CN110632060A - 基于光子晶体增强电化学发光的寨卡病毒检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

基于光子晶体增强电化学发光的寨卡病毒检测试剂盒及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种基于光子晶体增强电化学发光的寨卡病毒检测试剂盒及其制备方法。该检测试剂盒包括以光子晶体为基底、ZIKV为抗原的Ru(bpy)3 2+‑COOH标记的三明治型夹心ZIKV电化学发光免疫传感器。其制备方法包括如下步骤：制备表面连接有ZIKV一抗的光子晶体薄膜，并封闭其非特异性结合位点；制备Ru(bpy)3 2+‑COOH标记的ZIKV二抗；将光子晶体薄膜表明连接的ZIKV一抗及Ru(bpy)3 2+‑COOH标记的ZIKV二抗分别与ZIKV抗原连接。本发明的寨卡病毒检测试剂盒采用ZIKV电化学发光免疫传感器，为寨卡病毒检测提供了新思路，可简便、快速地检测出寨卡病毒的浓度，而且，通过光子晶体增强电化学发光的效果，增强了电化学发光探针检测信号，提高了电化学发光免疫传感器的检测的灵敏性，降低了最低检测浓度和检测限。

Description

基于光子晶体增强电化学发光的寨卡病毒检测试剂盒及其制 备方法
技术领域
本发明涉及一种基于光子晶体增强电化学发光的寨卡病毒检测试剂盒及其制备方法，属于生物化学分析检测技术领域。
背景技术
寨卡病毒病(ZIKV Virus Disease)是由寨卡病毒(ZIKV Virus)引起并通过蚊媒传播的一种自限性急性疾病，主要通过埃及伊蚊叮咬传播。临床特征主要为发热、皮疹、关节痛或结膜炎，极少引起死亡。我国南方部分地区存在可传播寨卡病毒的媒介伊蚊，近年来与之传播方式相似的登革热输入性疫情持续增多，并在南方部分省份引起了较大规模的暴发疫情。随着与疫情相关国家或地区人员往来的日益密切，我国存在寨卡病毒输入风险。
目前寨卡病毒检测的方法主要为病原学方法、血清学方法、常规逆转录聚合酶链反应等。病原学方法过程繁琐，对检测人员的技术水平和实验室要求较高，且检测周期长；血清学方法是针对血清中的特异性lg M、lg G抗体或中和抗体的特异性检测，主要包括酶联免疫吸附测定法、免疫荧光法，但寨卡病毒与其他虫媒病毒存在较强的lg M抗体交叉反应，所以lg M抗体检测易产生混淆的结果；常规逆转录聚合酶链反应方法只能进行定性结果判断，不能对样本中的核酸量进行实时定量，且操作步骤较复杂，产物易被污染，易产生假阳性结果。
光子晶体具有和半导体相似的结构，只是将半导体中周期变化的原子变成了周期变化的两种不同介电常数的介质材料。光子带隙是光子晶体最重要的特征。当两种材料的介电常数相差足够大时，在电介质界面上会出现布拉格散射，产生光子带隙，能量落在带隙中的光将不能传播。两种介质材料的介电常数比(或折射率比)越大，布拉格散射越强烈，就越有可能出现光子带隙。
基于此，申请人形成了本发明技术，将光子晶体引入寨卡病毒检测中，以光子晶体作为布拉格反射镜面实现固态电化学发光增强。
发明内容
发明目的：针对现有技术中寨卡病毒检测存在的灵敏度差、选择性低等问题，本发明提供一种基于光子晶体增强电化学发光的寨卡病毒检测试剂盒，并提供了一种该寨卡病毒检测试剂盒的制备方法。
技术方案：本发明所述的基于光子晶体增强电化学发光的寨卡病毒检测试剂盒，包括ZIKV电化学发光免疫传感器，该ZIKV电化学发光免疫传感器为以光子晶体为基底、以ZIKV为抗原的Ru(bpy)3 2+-COOH标记的三明治型夹心免疫传感器。
具体的，ZIKV电化学发光免疫传感器包括表面连接有ZIKV一抗的光子晶体薄膜、Ru(bpy)3 2+-COOH标记的ZIKV二抗、以及通过抗原-抗体间的相互作用与两者分别连接的ZIKV抗原；其中，表面连接有ZIKV一抗的光子晶体薄膜表面的非特异性结合位点被封闭。
优选的，光子晶体薄膜为SiO2蛋白石光子晶体薄膜，ZIKV抗原为ZIKV核蛋白抗原，ZIKV一抗为α-ZiKa 1C9-F12、ZiKa Mab 0095中的一种，ZIKV二抗为α-ZiKa 2D6-H7、ZiKa Mab0092中的一种。
本发明所述的基于光子晶体增强电化学发光的寨卡病毒检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
步骤1，制备表面连接有ZIKV一抗的光子晶体薄膜，并封闭其非特异性结合位点；
步骤2，制备Ru(bpy)3 2+-COOH标记的ZIKV二抗；
步骤3，将光子晶体薄膜表面连接的ZIKV一抗、Ru(bpy)3 2+-COOH标记的ZIKV二抗与ZIKV抗原连接。
具体而言，步骤1中，先将表面修饰光子晶体薄膜的氧化铟锡电极(简称“ITO”)在含有3-氨基丙基三乙氧基硅烷(简称“APTES”)的乙腈溶液中浸泡，得到氨基化的光子晶体薄膜，然后将ZIKV一抗与氨基化的光子晶体薄膜连接，最后用牛血清蛋白封闭其非特异性结合位点。
其中，光子晶体薄膜可为SiO2蛋白石光子晶体薄膜，其制备步骤为：
(1)合成SiO2微球
i)将体积比为1:6的正硅酸乙酯(简称“TEOS”)与无水乙醇混合，超声得到均匀的TEOS溶液，备用；
ii)将氨水、无水乙醇和水混合，搅拌均匀；
iii)将步骤i)所得TEOS溶液加入到步骤ii)所得溶液中，混合后溶液中正硅酸乙酯、无水乙醇、水的体积比为1:12:2，正硅酸乙酯与氨水的体积比为5:3～10:9；搅拌反应2～5h，反应结束后，离心洗涤，干燥，即得SiO2微球；
(2)垂直沉积自组装法合成蛋白石光子晶体薄膜
将制得的SiO2微球分散在无水乙醇中，得到质量分数为1～3％的SiO2微球乳液，在50～70℃的温度条件下，采用垂直沉积自组装技术，将SiO2微球乳液沉积在基底上形成规整的蛋白石光子晶体薄膜。
上述步骤2中，具体的，可先将Ru(bpy)3 2+-COOH表面的羧基活化，活化后与ZIKV的二抗反应，得到Ru(bpy)3 2+-COOH标记的ZIKV二抗。优选采用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺活化Ru(bpy)3 2+-COOH表面的羧基。
其中，Ru(bpy)3 2+-COOH可根据下述步骤制备：
(1)将摩尔比1:1的顺式-二氯二(2,2’-联吡啶)钌(Ⅱ)和2,2’-联吡啶-4,4’-二羧酸溶于甲醇和去离子水的混合液中，加入NaHCO3，于75～85℃下缓慢回流8～12h；；
(2)将上述溶液冷却至室温，用浓硫酸调节溶液pH至3～4.4，然后将溶液置于黑暗环境中、在冰水浴中冷却；
(3)真空过滤上述冷溶液混合物，向滤液中加入现配制的NaPF6溶液，搅拌反应，然后在冰水浴中冷却；
(4)离心收集沉淀，冷冻干燥褐红色沉淀物，获得结晶产物，即为Ru(bpy)3 2+-COOH。
上述步骤3中，ZIKV电化学发光免疫传感器的制备过程可为：先将含有ZIKV抗原的PBS缓冲液与步骤1制得的表面连接有ZIKV一抗的光子晶体在35～37℃下孵育1～2h，用PBS缓冲液冲洗除去未特异性结合的ZIKV抗原；然后将其与步骤2制备的Ru(bpy)3 2+-COOH标记的ZIKV二抗在35～37℃下孵育1～2h，用PBS缓冲液冲洗，得到ZIKV电化学发光免疫传感器。
利用该ZIKV电化学发光免疫传感器检测ZIKV浓度的方法为：构建含已知浓度的ZIKV电化学发光免疫传感器，在以ZIKV电化学发光免疫传感器修饰的ITO电极为工作电极的三电极体系中，以三丙胺为共反应试剂，借助电化学发光分析仪记录电化学发光信号，构建电化学发光强度与ZIKV浓度的关系曲线，拟合方程；构建含待测浓度ZIKV的电化学发光免疫传感器，在同样条件下采集电化学发光信号，由曲线方程获得ZIKV的待测浓度。上述三电极体系中，铂丝电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极。检测条件优选为，光电倍增管高压设为800V，扫描电位区间设为0.25～1.25V，扫描速度为100mV/s。
发明原理：以光子晶体作为布拉格反射镜面实现固态电化学发光增强。通过SiO2微球的竖直沉积自组装，可在ITO基底上制备具有不同光子禁带的蛋白石型光子晶体，选择光子禁带范围包括Ru(bpy)3 2+-COOH发射波长的光子晶体，由于Ru(bpy)3 2+-COOH的发射波长在光子禁带范围内，当其受到激发时产生的电化学发光会被光子晶体沿禁带方向反射而不能透过光子晶体，因而Ru(bpy)3 2+-COOH在光子晶体表面的电化学发光要比在无光子晶体的ITO表面明显的增强，从而可有效提高检测灵敏度。
有益效果：与现有技术相比，本发明的优点在于：(1)本发明的寨卡病毒检测试剂盒采用ZIKV电化学发光免疫传感器，为寨卡病毒检测提供了新思路，可简便、快速地检测出寨卡病毒的浓度，而且，通过光子晶体增强电化学发光的效果，增强了电化学发光探针检测信号，提高了电化学发光免疫传感器的检测的灵敏性，降低了最低检测浓度和检测限，对寨卡病毒的浓度检测范围为1fg/mL～1ng/mL，检测限为0.3fg/mL；(2)本发明的检测试剂盒利用抗原-抗体间的高特异的结合作用制备三明治型夹心免疫传感器，具有高的检测选择性；而且，具备优异的稳定性、重现性和特异性，能够较好地对寨卡病毒进行检测评估。
附图说明
图1为本发明中基于光子晶体增强电化学发光的寨卡病毒免疫传感器的构建机理图；
图2A为实施例1制备的二氧化硅光子晶体薄膜扫描电镜图，其中二氧化硅微球粒径为285nm，图2B为不同粒径的二氧化硅光子晶体薄膜的漫反射光谱图；
图3为实施例1制备的Ru(bpy)3 2+-COOH的紫外吸收光谱(A)和荧光发射光谱(B)；
图4A中曲线a和b分别为TPrA在裸ITO电极上和在光子晶体修饰ITO电极上的循环伏安曲线；图4B中曲线a和b分别为Ru(bpy)3 2+-COOH在裸ITO电极上和在光子晶体修饰ITO电极上的循环伏安曲线；
图5为不同ITO电极上Ru(bpy)3 2+-COOH的电化学发光响应；其中，曲线a对应裸ITO电极，曲线b对应205nm SiO2光子晶体修饰的ITO电极，曲线c对应285nm SiO2光子晶体修饰的ITO电极；
图6A为实施例1中制备的不同浓度ZIKV的电化学发光免疫传感器的电化学发光响应，反应溶液为含20mM TPrA的0.1M PBS(pH 7.4)；
图6B为实施例1中制备的不同浓度ZIKV的电化学发光免疫传感器电化学发光强度与浓度对数之间的线性关系；
图7为实施例2中用不同ITO电极制备的ZIKV电化学发光免疫传感器的电化学发光强度；
图8为实施例3中加入10000倍浓度的不同干扰物后制备的ZIKV电化学发光免疫传感器的电化学发光强度。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
本发明的基于光子晶体增强电化学发光的寨卡病毒检测试剂盒，包括ZIKV电化学发光免疫传感器，该ZIKV电化学发光免疫传感器是以光子晶体为基底、以ZIKV为抗原的Ru(bpy)3 2+-COOH标记的三明治型夹心免疫传感器。其包括表面连接有ZIKV一抗的光子晶体薄膜、Ru(bpy)3 2+-COOH标记的ZIKV二抗、以及通过抗原-抗体间的相互作用与两者分别连接的ZIKV抗原；其中，表面连接有ZIKV一抗的光子晶体薄膜表面的非特异性结合位点被封闭。
其中，光子晶体薄膜为SiO2蛋白石光子晶体薄膜，ZIKV抗原为ZIKV核蛋白抗原(NS)。ZIKV一抗、ZIKV二抗为单克隆抗体。
该基于光子晶体增强电化学发光的寨卡病毒检测试剂盒的制备过程如图1。
以下实施例中以ZIKV一抗ZIKV MAb 0095和ZIKV二抗ZIKV MAb0092为例，对本发明的技术方案进行说明。
试剂和仪器：
顺式-二氯二(2,2’-联吡啶)钌(Ⅱ)，2,2’-联吡啶-4,4’-二羧酸，N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC)购买于Sigma-Aldrich；
六氟磷酸钠，N,N’-二羟基琥珀酰亚胺(NHS)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)购买于Alfa Aesar；
APTES，TEOS，TPrA购买于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；
N,N’-二甲基甲酰胺(DMF)，甲醇，乙醇，氨水，乙腈购买于国药集团化学试剂有限公司；
NaHCO3，牛血清蛋白(BSA)购买于生工生物工程股份有限公司；
ZIKV核蛋白抗原(NS)、ZIKV MAb 0095、ZIKV MAb0092由江苏省疾病预防控制中心提供；
MPI-M型电化学发光分析仪购置于西安瑞迈分析仪器有限公司。
实施例1
制备ZIKV电化学发光免疫传感器，并使用该免疫传感器对ZIKV进行检测，验证本发明的技术方案的可实现性。
(1)光子晶体薄膜的制备
①SiO2微球的合成
a.将7mL TEOS与42mL无水乙醇混合，超声得到均匀的TEOS溶液，备用；
b.将6.3mL氨水、42mL无水乙醇和14mL水混合，25℃下搅拌，转速1800r/min；
c.将步骤a得到的TEOS溶液加入到b溶液中，1min后转速降为1000r/min，搅拌2h；
d.离心洗涤，分别用水和乙醇洗涤2次，60℃下干燥，即得SiO2微球。
②垂直沉积自组装法合成蛋白石光子晶体薄膜
首先用丙酮、无水乙醇、去离子水对ITO进行清洗，随后将清洗干净的ITO浸泡在双氧水溶液中12h，干燥后待用；将步骤①中得到的SiO2微球分散在无水乙醇中，得到质量分数为3％的SiO2微球乳浊液；将处理过的ITO垂直放置于乳浊液中，并将整个体系置于恒温(50℃)真空干燥箱中，待乙醇挥发完全后，在ITO的表面就会生成SiO2蛋白石光子晶体薄膜，其扫描电镜图如图2A，其中，左图比例尺为2nm，右图比例尺为500nm。由图2A可以看出，SiO2微球粒径为285nm，同一平面内微球紧密均匀的排列，一个SiO2微球和周围的六个微球紧密相连，即六方排列对应面心立方结构的(111)面。
参照上述步骤①，改变氨水、TEOS和无水乙醇的比例，制得粒径205nm、236nm、260nm和285nm的SiO2微球，并以此为原料制备相应粒径的SiO2蛋白石光子晶体薄膜，其漫反射光谱图如图2B，可以看到微球的粒径和薄膜的光子带隙之间存在一定的关系，随着微球粒径的增大，光子晶体薄膜的漫反射光谱峰值发生红移。
(2)Ru(bpy)3 2+-COOH的制备
将0.2g顺式-二氯二(2,2’-联吡啶)钌(Ⅱ)和0.15g 2,2’-联吡啶-4,4’-二羧酸溶于32mL甲醇和8mL去离子水的混合液中，加入0.2g NaHCO3，于80℃下缓慢回流10h；将上述溶液冷却至室温，用浓硫酸调节溶液pH至4.4，然后在冰水浴中冷却2h(将溶液置于黑暗环境中)；真空过滤上述冷溶液混合物，将滤液转移到干净的玻璃瓶中，向滤液中加入12.5mL现配制的NaPF6溶液(0.2g/mL)，搅拌溶液5min，然后在冰水浴中冷却2h；通过离心(5000g,5min,4℃)收集沉淀，冷冻干燥褐红色沉淀物，获得结晶产物，即为Ru(bpy)3 2+-COOH。其紫外吸收光谱和荧光发射光谱分别如图3中A、B两图，其最大吸收波长在450nm左右，荧光发射波长在610nm左右。
用循环伏安法分别测试TPrA和Ru(bpy)3 2+-COOH在光子晶体上的电化学行为。实验中所用的电解质为pH＝7.4的0.1mol/L的PBS缓冲液。
首先在含20mmol/L TPrA的PBS溶液中分别对不同电极进行循环伏安扫描，如图4A，可以看出，TPrA在光子晶体修饰ITO电极(曲线b)上的电流信号比裸ITO电极(曲线a)上的弱，说明TPrA的传质受到抑制。这是由于难溶于水的TPrA通常出现在疏水界面，而二氧化硅光子晶体是亲水的。
在含10-6mol/L Ru(bpy)3 2+-COOH的PBS溶液中对不同电极进行循环伏安扫描，如图4B，可以看出，在裸ITO电极上，Ru(bpy)3 2+-COOH呈现了一组可逆的氧化还原峰，当组装上二氧化硅光子晶体后，尽管此时部分ITO表面被覆盖，但Ru(bpy)3 2+-COOH在光子晶体修饰ITO电极(曲线b)上的电化学信号比裸ITO电极(曲线a)上的强，说明带负电的二氧化硅光子晶体对Ru(bpy)3 2+-COOH有静电吸附作用。
在含10-6mol/L Ru(bpy)3 2+-COOH和20mmol/L TPrA的PBS溶液中，使用电化学发光分析仪分别采集不同电极的电化学发光信号，如图5，可以看出，修饰光子晶体的ITO电极(曲线b、c)比裸ITO电极(曲线a)上的电化学发光信号强，而285nm SiO2光子晶体修饰的ITO电极(曲线c)与205nm SiO2光子晶体修饰的ITO电极(曲线b)相比，电化学发光信号增强了2倍。说明光子晶体对Ru(bpy)3 2+-COOH电化学发光的增强是吸附和反射共同作用的结果，并且反射作用影响较大。
由以上可知，本发明通过自组装SiO2光子晶体的方法可有效增强Ru(bpy)3 2+-COOH的电化学发光强度，并且操作简单。
(3)Ru(bpy)3 2+-COOH标记的ZIKV二抗的制备
①Ru(bpy)3 2+-COOH表面羧基的活化
取500μL 2mmol/L的Ru(bpy)3 2+-COOH，用100μL含有0.05mol/L EDC和0.05mol/LNHS的PBS缓冲液(0.10mol/L,pH 7.4)活化1h。
②Ru(bpy)3 2+-COOH标记ZIKV二抗的制备
用PBS缓冲液(0.10mol/L,pH 7.4)将ZiKa MAb0092稀释至1mg/mL，将制得的表面羧基活化的Ru(bpy)3 2+-COOH加入ZiKa MAb0092中，摩尔比为Ru(bpy)3 2+-COOH:ZiKaMAb0092＝20:1，用锡纸包裹，室温下摇动1h；加入20μL 2mol/L的甘氨酸，室温下孵育15min；将抗体通过Zeba自旋脱盐柱(50KDa)除去未结合的Ru(bpy)3 2+-COOH；收集Ru(bpy)3 2+-COOH标记的ZIKV二抗MAb0092，于4℃下保存于含有0.1％BSA的PBS缓冲液(0.10mol/L pH 7.4)中。
(4)ZIKV电化学发光免疫传感器的构建
先将步骤(1)制备的表面修饰光子晶体薄膜的ITO浸泡在含有1％APTES的乙腈溶液中20min，得到氨基化的光子晶体薄膜；然后将10μL 10μg/mL的ZiKa MAb 0095在氨基化的光子晶体上35℃下孵育1h，用PBS缓冲液(0.10mol/L,pH 7.4)洗涤除去多余的ZIKV一抗，用30μL含1.0％BSA的PBS溶液(0.10mol/L,pH 7.4)孵育30min，以封闭非特异性结合位点；滴加10μL含不同浓度ZIKV核蛋白抗原(NS)的PBS溶液，ZIKV核蛋白抗原(NS)的浓度分别为1fg/mL、10fg/mL、100fg/mL、1pg/mL、10pg/mL、100pg/mL和1ng/mL，35℃下孵育1h，用PBS缓冲液冲洗；滴加10μL步骤(3)制备的Ru(bpy)3 2+-COOH标记的ZIKV二抗，35℃下孵育1h，用PBS缓冲液冲洗，得到ZIKV电化学发光免疫传感器。
将本实施例构建的ZIKV电化学发光免疫传感器，在含20mmol/L TPrA的PBS溶液中，使用电化学发光分析仪在三电极体系中采集电化学发光信号，结果如图6A～6B，其中图6A为不同浓度的ZIKV电化学发光免疫传感器的ECL响应，图6B为电化学发光强度与ZIKV浓度对数之间的线性关系图，a～g浓度分别为：1fg/mL，10fg/mL，100fg/mL，1pg/mL，10pg/mL，100pg/mL，1ng/mL；由图6B可知，电化学发光强度与ZIKV浓度的对数之间存在良好的线性关系，线性回归方程I＝13998.04+2142.25lg cZIKV，相关系数为0.986；可检测的线性范围为1fg/mL～1ng/mL，检测限为0.3fg/mL。
在此基础上，可通过本发明的方法构建未知浓度的三明治型ZIKV电化学发光免疫传感器，采集待测浓度ZIKV电化学发光免疫传感器的电化学发光信号，通过上述电化学发光强度与ZIKV浓度关系曲线分析得出待测ZIKV的浓度，从而实现未知浓度ZIKV的检测。
实施例2
本实施例对ZIKV电化学发光免疫传感器进行重现性评估，结果能够得到重现才能表明得到的数据具有一定的可靠性。
参照实施例1的方法制备多个ZIKV电化学发光免疫传感器：先将制备的表面修饰光子晶体薄膜的ITO浸泡在含有1％APTES的乙腈溶液中20min，得到氨基化的光子晶体薄膜；然后将10μL 10μg/mL的ZiKa MAb 0095在氨基化的光子晶体上37℃下孵育1h，用PBS缓冲液(0.10mol/L,pH 7.4)洗涤除去多余的ZIKV一抗，用30μL含1.0％BSA的PBS溶液(0.10mol/L,pH 7.4)孵育30min，以封闭非特异性结合位点；滴加10μL含100fg/mL ZIKV核蛋白抗原(NS)的PBS溶液，37℃下孵育1h，用PBS缓冲液冲洗；滴加10μL制备的Ru(bpy)3 2+-COOH标记的ZIKV二抗，37℃下孵育1h，用PBS缓冲液冲洗，得到ZIKV电化学发光免疫传感器。
将本实施例构建的多个ZIKV电化学发光免疫传感器，在含20mmol/L TPrA的PBS溶液中，使用电化学发光分析仪在三电极体系中采集电化学发光信号，如图7，经计算，各组数据中电化学发光强度的相对标准偏差为2.73％，表明所构建的ZIKV电化学发光免疫传感器重现性良好。
实施例3
本实施例对ZIKV电化学发光免疫传感器进行特异性评估，只有当免疫传感器对特定抗原有响应而其他干扰物无响应时，所构建的免疫传感器才具有应用价值。
(1)ZIKV电化学发光免疫传感器的构建
先将表面修饰光子晶体薄膜的ITO浸泡在含有1％APTES的乙腈溶液中20min，得到氨基化的光子晶体薄膜；然后将10μL10μg/mL的ZIKV一抗在氨基化的光子晶体上35℃下孵育2h，用PBS缓冲液(0.10mol/L,pH 7.4)洗涤除去多余的ZIKV一抗，用30μL含1.0％BSA的PBS溶液(0.10mol/L,pH 7.4)孵育30min，以封闭非特异性结合位点；滴加10μL 100fg/mL的ZIKV核蛋白抗原(NS)，35℃下孵育2h，用PBS缓冲液冲洗；滴加10μLRu(bpy)3 2+-COOH标记的ZIKV二抗，35℃下孵育2h，用PBS缓冲液冲洗，即得。
(2)电化学发光免疫传感器的特异性评估
分别配制100fg/mL的ZIKV核蛋白抗原(NS)和1ng/mL的葡萄糖(Glu)、100fg/mL的ZIKV核蛋白抗原(NS)和1ng/mL的AFP、100fg/mL的ZIKV核蛋白抗原(NS)和1ng/mL的CEA、100fg/mL的ZIKV核蛋白抗原(NS)和1ng/mL的BSA，在上述步骤(1)中，分别使用所配制的4种混合液代替100fg/mL的ZIKV核蛋白抗原(NS)，35℃下孵育2h。使用电化学发光分析仪检测各传感器的电化学发光强度，如图8，可以看出，10000倍浓度的干扰物对ZIKV免疫传感器的干扰较小，表明本发明制备的ZIKV电化学发光免疫传感器具有优越的特异性。

Claims (10)

1.一种基于光子晶体增强电化学发光的寨卡病毒检测试剂盒，其特征在于，包括ZIKV电化学发光免疫传感器，该ZIKV电化学发光免疫传感器为以光子晶体为基底、以ZIKV为抗原的Ru(bpy)3 2+-COOH标记的三明治型夹心免疫传感器。
2.根据权利要求1所述的基于光子晶体增强电化学发光的寨卡病毒检测试剂盒，其特征在于，所述ZIKV电化学发光免疫传感器包括表面连接有ZIKV一抗的光子晶体薄膜、Ru(bpy)3 2+-COOH标记的ZIKV二抗、以及通过抗原-抗体间的相互作用与两者分别连接的ZIKV抗原；其中，表面连接有ZIKV一抗的光子晶体薄膜表面的非特异性结合位点被封闭。
3.根据权利要求1所述的基于光子晶体增强电化学发光的寨卡病毒检测试剂盒，其特征在于，所述光子晶体薄膜为SiO2蛋白石光子晶体薄膜，ZIKV抗原为ZIKV核蛋白抗原，ZIKV一抗、ZIKV二抗为单克隆抗体。
4.权利要求1所述基于光子晶体增强电化学发光的寨卡病毒检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1，制备表面连接有ZIKV一抗的光子晶体薄膜，并封闭其非特异性结合位点；
步骤2，制备Ru(bpy)3 2+-COOH标记的ZIKV二抗；
步骤3，将光子晶体薄膜表面连接的ZIKV一抗、Ru(bpy)3 2+-COOH标记的ZIKV二抗与ZIKV抗原连接。
5.根据权利要求4所述基于光子晶体增强电化学发光的寨卡病毒检测试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤1中，先将表面修饰光子晶体薄膜的氧化铟锡电极在含有3-氨基丙基三乙氧基硅烷的乙腈溶液中浸泡，得到氨基化的光子晶体薄膜，然后通过共价连接使ZIKV一抗连接在氨基化的光子晶体薄膜上，最后用牛血清蛋白封闭其非特异性结合位点。
6.根据权利要求4所述基于光子晶体增强电化学发光的寨卡病毒检测试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤1中，所述光子晶体薄膜为SiO2蛋白石光子晶体薄膜，其制备步骤为：
(1)合成SiO2微球
i)将体积比1:6的正硅酸乙酯与无水乙醇混合，超声得到均匀的正硅酸乙酯溶液；
ii)将氨水、无水乙醇和水混合，搅拌均匀；
iii)将步骤i)所得正硅酸乙酯溶液加入到步骤ii)所得溶液中，混合后溶液中正硅酸乙酯、无水乙醇、水的体积比为1:12:2，正硅酸乙酯与氨水的体积比为5:3～10:9，搅拌反应2～5h，反应结束后，离心洗涤，干燥，即得SiO2微球；
(2)垂直沉积自组装法合成蛋白石光子晶体薄膜
将制得的SiO2微球分散在无水乙醇中，得到质量分数1～3％的SiO2微球乳液，在50～70℃的温度条件下，采用垂直沉积自组装技术，将SiO2微球乳液沉积在基底上形成规整的蛋白石光子晶体薄膜。
7.根据权利要求4所述基于光子晶体增强电化学发光的寨卡病毒检测试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤2中，先将Ru(bpy)3 2+-COOH表面的羧基活化，然后将ZIKV的二抗与表面羧基被活化的Ru(bpy)3 2+-COOH反应，得到Ru(bpy)3 2+-COOH标记的ZIKV二抗。
8.根据权利要求7所述基于光子晶体增强电化学发光的寨卡病毒检测试剂盒的制备方法，其特征在于，采用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺活化Ru(bpy)3 2+-COOH表面的羧基。
9.根据权利要求4所述基于光子晶体增强电化学发光的寨卡病毒检测试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤2中，所述Ru(bpy)3 2+-COOH的制备步骤为：
(1)将摩尔比1:1的顺式-二氯二(2,2’-联吡啶)钌(Ⅱ)和2,2’-联吡啶-4,4’-二羧酸溶于甲醇和去离子水的混合液中，加入NaHCO3，于75～85℃下缓慢回流8～12h；
(2)将上述溶液冷却至室温，用浓硫酸调节溶液pH至3～4.4，然后将溶液置于黑暗环境中、在冰水浴中冷却；
(3)真空过滤上述冷溶液混合物，向滤液中加入现配制的NaPF6溶液，搅拌反应，然后在冰水浴中冷却；
(4)离心收集沉淀，冷冻干燥褐红色沉淀物，获得结晶产物，即为Ru(bpy)3 2+-COOH。
10.根据权利要求4所述基于光子晶体增强电化学发光的寨卡病毒检测试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤3中，先将含有ZIKV抗原的PBS缓冲液与步骤1制得的表面连接有ZIKV一抗的光子晶体在35～37℃下孵育1～2h，用PBS缓冲液冲洗除去未特异性结合的ZIKV抗原；然后将其与步骤2制备的Ru(bpy)3 2+-COOH标记的ZIKV二抗在35～37℃下孵育1～2h，用PBS缓冲液冲洗，得到ZIKV电化学发光免疫传感器。
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