CN110220889A

CN110220889A - 一种双猝灭电化学发光策略应用于原降钙素的检测的传感器制备方法及应用

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Publication number: CN110220889A
Application number: CN201910495084.3A
Authority: CN
Inventors: 魏琴; 薛经纬; 王欢; 吴丹; 马洪敏; 冯锐; 范大伟
Original assignee: University of Jinan
Current assignee: University of Jinan
Priority date: 2019-06-10
Filing date: 2019-06-10
Publication date: 2019-09-10
Anticipated expiration: 2039-06-10
Also published as: CN110220889B

Abstract

本发明涉及一种基于共振能量转移的抗体定向固定双猝灭电化学发光策略应用于原降钙素的检测的传感器制备方法，属于电化学发光检测技术领域。三氧化钼对三联吡啶钌具有良好的猝灭效果，金纳米粒子与三氧化钼成功的复合，进一步增强了三氧化钼对三联吡啶钌的电致化学发光信号的猝灭作用。采用HWRGWVC多肽链作为特异性捕获体，实现抗体的定向位点捕获。根据对不同浓度的原降钙素响应的电化学发光信号强度不同，实现对原降钙素的检测。通过采用加标回收法来检测不同浓度的原降钙素在人类血清中的样品回收率，以展示本方法的准确度和精密度，测得回收率的范围为100.3~104.2%，说明该方法准确可靠。

Description

一种双猝灭电化学发光策略应用于原降钙素的检测的传感器制备方法及应用

技术领域

本发明涉及一种基于金复合的三氧化钼空心纳米球猝灭三联吡啶钌负载中空多片层硫化铟的电致化学发光免疫传感器的制备及应用，具体是采用三联吡啶钌负载的中空多片层硫化铟作为发光材料，金功能化的金复合的三氧化钼空心纳米球作为猝灭剂，并且采用多肽链实现对抗体的定向固定，制备的一种检测原降钙素的猝灭型电化学发光传感器，属于电化学发光检测技术领域。

背景技术

SIRS指全身炎症反应即机体对多种细胞因子/炎症介质的反应。内毒素是全身炎症反应SIR的触发因素，目前尚无明显的治疗方法。因此，许多新一代的抗生素，化学疗法或其他先进的医疗手段已被用来试图对它进行阻止。原降钙素作为血清中SIRS的典型生物标志物，对SIRS的早期准确可靠诊断起着至关重要的作用。

目前检测原降钙素的分析方法主要有放射免疫分析法、酶联免疫分析法和试剂盒法，但是所用的试剂有效期短，具有放射性污染，检测周期长，灵敏度低，步骤繁琐等缺点。为了克服以上传统分析方法的缺点，本发明设计了一种特异性强、灵敏度高、无放射性污染、操作快速简便的电致化学发光免疫分析方法。同时生物活性的保持对于传感器的灵敏度和可行性具有巨大意义，因此，采用HWRGWVC多肽链作为特异性捕获体，实现抗体的定向位点捕获。

电化学发光是由电化学反应直接或间接引发的化学发光现象，作为电化学和化学发光互相交叉渗透的产物，该方法既有发光分析的超高灵敏度，又结合了电化学电位可控的优点，所以引起了分析化学和生物分析等诸多领域的高度重视。传统电化学发光材料三联吡啶钌具有在电极表面固定困难、发光信号不稳定等缺点。因此，本发明制备了一种中空多片层硫化铟与三联吡啶钌复合作为基底，以金复合的三氧化钼空心纳米球作为猝灭探针，构建了一种双猝灭型的电致化学发光传感器用于原降钙素的检测。上述材料在电化学发光传感器中的相关应用尚属首次。

发明内容

本发明的目的是针对现有传感器的生物活性保护提供一种适合的应对方法，并且针对现有的全身炎症反应综合症的检测方法存在的问题，提供一种基于金复合的三氧化钼空心纳米球猝灭三联吡啶钌负载的中空多片层硫化铟的电致化学发光免疫传感器的制备及应用，实现对全身炎症反应综合症的疾病标志物的快速、灵敏、特异、高效检测。本发明将中空多片层硫化铟固载三联吡啶钌作为基底，金复合的三氧化钼空心纳米球作为双猝灭剂，制备了一种夹心型电化学发光传感器，用于原降钙素的灵敏检测。本发明制备的电化学发光传感器对原降钙素的检测范围为0.1 pg/mL~50 ng/mL，检测限达12.49 pg/mL。该传感器可有效用于原降钙素的分析检测，具有制备简单快速、分析成本低、灵敏度高等优点。

本发明的技术方案如下：

1. 一种双猝灭电化学发光策略应用于原降钙素的检测的传感器制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）依次用1.0、0.3、0.05 μm的氧化铝粉末对玻碳电极进行抛光，在超纯水和乙醇中超声清洗，氮气吹干；

（2）在处理好的电极表面滴加6 μL、浓度为0.5~5 mg/mL的三联吡啶钌负载的中空多片层硫化铟分散液作为传感基底材料，4°C下晾干成膜；

（3）加入3~8 mM巯基乙酸在4°C下浸泡5 h后转入EDC/NHS混合体系中浸泡30 min来活化羧基；

（4）继续在4°C条件下浸泡浓度为5~15 μg/mL的原降钙素一抗1 h，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液洗净电极表面，4°C下晾干；

（5）在质量浓度为1~3%的牛血清白蛋白中浸泡来封闭非特异性活性位点，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面，常温下晾干；

（6）滴加6 μL、浓度为0.0001~50 ng/mL的原降钙素抗原，在室温下孵化1 h后，用pH7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面，室温下晾干；

（7）继续滴加6 μL、浓度为2~4 mg/mL的金复合的三氧化钼空心纳米球二抗孵化液于电极表面，室温下孵化1 h，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液缓慢冲洗电极表面，室温下晾干。

2. 如权利要求1所述的一种一种双猝灭电化学发光策略应用于原降钙素的检测的传感器制备方法，其特征在于，所述基底材料三联吡啶钌负载的中空多片层硫化铟的制备，包括以下步骤：

（1）中空多片层硫化铟的制备

首先制备前驱体：4~6 mg水合硝酸铟和5~8 mg 1,4-对苯二甲酸酸溶解在2 mL的N, N-二甲基甲酰胺，搅拌10 min。然后，将混合均匀的溶液在120°C下加热30 min，冷却到室温后，所得白色沉淀用乙醇洗三次并干燥。其次，前驱体添加到含有200~500 mg的硫脲的40mL乙醇溶液中搅拌2 min，混合物转移到一个80 mL聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压釜中在180 °C反应3 h。冷却到室温后，用乙醇和超纯水对沉淀进行三次清洗并干燥，得到黄色的粉末即为中空多片层硫化铟；

（2）三联吡啶钌负载的中空多片层硫化铟的制备

称取2~5 mg中空多片层硫化铟溶于1 mL去离子水配制成2 mg/mL溶液，向其中加入1mL、1×10^-3 mol/L的三联吡啶钌混合，在室温下避光振荡12 h，经过离心后重新分散到1 mL去离子水中得到三联吡啶钌负载的中空多片层硫化铟，储存在4°C下备用。

3. 如权利要求1所述的一种双猝灭电化学发光策略应用于原降钙素的检测的传感器制备方法，其特征在于，所述金复合的三氧化钼空心纳米球标记的原降钙素检测抗体溶液的制备，包括以下步骤：

（1）三氧化钼空心纳米球的制备

首先，将0.12~0.18 gC₁₀H₁₄MoO₆在20~50 mL正丁醇中超声溶解10 min，使固体均匀分散到溶剂中。然后在磁力搅拌下，将5~10 mL1 M硝酸添加到混合溶液后持续搅拌1 h。将获得混合溶液转移到一个50 mL聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压釜。之后，在220°C下加热12 h，并冷却到室温。用去离子水和无水乙醇依次洗涤黑色沉淀物2~6次。在60°C干燥5 h后得到前驱体MoO₂，然后在300~550°C空气氛围下加热2~5 h。获得的白色MoO₃粉末；

（2）金复合的三氧化钼空心纳米球的制备

1~3 mL HAuCl₄（1%）和10~15 mg 聚乙烯吡咯烷酮添加到上述混合溶液中搅拌10 h。随后，4 mL的柠檬酸钠溶液（50mM）和0.05~0.1 mgNaBH₄被添加到混合搅拌12 h，用超纯水和无水乙醇清洗后所得固体即为金复合的三氧化钼空心纳米球；

（3）金复合的三氧化钼空心纳米球二抗孵化液的制备

将1mL 50 ng/mL HWRGWVC多肽链溶液加入上述溶液中，在4°C振荡1h。12000 rpm离心后，将沉淀物分散到1 mL pH7.4的磷酸盐缓冲溶液中。随后400 μL 0.1%BSA的加入溶液中用来封闭特异性活性位点。离心分离和洗涤后；随后加入100~300 μL 10 mg/mL的原降钙素抗原的二抗，在4°C下孵化10~15 h；随后离心去除上清液，重新分散到在1~3 mL pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中，得到金复合的三氧化钼空心纳米球二抗孵化液，储存在4°C下备用。

4. 如权利要求1所述的一种双猝灭电化学发光策略应用于原降钙素的检测的传感器制备方法，用于样品的检测，其特征在于，步骤如下：

（1）使用电化学工作站的三电极体系进行测试，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，所制备的电化学发光传感器为工作电极，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起将光电倍增管的高压设置为600 V，循环伏安扫描电位范围为0~1.15 V，扫描速率为0.12~0.15 V/s；

（2）将处理完毕的电致化学发光传感器浸入在10 mL、pH 6.5~8.6的含浓度为35~55 mM过氧化氢的磷酸盐缓冲溶液中，接通电化学发光系统，孵化不同浓度的原降钙素时传感器进行测试，根据产生的不同的电化学发光信号强度，绘制工作曲线；

（3）将待测样品溶液代替待测物抗原进行检测。

本发明的有益成果

（1）以三联吡啶钌负载的中空多片层硫化铟为发光材料，巨大的比表面积和中空结构有利于三联吡啶钌的固载和电子的传输，并首次将其用做电致化学发光传感器的基底物质，利用三联吡啶钌负载的中空多片层硫化铟高且稳定的发光效率来提高传感器光信号的输出，从而获得更高的灵敏度；

（2）以金复合的三氧化钼空心纳米球作为猝灭剂，其中金的有效复合使得三氧化钼的猝灭效果得到进一步提升，除此之外金的参与也使得材料有更好的生物相容性，另一方面是为了有效地增加抗体的固载量，整体实现了电致化学发光信号的有效控制；

（3）采用HWRGWVC多肽链作为特异性捕获体，实现抗体的定向位点捕获。该方法使蛋白的抗体活性获得了保护，提高了蛋白的有效利用率；

（4）本发明首次将金复合的三氧化钼空心纳米球猝灭三联吡啶钌负载的中空多片层硫化铟用于电致化学发光传感器的构建，并且此效应主要归功于两者之间的共振能量转移。基于此构建的传感器可应用于疾病标志物的临床检测，具有操作简单，反应快速，信号响应范围宽为0.01 pg/mL~50 ng/mL，检出限低为5.4 fg/mL的优点。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1 制备三联吡啶钌负载的中空多片层硫化铟

（1）中空多片层硫化铟的制备

首先制备前驱体：4.5 mg水合硝酸铟和5.5 mg1,4-对苯二甲酸酸溶解在2 mL的N, N-二甲基甲酰胺，搅拌10 min。然后，将混合均匀的溶液在120°C下加热30 min，冷却到室温后，所得白色沉淀用乙醇洗三次并干燥。其次，前驱体添加到含有200 mg的硫脲的40 mL乙醇溶液中搅拌2 min，混合物转移到一个80 mL聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压釜中在180°C反应3 h。冷却到室温后，用乙醇和超纯水对沉淀进行三次清洗并干燥，得到黄色的粉末即为中空多片层硫化铟；

（2）三联吡啶钌负载的中空多片层硫化铟的制备

称取2 mg中空多片层硫化铟溶于1 mL去离子水配制成2 mg/mL溶液，向其中加入1 mL、1×10^-3 M的三联吡啶钌混合，在室温下避光振荡12 h，经过离心后重新分散到1 mL去离子水中得到三联吡啶钌负载的中空多片层硫化铟，储存在4°C下备用。

实施例2 金复合的三氧化钼空心纳米球标记的原降钙素二抗孵化液的制备

（1）三氧化钼空心纳米球的制备

首先，将0.12 g C₁₀H₁₄MoO₆在20~50 mL正丁醇中超声溶解10 min，使固体均匀分散到溶剂中。然后在磁力搅拌下，将5 mL1 M硝酸添加到混合溶液后持续搅拌1 h。将获得混合溶液转移到一个50 mL聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压釜。之后，在220°C下加热12 h，并冷却到室温。用去离子水和无水乙醇依次洗涤黑色沉淀物2次。在60°C干燥5 h后得到前驱体MoO₂，然后在300°C空气氛围下加热2 h。获得的白色MoO₃粉末；

（2）金复合的三氧化钼空心纳米球的制备

1 mL HAuCl₄（1%）和10 mg 聚乙烯吡咯烷酮添加到上述混合溶液中搅拌10 h。随后，4mL的柠檬酸钠溶液（50mM）和0.05~0.1 mgNaBH₄被添加到混合搅拌12 h，用超纯水和无水乙醇清洗后所得固体即为金复合的三氧化钼空心纳米球；

（3）金复合的三氧化钼空心纳米球二抗孵化液的制备

将1mL 50 ng/mL HWRGWVC多肽链溶液加入上述溶液中，在4°C振荡1h。12000 rpm离心后，将沉淀物分散到1 mL pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中。随后400 μL 0.1% BSA的加入溶液中用来封闭特异性活性位点。离心分离和洗涤后；随后加入100 μL 10 mg/mL的原降钙素抗原的二抗，在4°C下孵化10 h；随后离心去除上清液，重新分散到在1 mL pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中，得到金复合的三氧化钼空心纳米球二抗孵化液，储存在4°C下备用。

实施例3 金复合的三氧化钼空心纳米球标记的原降钙素二抗孵化液的制备

（1）三氧化钼空心纳米球的制备

首先，将0.13 g C₁₀H₁₄MoO₆在50 mL正丁醇中超声溶解10 min，使固体均匀分散到溶剂中。然后在磁力搅拌下，将10 mL1 M硝酸添加到混合溶液后持续搅拌1 h。将获得混合溶液转移到一个50 mL聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压釜。之后，在220°C下加热12 h，并冷却到室温。用去离子水和无水乙醇依次洗涤黑色沉淀物6次。在60°C干燥5 h后得到前驱体MoO₂，然后在550°C空气氛围下加热5 h。获得的白色MoO₃粉末；

（2）金复合的三氧化钼空心纳米球的制备

1~3 mL HAuCl₄（1%）和15 mg 聚乙烯吡咯烷酮添加到上述混合溶液中搅拌10 h。随后，4 mL的柠檬酸钠溶液（50mM）和0.1 mg NaBH₄被添加到混合搅拌12 h，用超纯水和无水乙醇清洗后所得固体即为金复合的三氧化钼空心纳米球；

（3）金复合的三氧化钼空心纳米球二抗孵化液的制备

将1mL 50 ng/mL HWRGWVC多肽链溶液加入上述溶液中，在4°C振荡1h。12000 rpm离心后，将沉淀物分散到1 mL pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中。随后400 μL 0.1% BSA的加入溶液中用来封闭特异性活性位点。离心分离和洗涤后；随后加入300 μL 10 mg/mL的原降钙素抗原的二抗，在4 °C下孵化15 h；随后离心去除上清液，重新分散到在3 mL pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中，得到金复合的三氧化钼空心纳米球二抗孵化液，储存在4°C下备用。

实施例4金复合的三氧化钼空心纳米球标记的原降钙素二抗孵化液的制备

（1）三氧化钼空心纳米球的制备

首先，将0.14 g C₁₀H₁₄MoO₆在20~50 mL正丁醇中超声溶解10 min，使固体均匀分散到溶剂中。然后在磁力搅拌下，将5 mL1 M硝酸添加到混合溶液后持续搅拌1 h。将获得混合溶液转移到一个50 mL聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压釜。之后，在220°C下加热12 h，并冷却到室温。用去离子水和无水乙醇依次洗涤黑色沉淀物5次。在60°C干燥5 h后得到前驱体MoO₂，然后在450°C空气氛围下加热3 h。获得的白色MoO₃粉末；

（2）金复合的三氧化钼空心纳米球的制备

1 mL HAuCl₄（1%）和10 mg 聚乙烯吡咯烷酮添加到上述混合溶液中搅拌10 h。随后，4mL的柠檬酸钠溶液（50mM）和0.08 mgNaBH₄被添加到混合搅拌12 h，用超纯水和无水乙醇清洗后所得固体即为金复合的三氧化钼空心纳米球；

（3）金复合的三氧化钼空心纳米球二抗孵化液的制备

将1mL 50 ng/mL HWRGWVC多肽链溶液加入上述溶液中，在4°C振荡1h。12000 rpm离心后，将沉淀物分散到1 mL pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中。随后400 μL 0.1% BSA的加入溶液中用来封闭特异性活性位点。离心分离和洗涤后；随后加入200 μL 10 mg/mL的原降钙素抗原的二抗，在4°C下孵化12 h；随后离心去除上清液，重新分散到在1 mL pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中，得到金复合的三氧化钼空心纳米球二抗孵化液，储存在4°C下备用。

实施例5 制备检测原降钙素的电致化学发光免疫传感器

（2）在处理好的电极表面滴加6 μL、浓度为0.5 mg/mL的三联吡啶钌负载的中空多片层硫化铟分散液作为传感基底材料，4 °C下晾干成膜；

（3）加入5 mM巯基乙酸在4 °C下浸泡5 h后转入EDC/NHS混合体系中浸泡30 min来活化羧基；

（4）继续在4 °C条件下浸泡浓度为5 μg/mL的原降钙素一抗 1 h，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液洗净电极表面，4 °C下晾干；

（5）在质量浓度为2%的牛血清白蛋白中浸泡来封闭非特异性活性位点，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面，常温下晾干；

（7）继续滴加6 μL、浓度为3 mg/mL的金复合的三氧化钼空心纳米球二抗孵化液于电极表面，室温下孵化1 h，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液缓慢冲洗电极表面，室温下晾干；

（8）传感器构建完毕，进行电致化学发光测试。

实施例6 制备检测原降钙素电致化学发光免疫传感器

（2）在处理好的电极表面滴加6 μL、浓度为2 mg/mL的三联吡啶钌负载的中空多片层硫化铟分散液作为传感基底材料，4 °C下晾干成膜；

（3）加入3 mM巯基乙酸在4 °C下浸泡5 h后转入EDC/NHS混合体系中浸泡30 min来活化羧基；

（4）继续在4 °C条件下浸泡浓度为10 μg/mL的原降钙素一抗 1 h，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液洗净电极表面，4 °C下晾干；

（5）在质量浓度为1 %的牛血清白蛋白中浸泡来封闭非特异性活性位点，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面，常温下晾干；

（7）继续滴加6 μL、浓度为2 mg/mL的金复合的三氧化钼空心纳米球二抗孵化液于电极表面，室温下孵化1 h，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液缓慢冲洗电极表面，室温下晾干；

（8）传感器构建完毕，进行电致化学发光测试。

实施例7 对原降钙素的检测

（1）使用电化学工作站的三电极体系进行测试，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，所制备的电化学发光传感器为工作电极，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起将光电倍增管的高压设置为600 V，循环伏安扫描电位范围为0~1.15 V，扫描速率为0.15 V/s；

（2）将处理完毕的电致化学发光传感器浸入在10 mL、pH 6.5的含浓度为35 mM过氧化氢的磷酸盐缓冲溶液中，接通电化学发光系统，孵化不同浓度的原降钙素时传感器进行测试，根据产生的不同的电化学发光信号强度，绘制工作曲线；

（3）将待测样品溶液代替待测物抗原进行检测。

实施例8 对原降钙素的检测

（1）使用电化学工作站的三电极体系进行测试，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，所制备的电化学发光传感器为工作电极，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起将光电倍增管的高压设置为600 V，循环伏安扫描电位范围为0~1.15 V，扫描速率为0.12 V/s；

（2）将处理完毕的电致化学发光传感器浸入在10 mL、pH 7.6的含浓度为50 mM过氧化氢的磷酸盐缓冲溶液中，接通电化学发光系统，孵化不同浓度的原降钙素时传感器进行测试，根据产生的不同的电化学发光信号强度，绘制工作曲线；

（3）将待测样品溶液代替待测物抗原进行检测。

实施例9 采用加标回收的方法对脑脊液中原降钙素的检测

（1）向稀释的血清中加入不同浓度的原降钙素，采用标准加入法测定样品中原降钙素的平均回收率，结果见表1；

表1 样品中原降钙素的检测结果

表1检测结果可以看出，样品中原降钙素检测结果的回收率为100.3~104.2%，表明本发明可以应用于实际生物样品的检测，结果准确可靠。

Claims

1.一种双猝灭电化学发光策略应用于原降钙素的检测的传感器制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（2）在处理好的电极表面滴加6 μL、浓度为0.5~5 mg/mL的三联吡啶钌负载的中空多片层硫化铟分散液作为传感基底材料，4 °C下晾干成膜；

（3）加入3~8 mM巯基乙酸在4 °C下浸泡5 h后转入EDC/NHS混合体系中浸泡30 min来活化羧基；

（4）继续在4 °C条件下浸泡浓度为5~15 μg/mL的原降钙素一抗1 h，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液洗净电极表面，4°C下晾干；

2.如权利要求1所述的一种双猝灭电化学发光策略应用于原降钙素的检测的传感器制备方法，其特征在于，所述基底材料三联吡啶钌负载的中空多片层硫化铟的制备，包括以下步骤：

（1）中空多片层硫化铟的制备

首先制备前驱体：4~6 mg水合硝酸铟和5~8 mg 1,4-对苯二甲酸酸溶解在2 mL的N, N-二甲基甲酰胺，搅拌10 min;

然后，将混合均匀的溶液在120°C下加热30 min，冷却到室温后，所得白色沉淀用乙醇洗三次并干燥;

其次，前驱体添加到含有200~500 mg的硫脲的40 mL乙醇溶液中搅拌2 min，混合物转移到一个80 mL聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压釜中在180°C反应3 h

冷却到室温后，用乙醇和超纯水对沉淀进行三次清洗并干燥，得到黄色的粉末即为中空多片层硫化铟；

（2）三联吡啶钌负载的中空多片层硫化铟的制备

3.如权利要求1所述的一种双猝灭电化学发光策略应用于原降钙素的检测的传感器制备方法，其特征在于，所述金复合的三氧化钼空心纳米球标记的原降钙素检测抗体溶液的制备，包括以下步骤：

（1）三氧化钼空心纳米球的制备

首先，将0.12~0.18 g C₁₀H₁₄MoO₆在20~50 mL正丁醇中超声溶解10 min，使固体均匀分散到溶剂中;

然后在磁力搅拌下，将5~10 mL1 M硝酸添加到混合溶液后持续搅拌1 h;

将获得混合溶液转移到一个50 mL聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压釜;

之后，在220°C下加热12 h，并冷却到室温;

用去离子水和无水乙醇依次洗涤黑色沉淀物2~6次;

在60°C干燥5 h后得到前驱体MoO₂，然后在300~550°C空气氛围下加热2~5 h;

获得的白色MoO₃粉末;

（2）金复合的三氧化钼空心纳米球的制备

1~3 mL HAuCl₄（1%）和10~15 mg 聚乙烯吡咯烷酮添加到上述混合溶液中搅拌10 h;

随后，4 mL的柠檬酸钠溶液（50mM）和0.05~0.1 mgNaBH₄被添加到混合搅拌12 h，用超纯水和无水乙醇清洗后所得固体即为金复合的三氧化钼空心纳米球；

（3）金复合的三氧化钼空心纳米球二抗孵化液的制备

将1mL 50 ng/mL HWRGWVC多肽链溶液加入上述溶液中，在4°C振荡1h；

12000 rpm离心后，将沉淀物分散到1 mL pH7.4的磷酸盐缓冲溶液中;

随后400 μL 0.1% BSA的加入溶液中用来封闭特异性活性位点;

离心分离和洗涤后；随后加入100~300 μL 10 mg/mL的原降钙素抗原的二抗，在4°C下孵化10~15 h；随后离心去除上清液，重新分散到在1~3 mL pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中，得到金复合的三氧化钼空心纳米球二抗孵化液，储存在4 °C下备用。

4.如权利要求1所述的一种双猝灭电化学发光策略应用于原降钙素的检测的传感器制备方法，用于样品的检测，其特征在于，步骤如下：

（2）将处理完毕的电致化学发光传感器浸入在10 mL、pH 6.5~8.6的含浓度为5~15mmol/L过氧化氢的磷酸盐缓冲溶液中，接通电化学发光系统，孵化不同浓度的原降钙素时传感器进行测试，根据产生的不同的电化学发光信号强度，绘制工作曲线；

（3）将待测样品溶液代替待测物抗原进行检测。