CN111830100A - 一种基于钒酸银/钒酸铟的电化学发光传感器制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于钒酸银/钒酸铟纳米复合材料的电化学发光传感器制备方法及应用，属于电化学发光检测技术领域。开发并首次验证了四苯乙烯纳米簇与氧化铜纳米球能量转移对在低电位下可达到的高效电化学发光猝灭的行为。这一发现，一方面解决了发光材料在电极上的固定问题，另一方面解决了有效调节发光强度的问题。根据对不同浓度的原降钙素响应的电化学发光信号强度不同，实现对原降钙素的检测。通过采用F检验、T检验展示本方法的准确度和精密度，测试结果均小于理论值，说明该方法准确可靠。

Description

一种基于钒酸银/钒酸铟的电化学发光传感器制备方法及 应用

技术领域

本发明涉及一种基于四苯乙烯纳米簇作为低电位电化学发光发射器并固载在钒酸银/钒酸铟纳米棒上，棒状结构加速了电子的传递，棒上分布的颗粒也增加了发光材料固定的位点，以氧化铜纳米球作为猝灭探针，两者发生能量转移的传感器制备及应用。具体是采用四苯乙烯纳米簇作为发光材料，氧化铜纳米球作为猝灭探针，并且采用多肽链实现对抗体的定向固定，实现了在-1.15 V的低电位激发，有效保护了蛋白质的活性，也提高对免疫物质检测的可行性。综上制备的一种检测原降钙素的猝灭型电化学发光传感器，属于电化学发光检测技术领域。

背景技术

SIRS指全身炎症反应即机体对多种细胞因子/炎症介质的反应，目前尚无明显的治疗方法。因此，原降钙素作为血清中SIRS的典型生物标志物，对SIRS的早期准确可靠诊断起着至关重要的作用。

目前对原降钙素的分析检测方法有很多。比如：放射免疫分析法、酶联免疫分析法等。但是存在所用的试剂有效期短，具有放射性污染，检测周期长，灵敏度低，步骤繁琐等诸多缺点。为了克服这些缺点，本发明设计了一种特异性强、灵敏度高、无放射性污染、操作快速简便的电致化学发光免疫分析方法。

电化学发光兼有电化学和化学发光两者的交叉渗透，因此同时具备发光分析的超高灵敏度与电化学电位可控的优点，所以引起了分析化学等诸多领域的高度重视。传统的发光材料虽然具有优秀的发光效果但难以稳定固载于电极表面，然而许多新型的发光体，例如硫化镉等镉基材料却有很高生物毒性或者必须施加高电位激发。因此，无毒、低电位激发且电极固载性好的发光材料成为了研究的重点。本发明以钒酸银/钒酸铟纳米棒作为基底固载四苯乙烯纳米簇，以氧化铜纳米球作为猝灭探针，构建了一种猝灭型的电致化学发光传感器用于原降钙素的检测。

发明内容

本发明的目的是针对现有传感器的发光材料发光效率优秀但毒性大或难于固载于电极表面等缺点提供一种适合的新型发光材料，并且针对现有的全身炎症反应综合症的检测方法存在的问题，提供一种新颖的基于氧化铜猝灭四苯乙烯纳米簇的电致化学发光免疫传感器的制备并实行对实际样品的检测应用，实现对全身炎症反应综合症的疾病标志物的快速、灵敏、特异、高效检。整个方法的投入能耗低，获得的效果理想，具有良好的应用前景。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

1. 一种基于钒酸银/钒酸铟纳米复合材料的电化学发光传感器制备方法及应用，其特征在于，包括以下步骤：

（1）依次用1.0、0.3、0.05 μm的氧化铝粉末对玻碳电极进行抛光，在超纯水和乙醇中超声清洗，氮气吹干；

（2）在处理好的电极表面滴加6 μL、浓度为0.5~5 mg/mL的四苯乙烯纳米簇分散液作为传感基底材料，4 °C下晾干成膜；

（3）加入3~8 mM巯基乙酸在4 °C下浸泡5 h后转入EDC/NHS混合体系中浸泡30 min来活化羧基；

（4）继续在4 °C条件下浸泡浓度为5~15 μg/mL的原降钙素抗体1 h，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液洗净电极表面，4°C下晾干；

（5）在质量浓度为1~3%的牛血清白蛋白中浸泡来封闭非特异性活性位点，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面，常温下晾干；

（6）滴加6 μL、浓度为0.0001~50 ng/mL的原降钙素抗原，在室温下孵化1 h后，用pH7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面，室温下晾干；

（7）继续滴加6 μL、浓度为2~4 mg/mL的氧化铜复合纳米晶捕获抗体孵化液于电极表面，室温下孵化1 h，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液缓慢冲洗电极表面，室温下晾干；

（8）传感器构建完毕，进行电致化学发光测试。

2. 如权利要求1所述的一种基于钒酸银/钒酸铟纳米复合材料的电化学发光传感器制备方法及应用，其特征在于，所述基底材料钒酸银/钒酸铟复合纳米材料的制备，包括以下步骤：

（1）钒酸银/钒酸铟复合纳米材料的制备

在60 mL去离子水中加入1.0 mmol的偏钒酸铵，在磁搅拌下得到均相溶液。随后，1.0mmol的硝酸银的加入上述溶液中，并在磁力下搅拌20 min。这种混合溶液的pH值使用质量浓度为28 %的一水合氨调整到8.0。获得的混合物转移到一个100 mL的聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压釜中，保存在180 °C下12 h。之后，生成的黄色沉积物被过滤收集，用去离子水清洗三次。最终，在60 °C在真空干燥得到产品钒酸银。紧接着，将100 mg钒酸银分散到70mL去离子水中超声30 min，然后40 mg一水合硝酸铟加入并持续搅拌30 min获得均匀的混合物后转移到一个100 mL的聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压釜中，在140 °C下保存8 h。冷却后，离心收集的固体产品并在60 °C下真空干燥10 h获得钒酸银/钒酸铟复合材料；

（2）四苯乙烯纳米簇的制备

采用脱溶法，制备了四苯乙烯纳米晶。将0.5 mg 四苯乙烯粉末溶解于0.5 mL四氢呋喃中，得到均匀无色的四苯乙烯溶液。随后，用5 mL去离子水在室温下超声分散10 mg 牛血清白蛋白。然后将0.5 mL 四苯乙烯在超声下缓慢注入牛血清白蛋白溶液中，室温搅拌2 h。最后用水和无水乙醇洗涤后放入真空干燥箱中干燥得到四苯乙烯纳米晶粉末；

（3）复合发光体的制备

取2 mg钒酸银/钒酸铟复合材料在1 M的巯基乙酸溶液中浸泡12 h后离心去除上清液并分散在1 mL水中，将步骤2中制备的四苯乙烯纳米晶溶于1 mL水中，混合两溶液，保持震荡8 h，离心洗涤，获得复合发光体材料的粉末。

3. 如权利要求1所述的一种基于钒酸银/钒酸铟纳米复合材料的电化学发光传感器制备方法及应用，其特征在于，所述氧化铜标记的原降钙素检测抗体溶液的制备，包括以下步骤：

（1）氧化铜纳米球的制备

将20~50 mL 0.04 M 醋酸铜溶液与5~20 mL 0.02 M 2，5 -二甲氧基苯胺溶液在搅拌下混合，直到混合物变成深绿色。然后将混合物转移到100 mL聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压反应釜中，在100~200 °C下加热1~3 h。制备出来的材料用乙醇清洗，然后在室温下干燥。由此合成了具有特殊三维层次结构的氧化亚铜纳米球。将获得的粉末放置在马弗炉中在500 °C下保持3 h，获得氧化铜纳米球；

（2）氧化铜纳米球捕获抗体孵化液的制备

将（1）步骤中获得的产物，分散到5~20 mL乙醇中形成稳定分散液，加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，在30~150 °C下回流0.5~3.5 h，然后放入35 °C真空干燥箱中干燥6~18 h，得到氨基化的氧化铜纳米球，将其分散在1 mL 蒸馏水中。接着，将1mL 10 ng/mL HWRGWVC多肽链溶液加入上述溶液中，在4 °C振荡1 h。12000 转/分离心后，将沉淀物分散到1 mL pH7.4的磷酸盐缓冲溶液中。随后100~300 μL 0.1% 牛血清白蛋白的加入溶液中用来封闭特异性活性位点。离心分离和洗涤后；随后加入100~300 μL 10 mg/mL的原降钙素抗原的捕获抗体，在4°C下孵化6~12 h；随后离心去除上清液，重新分散到在1 mL pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中，得到氧化铜纳米球捕获抗体孵化液，储存在4 °C下备用。

4. 如权利要求1所述的一种基于钒酸银纳米复合材料的电化学发光传感器制备方法及应用，用于样品的检测，其特征在于，步骤如下：

（1）使用电化学工作站的三电极体系进行测试，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，所制备的电化学发光传感器为工作电极，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起将光电倍增管的高压设置为700 V，循环伏安扫描电位范围为-1.15~0 V，扫描速率为0.12 V/s；

（2）将处理完毕的电致化学发光传感器浸入在10 mL、pH 6.5~8.6的含浓度为0.5~1.5mol/L过硫酸钾的磷酸盐缓冲溶液中，接通电化学发光系统，孵化不同浓度的原降钙素时传感器进行测试，根据产生的不同的电化学发光信号强度，绘制工作曲线；

（3）将待测样品溶液代替待测物抗原进行检测。

本发明的有益成果

（1）以钒酸银/钒酸铟复合纳米材料为基底材料，一方面克服了传统发光材料难以直接固载于电极表面的缺点，另一方面其特殊的结构和巨大的比表面积有利于电子的传输和位点提供；（2）利用四苯乙烯纳米簇在低电位下就可以激发的优势以及高且稳定的发光效率来提高传感器信号的输出，从而获得对抗体抗原的蛋白活性保护的效果及高的灵敏度；

（3）以氧化铜纳米球作为猝灭剂，两种化合物的有效结合使得猝灭效果取得了良好的提升，除此之外，氧化铜具有更好的生物相容性，从而有效地增加抗体的固载量，整体实现了电致化学发光信号的有效控制；

（4）采用HWRGWVC多肽链作为特异性捕获体，实现抗体的定向位点捕获。该方法使蛋白的抗体活性获得了保护，提高了蛋白的有效利用率；

（5）本发明首次四苯乙烯纳米簇与氧化铜纳米球这一新型共振能量转移对。基于此构建的传感器可应用于疾病标志物的临床检测，具有操作简单，反应快速，信号响应范围宽为0.01 pg/mL~500 ng/mL，检出限极低的优点。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1四苯乙烯纳米簇的制备

（1）钒酸银/钒酸铟复合纳米材料的制备

在60 mL去离子水中加入1.0 mmol的偏钒酸铵，在磁搅拌下得到均相溶液。随后，1.0mmol的硝酸银的加入上述溶液中，并在磁力下搅拌20 min。这种混合溶液的pH值使用质量浓度为28 %的一水合氨调整到8.0。获得的混合物转移到一个100 mL的聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压釜中，保存在180 °C下12 h。之后，生成的黄色沉积物被过滤收集，用去离子水清洗三次。最终，在60 °C在真空干燥得到产品钒酸银。紧接着，将100 mg钒酸银分散到70mL去离子水中超声30 min，然后40 mg一水合硝酸铟加入并持续搅拌30 min获得均匀的混合物后转移到一个100 mL的聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压釜中，在140 °C下保存8 h。冷却后，离心收集的固体产品并在60 °C下真空干燥10 h获得钒酸银/钒酸铟复合材料；

（2）四苯乙烯纳米簇的制备

采用脱溶法，制备了四苯乙烯纳米晶。将0.5 mg 四苯乙烯粉末溶解于0.5 mL四氢呋喃中，得到均匀无色的四苯乙烯溶液。随后，用5 mL去离子水在室温下超声分散10 mg 牛血清白蛋白。然后将0.5 mL 四苯乙烯在超声下缓慢注入牛血清白蛋白溶液中，室温搅拌2 h。最后用水和无水乙醇洗涤后放入真空干燥箱中干燥得到四苯乙烯纳米晶粉末；

（3）复合发光体的制备

取2 mg钒酸银/钒酸铟复合材料在1 M的巯基乙酸溶液中浸泡12 h后离心去除上清液并分散在1 mL水中，将步骤2中制备的四苯乙烯纳米晶溶于1 mL水中，混合两溶液，保持震荡8 h，离心洗涤，获得复合发光体材料的粉末。

实施例2氧化铜标记的原降钙素检测抗体溶液的制备

（1）氧化铜纳米球的制备

将40 mL 0.04 M 醋酸铜溶液与10 mL 0.02 M 2，5 -二甲氧基苯胺溶液在搅拌下混合，直到混合物变成深绿色。然后将混合物转移到100 mL聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压反应釜中，在180 °C下加热2 h。制备出来的材料用乙醇清洗，然后在室温下干燥。由此合成了具有特殊三维层次结构的氧化亚铜纳米球。将获得的粉末放置在马弗炉中在500 °C下保持3 h，获得氧化铜纳米球；

（2）氧化铜纳米球捕获抗体孵化液的制备

将（1）步骤中获得的产物，分散到5 mL乙醇中形成稳定分散液，加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，在100 °C下回流1 h，然后放入35 °C真空干燥箱中干燥6 h，得到氨基化的氧化铜纳米球，将其分散在1 mL 蒸馏水中。接着，将1mL 10 ng/mL HWRGWVC多肽链溶液加入上述溶液中，在4 °C振荡1 h。12000 转/分离心后，将沉淀物分散到1 mL pH7.4的磷酸盐缓冲溶液中。随后100 μL 0.1% 牛血清白蛋白的加入溶液中用来封闭特异性活性位点。离心分离和洗涤后；随后加入100 μL 10 mg/mL的原降钙素抗原的捕获抗体，在4°C下孵化6 h；随后离心去除上清液，重新分散到在1 mL pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中，得到氧化铜纳米球捕获抗体孵化液，储存在4 °C下备用。

实施例3氧化铜标记的原降钙素检测抗体溶液的制备

（1）氧化铜纳米球的制备

将50 mL 0.04 M 醋酸铜溶液与20 mL 0.02 M 2，5 -二甲氧基苯胺溶液在搅拌下混合，直到混合物变成深绿色。然后将混合物转移到100 mL聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压反应釜中，在150 °C下加热2 h。制备出来的材料用乙醇清洗，然后在室温下干燥。由此合成了具有特殊三维层次结构的氧化亚铜纳米球。将获得的粉末放置在马弗炉中在500 °C下保持3 h，获得氧化铜纳米球；

（2）氧化铜纳米球捕获抗体孵化液的制备

将（1）步骤中获得的产物，分散到20 mL乙醇中形成稳定分散液，加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，在150 °C下回流3.5 h，然后放入35 °C真空干燥箱中干燥18 h，得到氨基化的氧化铜纳米球，将其分散在1 mL 蒸馏水中。接着，将1mL 10 ng/mL HWRGWVC多肽链溶液加入上述溶液中，在4 °C振荡1 h。12000 转/分离心后，将沉淀物分散到1 mL pH7.4的磷酸盐缓冲溶液中。随后300 μL 0.1% 牛血清白蛋白的加入溶液中用来封闭特异性活性位点。离心分离和洗涤后；随后加入300 μL 10 mg/mL的原降钙素抗原的捕获抗体，在4°C下孵化12 h；随后离心去除上清液，重新分散到在1 mL pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中，得到氧化铜纳米球捕获抗体孵化液，储存在4 °C下备用。

实施例4氧化铜标记的原降钙素检测抗体溶液的制备

（1）氧化铜纳米球的制备

将40 mL 0.04 M 醋酸铜溶液与10 mL 0.02 M 2，5 -二甲氧基苯胺溶液在搅拌下混合，直到混合物变成深绿色。然后将混合物转移到100 mL聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压反应釜中，在180 °C下加热2 h。制备出来的材料用乙醇清洗，然后在室温下干燥。由此合成了具有特殊三维层次结构的氧化亚铜纳米球。将获得的粉末放置在马弗炉中在500 °C下保持3 h，获得氧化铜纳米球；

（2）氧化铜纳米球捕获抗体孵化液的制备

将（1）步骤中获得的产物，分散到10 mL乙醇中形成稳定分散液，加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，在120 °C下回流2.5 h，然后放入35 °C真空干燥箱中干燥10 h，得到氨基化的氧化铜纳米球，将其分散在1 mL 蒸馏水中。接着，将1mL 10 ng/mL HWRGWVC多肽链溶液加入上述溶液中，在4 °C振荡1 h。12000 转/分离心后，将沉淀物分散到1 mL pH7.4的磷酸盐缓冲溶液中。随后100 μL 0.1% 牛血清白蛋白的加入溶液中用来封闭特异性活性位点。离心分离和洗涤后；随后加入200 μL 10 mg/mL的原降钙素抗原的捕获抗体，在4°C下孵化10 h；随后离心去除上清液，重新分散到在1 mL pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中，得到氧化铜纳米球捕获抗体孵化液，储存在4 °C下备用。

实施例5 制备检测原降钙素的电致化学发光免疫传感器

（1）依次用1.0、0.3、0.05 μm的氧化铝粉末对玻碳电极进行抛光，在超纯水和乙醇中超声清洗，氮气吹干；

（2）在处理好的电极表面滴加6 μL、浓度为0.5 mg/mL的四苯乙烯纳米簇分散液作为传感基底材料，4 °C下晾干成膜；

（3）加入5 mM巯基乙酸在4 °C下浸泡5 h后转入EDC/NHS混合体系中浸泡30 min来活化羧基；

（4）继续在4 °C条件下浸泡浓度为5 μg/mL的原降钙素抗体 1 h，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液洗净电极表面，4 °C下晾干；

（5）在质量浓度为2%的牛血清白蛋白中浸泡来封闭非特异性活性位点，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面，常温下晾干；

（6）滴加6 μL、浓度为0.0001~50 ng/mL的原降钙素抗原，在室温下孵化1 h后，用pH7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面，室温下晾干；

（7）继续滴加6 μL、浓度为3 mg/mL的氧化铜捕获抗体孵化液于电极表面，室温下孵化1h，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液缓慢冲洗电极表面，室温下晾干；

（8）传感器构建完毕，进行电致化学发光测试。

实施例6 制备检测原降钙素电致化学发光免疫传感器

（1）依次用1.0、0.3、0.05 μm的氧化铝粉末对玻碳电极进行抛光，在超纯水和乙醇中超声清洗，氮气吹干；

（2）在处理好的电极表面滴加6 μL、浓度为2 mg/mL的四苯乙烯纳米簇分散液作为传感基底材料，4 °C下晾干成膜；

（3）加入3 mM巯基乙酸在4 °C下浸泡5 h后转入EDC/NHS混合体系中浸泡30 min来活化羧基；

（4）继续在4 °C条件下浸泡浓度为10 μg/mL的原降钙素抗体 1 h，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液洗净电极表面，4 °C下晾干；

（5）在质量浓度为1 %的牛血清白蛋白中浸泡来封闭非特异性活性位点，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面，常温下晾干；

（6）滴加6 μL、浓度为0.0001~50 ng/mL的原降钙素抗原，在室温下孵化1 h后，用pH7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面，室温下晾干；

（7）继续滴加6 μL、浓度为2 mg/mL的氧化铜捕获抗体孵化液于电极表面，室温下孵化1h，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液缓慢冲洗电极表面，室温下晾干；

（8）传感器构建完毕，进行电致化学发光测试。

实施例7 对原降钙素的检测

（1）使用电化学工作站的三电极体系进行测试，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，所制备的电化学发光传感器为工作电极，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起将光电倍增管的高压设置为700 V，循环伏安扫描电位范围为-1.15~0 V，扫描速率为0.15 V/s；

（2）将处理完毕的电致化学发光传感器浸入在10 mL、pH 6.5的含浓度为1.5 mol/L过硫酸钾的磷酸盐缓冲溶液中，接通电化学发光系统，孵化不同浓度的原降钙素时传感器进行测试，根据产生的不同的电化学发光信号强度，绘制工作曲线；

（3）将待测样品溶液代替待测物抗原进行检测。

实施例8 对原降钙素的检测

（1）使用电化学工作站的三电极体系进行测试，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，所制备的电化学发光传感器为工作电极，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起将光电倍增管的高压设置为700 V，循环伏安扫描电位范围为-1.15~0 V，扫描速率为0.12 V/s；

（2）将处理完毕的电致化学发光传感器浸入在10 mL、pH 7.6的含浓度为1 mol/L过硫酸钾的磷酸盐缓冲溶液中，接通电化学发光系统，孵化不同浓度的原降钙素时传感器进行测试，根据产生的不同的电化学发光信号强度，绘制工作曲线；

（3）将待测样品溶液代替待测物抗原进行检测。

实施例9 采用加标回收的方法对脑脊液中原降钙素的检测

（1）向稀释的血清中加入不同浓度的原降钙素；

（2）采用标准加入法测定样品中原降钙素的平均回收率；

（3）采用F，T检验测定样品中原降钙素，得出相应的F值，T值，结果见表1；

表1 样品中原降钙素的检测结果

表1检测结果可以看出，所得出的F值，T值都小于相应置信区间的标准值，因此，表明本发明可以应用于实际生物样品的检测，结果准确可靠。

Claims (4)

1.一种基于钒酸银/钒酸铟纳米复合材料的电化学发光传感器制备方法及应用，其特征在于，包括以下步骤：

（1）依次用1.0、0.3、0.05 μm的氧化铝粉末对玻碳电极进行抛光，在超纯水和乙醇中超声清洗，氮气吹干；

（2）在处理好的电极表面滴加6 μL、浓度为0.5~5 mg/mL的四苯乙烯纳米簇分散液作为传感基底材料，4 °C下晾干成膜；

（3）加入3~8 mM巯基乙酸在4 °C下浸泡5 h后转入EDC/NHS混合体系中浸泡30 min来活化羧基；

（4）继续在4 °C条件下浸泡浓度为5~15 μg/mL的原降钙素抗体1 h，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液洗净电极表面，4°C下晾干；

（5）在质量浓度为1~3%的牛血清白蛋白中浸泡来封闭非特异性活性位点，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面，常温下晾干；

（6）滴加6 μL、浓度为0.0001~50 ng/mL的原降钙素抗原，在室温下孵化1 h后，用pH7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面，室温下晾干；

（7）继续滴加6 μL、浓度为2~4 mg/mL的氧化铜复合纳米晶捕获抗体孵化液于电极表面，室温下孵化1 h，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液缓慢冲洗电极表面，室温下晾干；

（8）传感器构建完毕，进行电致化学发光测试。

2.如权利要求1所述的一种基于钒酸银/钒酸铟纳米复合材料的电化学发光传感器制备方法及应用，其特征在于，所述基底材料钒酸银/钒酸铟复合纳米材料的制备，包括以下步骤：

（1）钒酸银/钒酸铟复合纳米材料的制备

在60 mL去离子水中加入1.0 mmol的偏钒酸铵，在磁搅拌下得到均相溶液;

随后，1.0 mmol的硝酸银的加入上述溶液中，并在磁力下搅拌20 min;

这种混合溶液的pH值使用质量浓度为28 %的一水合氨调整到8.0;

获得的混合物转移到一个100 mL的聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压釜中，保存在180 °C下12 h;

之后，生成的黄色沉积物被过滤收集，用去离子水清洗三次;

最终，在60 °C在真空干燥得到产品钒酸银;

紧接着，将100 mg钒酸银分散到70 mL去离子水中超声30 min，然后40 mg一水合硝酸铟加入并持续搅拌30 min获得均匀的混合物后转移到一个100 mL的聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压釜中， 在140 °C下保存8 h;

冷却后，离心收集的固体产品并在60 °C下真空干燥10 h获得钒酸银/钒酸铟复合材料；

（2）四苯乙烯纳米簇的制备

采用脱溶法，制备了四苯乙烯纳米晶;

将0.5 mg 四苯乙烯粉末溶解于0.5 mL四氢呋喃中，得到均匀无色的四苯乙烯溶液;

随后，用5 mL去离子水在室温下超声分散10 mg 牛血清白蛋白;

然后将0.5 mL 四苯乙烯在超声下缓慢注入牛血清白蛋白溶液中，室温搅拌2 h;

最后用水和无水乙醇洗涤后放入真空干燥箱中干燥得到四苯乙烯纳米晶粉末；

（3）复合发光体的制备

取2 mg钒酸银/钒酸铟复合材料在1 M的巯基乙酸溶液中浸泡12 h后离心去除上清液并分散在1 mL水中，将步骤2中制备的四苯乙烯纳米晶溶于1 mL水中，混合两溶液，保持震荡8 h，离心洗涤，获得复合发光体材料的粉末。

3.如权利要求1所述的一种基于钒酸银/钒酸铟纳米复合材料的电化学发光传感器制备方法及应用，其特征在于，所述氧化铜标记的原降钙素检测抗体溶液的制备，包括以下步骤：

（1）氧化铜纳米球的制备

将20~50 mL 0.04 M 醋酸铜溶液与5~20 mL 0.02 M 2，5 -二甲氧基苯胺溶液在搅拌下混合，直到混合物变成深绿色;

然后将混合物转移到100 mL聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压反应釜中，在100~200 °C下加热1~3 h;

制备出来的材料用乙醇清洗，然后在室温下干燥;

由此合成了具有特殊三维层次结构的氧化亚铜纳米球;

将获得的粉末放置在马弗炉中在500 °C下保持3 h，获得氧化铜纳米球；

（2）氧化铜纳米球捕获抗体孵化液的制备

将（1）步骤中获得的产物，分散到5~20 mL乙醇中形成稳定分散液，加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，在30~150 °C下回流0.5~3.5 h，然后放入35 °C真空干燥箱中干燥6~18 h，得到氨基化的氧化铜纳米球，将其分散在1 mL 蒸馏水中;

接着，将1mL 10 ng/mL HWRGWVC多肽链溶液加入上述溶液中，在4 °C振荡1 h;

12000 转/分离心后，将沉淀物分散到1 mL pH7.4的磷酸盐缓冲溶液中;

随后100~300 μL 0.1% 牛血清白蛋白的加入溶液中用来封闭特异性活性位点;

离心分离和洗涤后；随后加入100~300 μL 10 mg/mL的原降钙素抗原的捕获抗体，在4°C下孵化6~12 h；随后离心去除上清液，重新分散到在1 mL pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中，得到氧化铜纳米球捕获抗体孵化液，储存在4 °C下备用。

4.如权利要求1所述的一种基于钒酸银纳米复合材料的电化学发光传感器制备方法及应用，用于样品的检测，其特征在于，步骤如下：

（1）使用电化学工作站的三电极体系进行测试，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，所制备的电化学发光传感器为工作电极，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起将光电倍增管的高压设置为700 V，循环伏安扫描电位范围为-1.15~0 V，扫描速率为0.12 V/s；

（2）将处理完毕的电致化学发光传感器浸入在10 mL、pH 6.5~8.6的含浓度为0.5~1.5mol/L过硫酸钾的磷酸盐缓冲溶液中，接通电化学发光系统，孵化不同浓度的原降钙素时传感器进行测试，根据产生的不同的电化学发光信号强度，绘制工作曲线；

（3）将待测样品溶液代替待测物抗原进行检测。