNA识别域的连接。
所述的线性、树状三联吡啶钌聚合物与DNA识别域的分子数比为1：(1～50)，优选为1:50。
②取50K道尔顿(Da)的超滤管，将步骤①所得的初产物移至超滤管，5000转/分钟冷冻离心5分钟，直至超滤管中液体离心至下层。
③向步骤②中超滤管加入500μL PBS缓冲液(1×)，5000转/分钟冷冻离心5分钟，直至超滤管中液体离心至下层。重复操作3次，将游离的DNA识别域离心至下层。
④用200μL的超纯水溶解上层中的电化学发光信号放大探针，反复冲洗上层管底部，充分溶解探针。
⑤取步骤④所得产物置于-20℃，并经过冷冻干燥(6小时)，得到固体产物，即电化学发光信号放大探针，并储存于-20备用。
(3)寨卡病毒核酸检测
本发明寨卡病毒检测模式采用电化学发光技术为信号给出方式，将电化学发光信号放大探针作为本发明有效的检测模式，为其高灵敏度性能提供坚实的基础。寨卡病毒核酸检测原理图如图1所示，其主要由以下步骤构成：
①取步骤(1)塞卡病毒核酸提取样品1μL，加入44.5μL超纯水中，并加入2.5μL磷酸盐缓冲液(PBS，20×)，涡旋震荡。
②向步骤①所得混合物中加入电化学发光信号放大探针1μL(标记电化学发光聚合物，浓度为0.25μM)，涡旋震荡，并在37℃情况下孵育15分钟，使电化学发光信号放大探针与目标寨卡病毒核酸充分杂交。
③向步骤②体系中加入1μL捕捉探针(5'-TATCTCCATTCCATACCAAC-3')(5'端标记生物素，浓度为0.25μM)，涡旋震荡，并在37℃情况下孵育15分钟，使捕捉探针与核酸充分杂交。
④向步骤③体系中加入过量(10μL)的链霉亲和素磁珠(浓度1mg/mL)，充分涡旋混匀后，在37℃情况下孵育10分钟。
⑤将步骤④所得产物用磁分离器分离，并用PBS缓冲液(1×)清洗，重复三次。
⑥将步骤⑤所得产物用超纯水混匀，并用最终用电化学发光仪器检测信号。
所述的线性三联吡啶钌聚合物的合成过程，包括如下步骤：
(1)三联吡啶钌-赖氨酸单体合成
三联吡啶钌-聚赖氨酸单体的合成由羧基活化的三联吡啶钌和单一氨基保护的赖氨酸通过酰胺键形成稳定连接而实现。羧基活化三联吡啶钌和单一氨基保护的聚赖氨酸分子数比优选为1:1，反应条件优选37℃过夜搅拌(12h)。
(2)固相合成起始
1)三联吡啶钌-赖氨酸单体硫醇化
①三联吡啶钌-赖氨酸单体羧基活化：
三联吡啶钌-赖氨酸和NHS保持一定的分子数比，在EDC存在的催化下，60℃搅拌孵育1h。
②羧基活化三联吡啶钌-赖氨酸单体与氨基乙硫醇连接：
羧基活化三联吡啶钌-赖氨酸单体与氨基乙硫醇间连接通过酰胺键的形成而实现，二者优选分子数比为1:1。
步骤①中所述的三联吡啶钌-赖氨酸单体与NHS的最优分子数比为1:10到1:100之间，优选1:100。
2)线性三联吡啶钌聚合物链端的固定
线性三联吡啶钌链端的固定采用金-硫键连接，将硫醇化的三联吡啶钌-赖氨酸单体和金基质玻璃片连接，从而使后续的延伸、合成终止及纯化过程的清洗步骤得以简化。
(3)固相合成延伸
固相合成的延伸以线性三联吡啶钌聚合物的链端固定为起始，通过程序化控制，使三联吡啶钌-聚赖氨酸单体逐个添加并延长线性链。主要过程包括如下步骤：
1)氨基去保护
本发明所采用的三联吡啶钌-聚赖氨酸单体的链端被Boc氨基保护，能够定点打开和封闭，从而实现精确的分子间连接。向金基质固相固定体系加入TFA溶液，搅拌反应五分钟后，用双蒸水清洗。
2)酰胺键链接
由步骤1)所得氨基去保护末端，可与三联吡啶钌-聚赖氨酸单体通过酰胺键实现连接。三联吡啶钌-聚赖氨酸单体活化的羧基末端通过脱水缩合，最终实现酰胺键连接。完成上述步骤即可增加一个单体，循环往复上述两个步骤，步骤1)和步骤2)，即可得到长链线性三联吡啶钌聚合物，通过控制循环次数即可得到聚合度一致的产物。每循环n次即可得到聚合度为n+1的线性三联吡啶钌聚合物产物。
(4)固相合成终止
本发明提供了一种可控的线性三联吡啶钌聚合物合成方法，可根据实际需求设定固相合成延伸循环次数，在完成设定的循环数后，为了使反应终止，需向反应体系中加入TFA溶液，使末端Boc脱落，从而提升其溶解性。并最终通过谷胱甘肽(还原性)与金基质玻璃片作用，使线性三联吡啶钌聚合物脱落，最后收集液态产物。
(5)产品纯化
步骤(4)所得液态产物，通过超滤管离心过滤，聚合物产物将聚集于过滤膜上层，通过双蒸水清洗即可得到较纯的反应产物。最后，将所得产物存放于-20℃过夜，使其冻结，并经过冷冻干燥过程处理(6小时)，即可得到干粉状的线性三联吡啶钌聚合物产物，从而使其能够长期保存。并可根据实际需求称取溶解得到水溶液。
所述的树状三联吡啶钌聚合物合成过程，包括如下步骤：
树状三联吡啶钌聚合物的合成通过改变赖氨酸单体Boc保护位点，将所有氨基基团都保护起来，再通过时序性的去保护，逐个添加单体。其主要包括以下步骤：
1)赖氨酸单体氨基保护及羧基活化
取相同浓度的(Boc)2O与赖氨酸单体以1:1体积比混匀，60℃加热10min即完成反应，后经过NHS活化羧基，使其和氨基乙硫醇连接，得到硫醇化的赖氨酸单体，为后续的金基质固定提供连接位点。
其中NHS的活化和前文中的活化步骤相同，赖氨酸单体和NHS分子的最优分子数比优选1:100，并可在1：10到1:100的范围内调整。
2)树状三联吡啶钌聚合物链端的固定
树状三联吡啶钌聚合物的固定采用金-硫键连接，将硫醇化的赖氨酸单体和金基质玻璃片连接，从而使后续的延伸、合成终止及纯化过程的清洗步骤得以简化。
3)树状三联吡啶钌聚合物延伸
树状三联吡啶钌聚合物的延伸通过氨基去保护至酰胺键形成及氨基去保护再到酰胺键形成的循环过程，每完成一个循环即可增加一个赖氨酸单体。本发明所采用的赖氨酸单体的链端被Boc氨基保护，能够定点打开和封闭，从而实现精确的分子间连接。通过控制循环次数即得到聚合度一致的产物；每循环n次即可得到聚合度为n+1的树状的聚赖氨酸聚合物产物。向金基质固相固定体系加入TFA溶液，搅拌反应五分钟后，用双蒸水清洗。
4)固相合成终止
本发明提供了一种可控的树状三联吡啶钌聚合物合成方法，可根据实际需求设定固相合成延伸循环次数，在完成设定的循环数后，为了使反应终止，需向反应体系中加入TFA溶液，使末端Boc脱落，从而提升其溶解性。并最终通过谷胱甘肽(还原性)与金基质玻璃片作用，使树状的聚赖氨酸聚合物脱落，并最终收集液态产物。
5)连接活化三联吡啶钌分子
将活化三联吡啶钌分子与树状聚赖氨酸聚合物按1:1000的分子数比混匀，在硼酸钠缓冲液(pH>8.5)中完成三联吡啶钌与树状聚赖氨酸聚合物间的连接，反应条件优选为37℃避光孵育12小时(过夜)。
6)产品纯化
步骤5)所得液态产物，通过超滤管离心过滤，聚合物产物将聚集于过滤膜上层，通过双蒸水清洗即可得到较纯的反应产物。最后，将所得产物存放于-20℃过夜，使其冻结，并经过冷冻干燥过程处理(6小时)，即可得到干粉状的树状三联吡啶钌聚合物产物，从而使其能够长期保存。并可根据实际需求称取溶解得到水溶液。
所述的金基质玻璃片的制备过程，包括如下步骤：
1)正电荷载玻片清洗
①取干净的正电荷载玻片先用1mL丙酮浸洗1～3分钟取出；
②用1mL异丙醇冲洗，后浸入1mL的异丙醇溶液中处理1～3分钟；
③取出载玻片并用1mL甲醇清洗，后浸入1mL的甲醇中处理1～3分钟；
2)Au3+吸附及晶体种子生成
①取3mM的HAuCl4溶液8mL，将步骤(1)清洗后的载玻片浸入溶液当中，往其中加192μL的25％的NH4OH溶液(24μL/mL，0.6％)的同时，剧烈振荡溶液反应1min，溶液呈棕黄色的浑浊状态(氨水的作用：使金离子以氨水-金的阳离子复合物的形式沉积在负电性的表面；复合物形式：Au(NH3)2(H2O)2-x(OH)x (3-x)+)；
②用超纯水轻轻浸没载玻片并清洗2次；
③将上述载玻片放入1mM的NaBH4溶液中浸泡5min，载玻片基底表面变成紫黑色，将载玻片基底放入超纯水中浸洗。
3)纳米金岛生长
①用超纯水清洗干净的载玻片基底后，浸入1:1的HAuCl4和NH2OH溶液(终浓度各为750μM)中，摇床上摇晃5min；
②静置10min完成纳米金岛生长步骤，洗净后置于超净台自然风干，避免空气颗粒污染，得到金基质玻璃片。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)高灵敏度
本发明采用电化学发光信号放大技术为技术依托，为寨卡病毒核酸检测提供了灵敏度保证，且无需繁琐的扩增步骤。
(2)探针稳定
本发明探针采用发明人前期构建的自动化、可控线性及树状三联吡啶钌聚合物作为探针的电化学发光放大部分，性能稳定、聚合度及发光强度均一。
(3)检测过程简单、快速
本发明检测过程简单，经过简单的样品前处理及核酸提取过程即可进行寨卡病毒检测、耗时短，省去了扩增步骤，检测快速。
(4)为寨卡病毒提供了新型检测方法
本发明为寨卡病毒核酸检测技术体系，提供了新型基于电化学发光方法技术的分子诊断方法，有效的弥补了现有寨卡病毒检测技术单一，提供了无需扩增的寨卡病毒检测方法。
附图说明
图1是基于线性聚合物电化学发光放大原理的寨卡病毒检测方法
图2是基于树状聚合物电化学发光放大原理的寨卡病毒检测方法。
图3是聚合物探针表征。A.激发光谱及发射光谱表征；B.探针组装表征；C.检测原理可行性。
图4是聚合物探针组装及纯化条件优化。A.探针组装分子比例优化；B.纯化超滤次数优化。
图5是聚合物探针检测性能评价。A.检测灵敏度；B.特异性。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1寨卡病毒检测技术路线
(1)寨卡病毒核酸提取
①收集一定的组织或者细胞样本，组织及细胞样品需为感染寨卡病毒的样品，单次提取组织重量在0.1g以下为宜，细胞样品单个样品不能超过107个细胞，避免样品数量过多导致细胞裂解无效；
②样本前处理：
a.组织样品
将组织在液氮中磨成粉末，加入sample protector 1mL，使用振荡器震荡3～5次(每次1～2秒)，静止30分钟，除尽细胞中的RNA酶，离心30分钟，除去上清；
b.单层贴壁细胞样品
除去培养板中的液体培养基，往培养板中加入胰酶，消化细胞1min，加入培养基终止消化，离心收集细胞并弃上清，加入sample protector 1mL，使用振荡器震荡3～5次(每次1～2秒)，静止30分钟，除尽细胞中的RNA酶；
c.悬浮培养细胞样品
直接离心收集细胞，弃上清，加入sample protector 1mL，使用振荡器震荡3～5次(每次1～2秒)，静止30分钟，除尽细胞中的RNA酶；
③往步骤②所得细胞中加入TRIzol裂解细胞：
a.组织样品
每50-100mg组织加入1ml TRIzol，样品体积不应超过TRIzol体积10％，室温放置6～10min；
b.细胞样品
每5～10×106细胞样品中加入1mL TRIzol，反复吸打，室温放置6～10min；
④往步骤③所得混合物加入氯仿。每使用1mL TRIzol加入0.2mL氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟；
⑤将步骤④所得的混合物4℃、12 000rpm离心10～15min，样品分成三层：红色的有机相，中间蛋白层和上层无色的水相，RNA主要在上层水相中；
⑥将步骤⑤离心所得物的上层水相转移到新管中；
⑦往步骤⑥所得溶液加入异丙醇，每使用1mL TRIzol加入0.5mL异丙醇，颠倒混匀，室温放置10分钟；
⑧将步骤⑦所得混合物2～8℃、12000×g离心10分钟，弃去上清；
⑨往步骤⑧所得沉淀物中加入75％乙醇，颠倒充分混匀，每使用1mL TRIzol至少加1mL 75％乙醇；
⑩将步骤⑨所得混合物2～8℃、7500×g离心5分钟，弃上清；
所得沉淀物室温放置5～10分钟，当沉淀变透明加入25～200μL DEPC水，震荡涡旋,使RNA充分溶解，-80℃低温保存；
(2)电化学发光信号放大探针的构建
本发明的电化学发光信号放大探针分别用线性、树状三联吡啶钌聚合物(聚合度为100)作为信号放大基团，并连接DNA识别域(5'-TCTGGTTCTTTCCTGGGCCT-3')，最终完成电化学发光信号放大探针的构建，其主要包含以下步骤：
①分别取10μM的线性、树状三联吡啶钌聚合物(聚合度为100)，加入等量的DNA识别域(浓度为100μM)，并在37℃环境下孵育过夜(12小时)，完成信号放大基团与DNA识别域的连接。
②取50K道尔顿(Da)的超滤管，将步骤①所得的初产物移至超滤管，5000转/分钟冷冻离心5分钟，直至超滤管中液体离心至下层。
③向步骤②中超滤管加入500μL PBS缓冲液(1×)，5000转/分钟冷冻离心5分钟，直至超滤管中液体离心至下层。重复操作3次，将游离的DNA识别域离心至下层。
④用200μL的超纯水溶解上层中的电化学发光信号放大探针，反复冲洗上层管底部，充分溶解探针。
⑤取步骤④所得产物置于-20℃冰箱，并经过冷冻干燥(6小时)，得到固体产物，即电化学发光信号放大探针，并储存于-20冰箱备用。
(3)寨卡病毒核酸检测
本发明寨卡病毒检测模式采用电化学发光技术为信号给出方式，将电化学发光信号放大探针作为本发明有效的检测模式，为其高灵敏度性能提供坚实的基础。寨卡病毒核酸检测原理图如图1(线性聚合物探针)、图2(树状聚合物探针)所示，其主要由以下步骤构成：
①取步骤(1)病毒核酸提取样品1μL，加入44.5μL超纯水中，并加入2.5μL磷酸盐缓冲液(PBS，20×)，涡旋震荡。
②向步骤①所得混合物中加入电化学发光信号放大探针1μL(标记电化学发光聚合物，浓度为0.25μM)，涡旋震荡，并在37℃情况下孵育15分钟，使电化学发光信号放大探针与目标寨卡病毒核酸充分杂交。
③向步骤②体系中加入1μL捕捉探针(5'-TATCTCCATTCCATACCAAC-3')(5'端标记生物素，浓度为0.25μM)，涡旋震荡，并在37℃情况下孵育15分钟，使捕捉探针与核酸充分杂交。
④向步骤③体系中加入过量(10μL)的链霉亲和素磁珠(浓度1mg/mL)，充分涡旋混匀后，在37℃情况下孵育10分钟。
⑤将步骤④所得产物用磁分离器分离，并用PBS缓冲液(1×)清洗，重复三次。
⑥将步骤⑤所得产物用超纯水混匀，并用最终用电化学发光仪器检测信号。
实施例2探针表征及检测原理验证
为了验证本发明探针构建的可行性，发明人对探针的标记和DNA连接做了表征(实验结果如图3A、B所示)。发明人首先对三联吡啶钌聚合物的激发及发射光谱进行了检测(图3A)，实验结果显示，三联吡啶钌聚合物在460nm处出现最大吸收峰，其发射峰在650nm处，与单个三联吡啶钌分子一致。与此同时，发明人对聚合物连接DNA核酸后的产物进行了表征，实验结果如图3B所示，单独的三联吡啶钌聚合物分子在460nm处有吸收峰，当三联吡啶钌聚合物和DNA探针连接构建电化学发光信号放大探针时，其在260nm处出现了特征吸收峰，由此证明了本发明探针构建原理的可行性。
为了验证本发明在寨卡病毒核酸检测中的可行性，发明人合成了寨卡病毒的基因序列作为靶标，并对其进行了检测。实验结果如图3C所示，当1nM靶标核酸存在时，本发明构建的检测方法能够对其核酸做出积极、稳定的信号响应。由此证明了本发明在寨卡病毒检测中的可行性。
实施例3检测条件优化及性能评估
本发明探针构建体系的关键点在于聚合物探针构建时，三联吡啶钌聚合物和DNA识别域的比例及纯化，发明人设置了不同的分子比，并用超滤的方法对产物进行了纯化。
首先，发明人设置了不同的分子比例聚合物，聚合物：DNA识别域＝1:1、1:10、1:20、1:30、1:40、1:50、1:60、1:70，并在反应时间充足的情况下，对探针捕捉目标核酸后的电化学发光强度进行了对比(实验结果如图4A所示)，随着DNA识别域浓度的增加而增大，当聚合物：DNA识别域为1:50时到达平台期。因此，本发明将聚合物：DNA识别域＝1:50作为最佳的分子比。
另外，本发明采用多次超滤的方法将未连接聚合物的DNA识别域与完整的电化学发光探针分离，从而避免了未连接聚合物的DNA识别域竞争性与寨卡病毒核酸靶标探针进行杂交而降低灵敏度。本发明对超滤的次数进行了优化，在相同靶标浓度的情况下，依次进行超滤，并记录电化学发光强度。实验结果如图4B所示，经过三次超滤后，电化学发光强度到达最佳，由此，我们将超滤3次作为最适超滤次数。
本发明对线性聚合物探针的灵敏度进行了分析，其实验结果如图5A所示，随着寨卡病毒核酸序列浓度的增大而增强，采用线性聚合物探针对寨卡病毒核酸序列的检测灵敏度达到了100amol，该灵敏度能够为寨卡病毒的分子诊断提供有力的支持。与此同时，我们对该平台的特异性进行了探究，实验结果如图5B所示，只有当特异的寨卡病毒核酸存在时，该检测平台才能做出有效的信号响应，而随机序列的信号强度与对照组持平，由此证明了本发明的特异性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中山大学
<120> 基于电化学发光放大原理的寨卡病毒核酸检测方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tctggttctt tcctgggcct 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tatctccatt ccataccaac 20

Claims (7)

1.一种基于线性及树状三联吡啶钌聚合物电化学发光放大方法的寨卡病毒核酸检测方法，且该方法用于非诊断目的，其特征在于主要包括以下步骤：
(1)寨卡病毒核酸提取
(2)电化学发光信号放大探针的构建
本发明的电化学发光信号放大探针分别用聚合度为10～100的线性、树状三联吡啶钌聚合物作为信号放大基团，并连接DNA识别域，其序列为：5'-TCTGGTTCTTTCCTGGGCCT-3'，最终完成电化学发光信号放大探针的构建，其主要包含以下步骤：
①分别取10μM的线性、树状三联吡啶钌聚合物，加入DNA识别域，并在37℃环境下孵育过夜，完成信号放大基团与DNA识别域的连接；
②取50K道尔顿的超滤管，将步骤①所得的初产物移至超滤管，5000转/分钟冷冻离心5分钟，直至超滤管中液体离心至下层；
③向步骤②中超滤管加入500μL 1×PBS缓冲液，5000转/分钟冷冻离心5分钟，直至超滤管中液体离心至下层；重复操作3次，将游离的DNA识别域离心至下层；
④用200μL的超纯水溶解上层中的电化学发光信号放大探针，反复冲洗上层管底部，充分溶解探针；
⑤取步骤④所得产物置于-20℃，并经过冷冻干燥，得到固体产物，即电化学发光信号放大探针，并储存于-20备用；
(3)寨卡病毒核酸检测
本发明寨卡病毒检测模式采用电化学发光技术为信号给出方式，将电化学发光信号放大探针作为本发明有效的检测模式，为其高灵敏度性能提供坚实的基础；其主要由以下步骤构成：
①取步骤(1)塞卡病毒核酸提取样品1μL，加入44.5μL超纯水中，并加入2.5μL 20×磷酸盐缓冲液，涡旋震荡；
②向步骤①所得混合物中加入电化学发光信号放大探针1μL，涡旋震荡，并在37℃情况下孵育15分钟，使电化学发光信号放大探针与目标寨卡病毒核酸充分杂交；
③向步骤②体系中加入1μL捕捉探针，涡旋震荡，并在37℃情况下孵育15分钟，使捕捉探针与核酸充分杂交；
所述的捕捉探针：5'-生物素-TATCTCCATTCCATACCAAC-3'；
④向步骤③体系中加入过量的链霉亲和素磁珠，充分涡旋混匀后，在37℃情况下孵育10分钟；
⑤将步骤④所得产物用磁分离器分离，并用1×PBS缓冲液清洗，重复三次；
⑥将步骤⑤所得产物用超纯水混匀，并用最终用电化学发光仪器检测信号。
2.根据权利要求1所述的基于线性及树状三联吡啶钌聚合物电化学发光放大方法的寨卡病毒核酸检测方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的寨卡病毒核酸提取过程，包括如下步骤：
①收集一定的组织或者细胞样本，组织及细胞样品需为感染寨卡病毒的样品，单次提取组织重量在0.1g以下为宜，细胞样品单个样品不能超过107个细胞，避免样品数量过多导致细胞裂解无效；
②样本前处理：
a.组织样品
将组织在液氮中磨成粉末，加入sample protector 1mL，使用振荡器震荡3～5次，每次1～2秒，静止30分钟，除尽细胞中的RNA酶，离心30分钟，除去上清；
b.单层贴壁细胞样品
除去培养板中的液体培养基，往培养板中加入胰酶，消化细胞1min，加入培养基终止消化，离心收集细胞并弃上清，加入sample protector 1mL，使用振荡器震荡3～5次，每次1～2秒，静止30分钟，除尽细胞中的RNA酶；
c.悬浮培养细胞样品
直接离心收集细胞，弃上清，加入sample protector 1mL，使用振荡器震荡3～5次，每次1～2秒，静止30分钟，除尽细胞中的RNA酶；
③往步骤②所得细胞中加入TRIzol裂解细胞：
a.组织样品
每50～100mg组织加入1mL TRIzol，样品体积不应超过TRIzol体积10％，室温放置6～10min；
b.细胞样品
每5～10×106细胞样品中加入1mL TRIzol，反复吸打，室温放置6～10min；
④往步骤③所得混合物加入氯仿；每使用1mL TRIzol加入0.2mL氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟；
⑤将步骤④所得的混合物4℃、12 000rpm离心10～15min，样品分成三层：红色的有机相，中间蛋白层和上层无色的水相，RNA主要在上层水相中；
⑥将步骤⑤离心所得物的上层水相转移到新管中；
⑦往步骤⑥所得溶液加入异丙醇，每使用1mL TRIzol加入0.5mL异丙醇，颠倒混匀，室温放置10分钟；
⑧将步骤⑦所得混合物2～8℃、12000×g离心10分钟，弃去上清；
⑨往步骤⑧所得沉淀物中加入75％乙醇，颠倒充分混匀，每使用1mL TRIzol至少加1mL75％乙醇；
⑩将步骤⑨所得混合物2～8℃、7500×g离心5分钟，弃上清；
所得沉淀物室温放置5～10分钟，当沉淀变透明加入25～200μL DEPC水，震荡涡旋，使RNA充分溶解，-80℃低温保存。
3.根据权利要求1所述的基于线性及树状三联吡啶钌聚合物电化学发光放大方法的寨卡病毒核酸检测方法，其特征在于：
步骤(2)①所述的线性、树状三联吡啶钌聚合物与DNA识别域的分子数比为1：(1～50)。
4.根据权利要求1所述的基于线性及树状三联吡啶钌聚合物电化学发光放大方法的寨卡病毒核酸检测方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的线性三联吡啶钌聚合物的合成过程，包括如下步骤：
(1)三联吡啶钌-赖氨酸单体合成
三联吡啶钌-聚赖氨酸单体的合成由羧基活化的三联吡啶钌和单一氨基保护的赖氨酸通过酰胺键形成稳定连接而实现；
(2)固相合成起始
1)三联吡啶钌-赖氨酸单体硫醇化
①三联吡啶钌-赖氨酸单体羧基活化：
三联吡啶钌-赖氨酸和NHS保持一定的分子数比，在EDC存在的催化下，60℃搅拌孵育1h；
②羧基活化三联吡啶钌-赖氨酸单体与氨基乙硫醇连接：
羧基活化三联吡啶钌-赖氨酸单体与氨基乙硫醇间连接通过酰胺键的形成而实现；
2)线性三联吡啶钌聚合物链端的固定
线性三联吡啶钌链端的固定采用金-硫键连接，将硫醇化的三联吡啶钌-赖氨酸单体和金基质玻璃片连接，从而使后续的延伸、合成终止及纯化过程的清洗步骤得以简化；
(3)固相合成延伸
固相合成的延伸以线性三联吡啶钌聚合物的链端固定为起始，使三联吡啶钌-聚赖氨酸单体逐个添加并延长线性链；主要过程包括如下步骤：
1)氨基去保护
本发明所采用的三联吡啶钌-聚赖氨酸单体的链端被Boc氨基保护，能够定点打开和封闭，从而实现精确的分子间连接；向金基质固相固定体系加入TFA溶液，搅拌反应五分钟后，用双蒸水清洗；
2)酰胺键链接
由步骤1)所得氨基去保护末端，与三联吡啶钌-聚赖氨酸单体通过酰胺键实现连接；三联吡啶钌-聚赖氨酸单体活化的羧基末端通过脱水缩合，最终实现酰胺键连接；完成上述步骤即增加一个单体，循环往复步骤1)和步骤2)，即得到长链线性三联吡啶钌聚合物，通过控制循环次数即得到聚合度一致的产物；每循环n次即得到聚合度为n+1的线性三联吡啶钌聚合物产物；
(4)固相合成终止
根据实际需求设定固相合成延伸循环次数，在完成设定的循环数后，为了使反应终止，需向反应体系中加入TFA溶液，使末端Boc脱落，从而提升其溶解性；并最终通过谷胱甘肽与金基质玻璃片作用，使线性三联吡啶钌聚合物脱落，最后收集液态产物；
(5)产品纯化
步骤(4)所得液态产物，通过超滤管离心过滤，聚合物产物将聚集于过滤膜上层，通过双蒸水清洗即得到较纯的反应产物；最后，将所得产物存放于-20℃过夜，使其冻结，并经过冷冻干燥过程处理，即得到干粉状的线性三联吡啶钌聚合物产物，从而使其能够长期保存；并根据实际需求称取溶解得到水溶液。
5.根据权利要求4所述的基于线性及树状三联吡啶钌聚合物电化学发光放大方法的寨卡病毒核酸检测方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的羧基活化三联吡啶钌和单一氨基保护的聚赖氨酸的分子数比为1:1，反应条件为37℃过夜搅拌；
步骤(2)1)①中所述的三联吡啶钌-赖氨酸单体与NHS的分子数比为1:10～1:100；
步骤(2)1)②中所述的羧基活化三联吡啶钌-赖氨酸单体与氨基乙硫醇的分子数比为1:1。
6.根据权利要求1所述的基于线性及树状三联吡啶钌聚合物电化学发光放大方法的寨卡病毒核酸检测方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的树状三联吡啶钌聚合物合成过程，包括如下步骤：
树状三联吡啶钌聚合物的合成通过改变赖氨酸单体Boc保护位点，将所有氨基基团都保护起来，再通过时序性的去保护，逐个添加单体；其主要包括以下步骤：
1)赖氨酸单体氨基保护及羧基活化
取相同浓度的(Boc)2O与赖氨酸单体以1:1体积比混匀，60℃加热10min即完成反应，后经过NHS活化羧基，使其和氨基乙硫醇连接，得到硫醇化的赖氨酸单体，为后续的金基质固定提供连接位点；
2)树状三联吡啶钌聚合物链端的固定
树状三联吡啶钌聚合物的固定采用金-硫键连接，将硫醇化的赖氨酸单体和金基质玻璃片连接，从而使后续的延伸、合成终止及纯化过程的清洗步骤得以简化；
3)树状三联吡啶钌聚合物延伸
树状三联吡啶钌聚合物的延伸通过氨基去保护至酰胺键形成及氨基去保护再到酰胺键形成的循环过程，每完成一个循环即增加一个赖氨酸单体；本发明所采用的赖氨酸单体的链端被Boc氨基保护，能够定点打开和封闭，从而实现精确的分子间连接；通过控制循环次数即得到聚合度一致的产物；每循环n次即得到聚合度为n+1的树状的聚赖氨酸聚合物产物；向金基质固相固定体系加入TFA溶液，搅拌反应五分钟后，用双蒸水清洗；
4)固相合成终止
根据实际需求设定固相合成延伸循环次数，在完成设定的循环数后，为了使反应终止，需向反应体系中加入TFA溶液，使末端Boc脱落，从而提升其溶解性；并最终通过谷胱甘肽与金基质玻璃片作用，使树状的聚赖氨酸聚合物脱落，并最终收集液态产物；
5)连接活化三联吡啶钌分子
将活化三联吡啶钌分子与树状聚赖氨酸聚合物按1:1000的分子数比混匀，在硼酸钠缓冲液中完成三联吡啶钌与树状聚赖氨酸聚合物间的连接，反应条件为37℃避光孵育12小时；
6)产品纯化
步骤5)所得液态产物，通过超滤管离心过滤，聚合物产物将聚集于过滤膜上层，通过双蒸水清洗即得到较纯的反应产物；最后，将所得产物存放于-20℃过夜，使其冻结，并经过冷冻干燥过程处理，即得到干粉状的树状三联吡啶钌聚合物产物，从而使其能够长期保存；并根据实际需求称取溶解得到水溶液。
7.根据权利要求4～6任一项所述的基于线性及树状三联吡啶钌聚合物电化学发光放大方法的寨卡病毒核酸检测方法，其特征在于：
所述的金基质玻璃片的制备过程，包括如下步骤：
1)正电荷载玻片清洗
①取干净的正电荷载玻片先用1mL丙酮浸洗1～3分钟取出；
②用1mL异丙醇冲洗，后浸入1mL的异丙醇溶液中处理1～3分钟；
③取出载玻片并用1mL甲醇清洗，后浸入1mL的甲醇中处理1～3分钟；
2)Au3+吸附及晶体种子生成
①取3mM的HAuCl4溶液8mL，将步骤(1)清洗后的载玻片浸入溶液当中，往其中加192μL的25％的NH4OH溶液的同时，剧烈振荡溶液反应1min，溶液呈棕黄色的浑浊状态；
②用超纯水轻轻浸没载玻片并清洗2次；
③将上述载玻片放入1mM的NaBH4溶液中浸泡5min，载玻片基底表面变成紫黑色，将载玻片基底放入超纯水中浸洗；
3)纳米金岛生长
①用超纯水清洗干净的载玻片基底后，浸入1:1的HAuCl4和NH2OH溶液中，摇床上摇晃5min；
②静置10min完成纳米金岛生长步骤，洗净后置于超净台自然风干，避免空气颗粒污染，得到金基质玻璃片。
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