CN110441297B - 一种基于四苯乙烯纳米簇的电化学发光传感器制备方法 - Google Patents

一种基于四苯乙烯纳米簇的电化学发光传感器制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于四苯乙烯纳米簇的电化学发光猝灭型传感器制备方法及应用，属于电化学发光检测技术领域。开发并首次验证了四苯乙烯纳米簇与二硫化锡/二氧化锡复合纳米晶能量转移对在低电位下可达到的高效电化学发光猝灭的行为，一方面解决了发光材料在电极上的固定问题，另一方面解决了有效调节发光强度的问题。根据对不同浓度的原降钙素响应的电化学发光信号强度不同，实现对原降钙素的检测。通过采用F检验、T检验展示本方法的准确度和精密度，测试结果均小于理论值，说明该方法准确可靠。

Description

一种基于四苯乙烯纳米簇的电化学发光传感器制备方法
技术领域
本发明涉及一种基于四苯乙烯纳米簇作为新的低电位电化学发光发射器并与二硫化锡/二氧化锡纳米晶发生能量转移的传感器制备及应用，具体是采用四苯乙烯纳米簇作为发光材料，二硫化锡/二氧化锡作为猝灭探针，并且采用多肽链实现对抗体的定向固定，实现了在-1.15 V的低电位激发，有效保护了蛋白质的活性，提高对免疫物质检测的可行性，综上制备的一种检测原降钙素的猝灭型电化学发光传感器，属于电化学发光检测技术领域。
背景技术
SIRS指全身炎症反应即机体对多种细胞因子/炎症介质的反应。内毒素是全身炎症反应SIR的触发因素，目前尚无明显的治疗方法。因此，原降钙素作为血清中SIRS的典型生物标志物，对SIRS的早期准确可靠诊断起着至关重要的作用。
目前检测原降钙素的分析方法有很多。比如：放射免疫分析法、酶联免疫分析法等。但是上述方法存在诸多缺点：所用的试剂有效期短，具有放射性污染，检测周期长，灵敏度低，步骤繁琐等。为了克服这些缺点，本发明设计了一种特异性强、灵敏度高、无放射性污染、操作快速简便的电致化学发光免疫分析方法。
电化学发光是电化学和化学发光互相交叉渗透的产物，因此同时具备发光分析的超高灵敏度与电化学电位可控的优点，所以引起了分析化学和生物分析等诸多领域的高度重视。传统的发光材料虽然具有优秀的发光效果但是难以固载于电极表面，然而新兴的许多发光体，例如硫化镉等镉基材料却有很高生物毒性并且必须施加高电位激发。因此，无毒、低电位激发且电极固载性好的发光材料成为了研究的重点。因此，本发明以四苯乙烯纳米簇作为基底，以二硫化锡/二氧化锡作为猝灭探针，构建了一种猝灭型的电致化学发光传感器用于原降钙素的检测。
发明内容
本发明的目的是针对现有传感器的发光材料发光效率优秀但毒性大或难于固载于电极表面等缺点提供一种适合的新型发光材料，并且针对现有的全身炎症反应综合症的检测方法存在的问题，提供一种新颖的基于二硫化锡/二氧化锡猝灭四苯乙烯纳米簇的电致化学发光免疫传感器的制备并实行对实际样品的检测应用，实现对全身炎症反应综合症的疾病标志物的快速、灵敏、特异、高效检。整个方法的投入能耗低，获得的效果理想，具有良好的应用前景。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
1. 一种基于四苯乙烯纳米簇的电化学发光传感器制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）四苯乙烯纳米簇的制备
采用脱溶法，制备了四苯乙烯纳米晶。将0.2~0.6 mg 四苯乙烯粉末溶解于0.3~0.6 mL四氢呋喃中，得到均匀无色的四苯乙烯溶液。随后，用5~10 mL去离子水在室温下超声分散3~10 mg 牛血清白蛋白。然后将0.5~1.0 mL 四苯乙烯在超声下缓慢注入牛血清白蛋白溶液中，室温搅拌2~5 h。最后用水和无水乙醇洗涤后放入真空干燥箱中干燥得到四苯乙烯纳米晶粉末。
（2）二硫化锡/二氧化锡纳米晶标记的原降钙素检测抗体溶液的制备
1）二硫化锡/二氧化锡纳米晶的制备
采用简单的一步水热法。将2.0~8.0 mmol 五水合四氯化锡通过超声处理加入15~50 mL超纯水中5~20 min，再将2.0~12.0 mmol硫代乙酰胺加入上述混合体系中搅拌10~40min，得到的混合溶液转移到50 mL聚四氟乙烯内衬的高压釜中加热至100~250℃并保持6h，通过蒸馏水及无水乙醇的轮流洗涤并干燥获得产物；
2）二硫化锡/二氧化锡纳米晶捕获抗体孵化液的制备
将1）步骤中获得的产物，分散到5~20 mL乙醇中形成稳定分散液，加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，在30~150℃下回流0.5~3.5 h，然后放入35℃真空干燥箱中干燥6~18 h，得到氨基化的二硫化锡/二氧化锡纳米晶，将其分散在1 mL 蒸馏水中。接着，将1mL 10 ng/mLHWRGWVC多肽链溶液加入上述溶液中，在4 °C振荡1 h。12000 转/分离心后，将沉淀物分散到1 mL pH7.4的磷酸盐缓冲溶液中。随后100~300 μL 0.1% 牛血清白蛋白的加入溶液中用来封闭特异性活性位点。离心分离和洗涤后；随后加入100~300 μL 10 mg/mL的原降钙素抗原的捕获抗体，在4°C下孵化6~12 h；随后离心去除上清液，重新分散到在1 mL pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中，得到二硫化锡/二氧化锡纳米晶捕获抗体孵化液，储存在4 °C下备用。
（3）传感器的制备
1）依次用1.0、0.3、0.05 μm的氧化铝粉末对玻碳电极进行抛光，在超纯水和乙醇中超声清洗，氮气吹干；
2）在处理好的电极表面滴加6 μL、浓度为0.5~5 mg/mL的四苯乙烯纳米簇分散液作为传感基底材料，4 °C下晾干成膜；
3）加入3~8 mM巯基乙酸在4 °C下浸泡5 h后转入EDC/NHS混合体系中浸泡30 min来活化羧基；
4）继续在4 °C条件下浸泡浓度为5~15 μg/mL的原降钙素抗体1 h，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液洗净电极表面，4°C下晾干；
5）在质量浓度为1~3%的牛血清白蛋白中浸泡来封闭非特异性活性位点，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面，常温下晾干；
6）滴加6 μL、浓度为0.0001~50 ng/mL的原降钙素抗原，在室温下孵化1 h后，用pH7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面，室温下晾干；
7）继续滴加6 μL、浓度为2~4 mg/mL的二硫化锡/二氧化锡复合纳米晶捕获抗体孵化液于电极表面，室温下孵化1 h，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液缓慢冲洗电极表面，室温下晾干；
8）传感器构建完毕，进行电致化学发光测试。
2. 所述的一种基于四苯乙烯纳米簇的电化学发光传感器制备方法，用于样品的检测，其特征在于，步骤如下：
（1）使用电化学工作站的三电极体系进行测试，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，所制备的电化学发光传感器为工作电极，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起将光电倍增管的高压设置为700 V，循环伏安扫描电位范围为-1.15~0 V，扫描速率为0.12 V/s；
（2）将处理完毕的电致化学发光传感器浸入在10 mL、pH 6.5~8.6的含浓度为0.5~1.5 mol/L过硫酸钾的磷酸盐缓冲溶液中，接通电化学发光系统，孵化不同浓度的原降钙素时传感器进行测试，根据产生的不同的电化学发光信号强度，绘制工作曲线；
（3）将待测样品溶液代替待测物抗原进行检测。
本发明的有益成果
（1）以四苯乙烯纳米簇为发光材料，一方面克服了传统发光材料难以直接固载于电极表面的缺点，另一方面其巨大的比表面积有利于电子的传输，并且利用四苯乙烯纳米簇在低电位下就可以激发的优势以及高且稳定的发光效率来提高传感器信号的输出，从而获得对抗体抗原的蛋白活性保护的效果及高的灵敏度；
（2）以二硫化锡/二氧化锡作为猝灭剂，两种化合物的有效结合使得猝灭效果取得了良好的提升，除此之外，二硫化锡/二氧化锡具有更好的生物相容性，从而有效地增加抗体的固载量，整体实现了电致化学发光信号的有效控制；
（3）采用HWRGWVC多肽链作为特异性捕获体，实现抗体的定向位点捕获。该方法使蛋白的抗体活性获得了保护，提高了蛋白的有效利用率；
（4）本发明首次四苯乙烯纳米簇与二硫化锡/二氧化锡这一新型共振能量转移对。基于此构建的传感器可应用于疾病标志物的临床检测，具有操作简单，反应快速，信号响应范围宽为0.01 pg/mL~500 ng/mL，检出限极低至0.402 fg/mL的优点。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1四苯乙烯纳米簇的制备
1）四苯乙烯纳米簇的制备
采用脱溶法，制备了四苯乙烯纳米晶。将0.5 mg 四苯乙烯粉末溶解于0.5 mL四氢呋喃中，得到均匀无色的四苯乙烯溶液。随后，用5 mL去离子水在室温下超声分散10 mg 牛血清白蛋白。然后将0.5 mL 四苯乙烯在超声下缓慢注入牛血清白蛋白溶液中，室温搅拌2h。最后用水和无水乙醇洗涤后放入真空干燥箱中干燥得到四苯乙烯纳米晶粉末。
实施例2 二硫化锡/二氧化锡纳米晶标记的原降钙素捕获抗体孵化液的制备
（1）二硫化锡/二氧化锡纳米晶的制备
采用简单的一步水热法。将2.0 mmol 五水合四氯化锡通过超声处理加入15 mL超纯水中5 min，再将2.0 mmol硫代乙酰胺加入上述混合体系中搅拌10 min，得到的混合溶液转移到50 mL聚四氟乙烯内衬的高压釜中加热至100℃并保持6 h，通过蒸馏水及无水乙醇的轮流洗涤并干燥获得产物；
（2）二硫化锡/二氧化锡纳米晶捕获抗体孵化液的制备
将（1）步骤中获得的产物，分散到5~20 mL乙醇中形成稳定分散液，加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，在30℃下回流0.5 h，然后放入35℃真空干燥箱中干燥6 h，得到氨基化的二硫化锡/二氧化锡纳米晶，将其分散在1 mL 蒸馏水中。接着，将1mL 10 ng/mL HWRGWVC多肽链溶液加入上述溶液中，在4 °C振荡1 h。12000 转/分离心后，将沉淀物分散到1 mL pH7.4的磷酸盐缓冲溶液中。随后100 μL 0.1% 牛血清白蛋白的加入溶液中用来封闭特异性活性位点。离心分离和洗涤后；随后加入100 μL 10 mg/mL的原降钙素抗原的捕获抗体，在4°C下孵化6 h；随后离心去除上清液，重新分散到在1 mL pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中，得到二硫化锡/二氧化锡纳米晶捕获抗体孵化液，储存在4 °C下备用。
实施例3二硫化锡/二氧化锡纳米晶标记的原降钙素捕获抗体孵化液的制备
（1）二硫化锡/二氧化锡纳米晶的制备
采用简单的一步水热法。将5.0 mmol 五水合四氯化锡通过超声处理加入30 mL超纯水中10 min，再将8.0 mmol硫代乙酰胺加入上述混合体系中搅拌30 min，得到的混合溶液转移到50 mL聚四氟乙烯内衬的高压釜中加热至190℃并保持6 h；
（2）二硫化锡/二氧化锡纳米晶捕获抗体孵化液的制备
将（1）步骤中获得的产物，分散到10 mL乙醇中形成稳定分散液，加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，在70℃下回流1.5 h，然后放入35℃真空干燥箱中干燥12h，得到氨基化的二硫化锡/二氧化锡纳米晶，将其分散在1 mL 蒸馏水中。接着，将1mL 10 ng/mL HWRGWVC多肽链溶液加入上述溶液中，在4 °C振荡1 h。12000 转/分离心后，将沉淀物分散到1 mL pH7.4的磷酸盐缓冲溶液中。随后200 μL 0.1% 牛血清白蛋白的加入溶液中用来封闭特异性活性位点。离心分离和洗涤后；随后加入100 μL 10 mg/mL的原降钙素抗原的捕获抗体，在4°C下孵化10 h；随后离心去除上清液，重新分散到在1 mL pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中，得到二硫化锡/二氧化锡纳米晶捕获抗体孵化液，储存在4 °C下备用。
实施例4二硫化锡/二氧化锡纳米晶标记的原降钙素捕获抗体孵化液的制备
（1）二硫化锡/二氧化锡纳米晶的制备
采用简单的一步水热法。将7.0 mmol 五水合四氯化锡通过超声处理加入50 mL超纯水中15 min，再将10.0 mmol硫代乙酰胺加入上述混合体系中搅拌50 min，得到的混合溶液转移到50 mL聚四氟乙烯内衬的高压釜中加热至220℃并保持6 h；
（2）二硫化锡/二氧化锡纳米晶捕获抗体孵化液的制备
将（1）步骤中获得的产物，分散到10 mL乙醇中形成稳定分散液，加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，在90℃下回流2 h，然后放入45℃真空干燥箱中干燥12h，得到氨基化的二硫化锡/二氧化锡纳米晶，将其分散在1 mL 蒸馏水中。接着，将1mL 10 ng/mL HWRGWVC多肽链溶液加入上述溶液中，在4 °C振荡1 h。12000 转/分离心后，将沉淀物分散到1 mL pH7.4的磷酸盐缓冲溶液中。随后200 μL 0.1% 牛血清白蛋白的加入溶液中用来封闭特异性活性位点。离心分离和洗涤后；随后加入300 μL 10 mg/mL的原降钙素抗原的捕获抗体，在4°C下孵化10 h；随后离心去除上清液，重新分散到在1 mL pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中，得到二硫化锡/二氧化锡纳米晶捕获抗体孵化液，储存在4 °C下备用。
实施例5 制备检测原降钙素的电致化学发光免疫传感器
（1）依次用1.0、0.3、0.05 μm的氧化铝粉末对玻碳电极进行抛光，在超纯水和乙醇中超声清洗，氮气吹干；
（2）在处理好的电极表面滴加6 μL、浓度为0.5 mg/mL的四苯乙烯纳米簇分散液作为传感基底材料，4 °C下晾干成膜；
（3）加入5 mM巯基乙酸在4 °C下浸泡5 h后转入EDC/NHS混合体系中浸泡30 min来活化羧基；
（4）继续在4 °C条件下浸泡浓度为5 μg/mL的原降钙素抗体 1 h，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液洗净电极表面，4 °C下晾干；
（5）在质量浓度为2%的牛血清白蛋白中浸泡来封闭非特异性活性位点，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面，常温下晾干；
（6）滴加6 μL、浓度为0.0001~50 ng/mL的原降钙素抗原，在室温下孵化1 h后，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面，室温下晾干；
（7）继续滴加6 μL、浓度为3 mg/mL的二硫化锡/二氧化锡捕获抗体孵化液于电极表面，室温下孵化1 h，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液缓慢冲洗电极表面，室温下晾干；
（8）传感器构建完毕，进行电致化学发光测试。
实施例6 制备检测原降钙素电致化学发光免疫传感器
（1）依次用1.0、0.3、0.05 μm的氧化铝粉末对玻碳电极进行抛光，在超纯水和乙醇中超声清洗，氮气吹干；
（2）在处理好的电极表面滴加6 μL、浓度为2 mg/mL的四苯乙烯纳米簇分散液作为传感基底材料，4 °C下晾干成膜；
（3）加入3 mM巯基乙酸在4 °C下浸泡5 h后转入EDC/NHS混合体系中浸泡30 min来活化羧基；
（4）继续在4 °C条件下浸泡浓度为10 μg/mL的原降钙素抗体 1 h，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液洗净电极表面，4 °C下晾干；
（5）在质量浓度为1 %的牛血清白蛋白中浸泡来封闭非特异性活性位点，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面，常温下晾干；
（6）滴加6 μL、浓度为0.0001~50 ng/mL的原降钙素抗原，在室温下孵化1 h后，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面，室温下晾干；
（7）继续滴加6 μL、浓度为2 mg/mL的二硫化锡/二氧化锡捕获抗体孵化液于电极表面，室温下孵化1 h，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液缓慢冲洗电极表面，室温下晾干；
（8）传感器构建完毕，进行电致化学发光测试。
实施例7 对原降钙素的检测
（1）使用电化学工作站的三电极体系进行测试，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，所制备的电化学发光传感器为工作电极，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起将光电倍增管的高压设置为700 V，循环伏安扫描电位范围为-1.15~0 V，扫描速率为0.15 V/s；
（2）将处理完毕的电致化学发光传感器浸入在10 mL、pH 6.5的含浓度为1.5 mol/L过硫酸钾的磷酸盐缓冲溶液中，接通电化学发光系统，孵化不同浓度的原降钙素时传感器进行测试，根据产生的不同的电化学发光信号强度，绘制工作曲线；
（3）将待测样品溶液代替待测物抗原进行检测。
实施例8 对原降钙素的检测
（1）使用电化学工作站的三电极体系进行测试，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，所制备的电化学发光传感器为工作电极，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起将光电倍增管的高压设置为700 V，循环伏安扫描电位范围为-1.15~0 V，扫描速率为0.12 V/s；
（2）将处理完毕的电致化学发光传感器浸入在10 mL、pH 7.6的含浓度为1 mol/L过硫酸钾的磷酸盐缓冲溶液中，接通电化学发光系统，孵化不同浓度的原降钙素时传感器进行测试，根据产生的不同的电化学发光信号强度，绘制工作曲线；
（3）将待测样品溶液代替待测物抗原进行检测。
实施例9 采用加标回收的方法对脑脊液中原降钙素的检测
（1）向稀释的血清中加入不同浓度的原降钙素；
（2）采用标准加入法测定样品中原降钙素的平均回收率；
（3）采用F，T检验测定样品中原降钙素，得出相应的F值，T值，结果见表1；
表1检测结果可以看出，所得出的F值，T值都小于相应置信区间的标准值，因此，表明本发明可以应用于实际生物样品的检测，结果准确可靠。
表1 样品中原降钙素的检测结果
Samplecontent ELISA (pg/mL) Mean(pg/mL) s RSD(%) This method(pg/mL) Mean(pg/mL) s RSD (%) Fvalue Ttest
PCT 7.59, 7.43, 7.52,7.51, 7.50 7.50 0.03 0.59 7.59, 7.63,7.57, 7.41, 7.65 7.46 0.05 0.74 1.71 1.79

Claims (2)

1.一种基于四苯乙烯纳米簇的电化学发光传感器制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）四苯乙烯纳米簇的制备
采用脱溶法，制备了四苯乙烯纳米晶： 将0.2~0.6 mg 四苯乙烯粉末溶解于0.3~0.6mL四氢呋喃中，得到均匀无色的四苯乙烯溶液， 随后，用5~10 mL去离子水在室温下超声分散3~10 mg 牛血清白蛋白， 然后将0.5~1.0 mL四苯乙烯在超声下缓慢注入牛血清白蛋白溶液中，室温搅拌2~5 h， 最后用水和无水乙醇洗涤后放入真空干燥箱中干燥得到四苯乙烯纳米晶粉末；
（2）二硫化锡/二氧化锡纳米晶标记的原降钙素检测抗体溶液的制备
1）二硫化锡/二氧化锡纳米晶的制备
采用简单的一步水热法： 将2.0~8.0 mmol五水合四氯化锡通过超声处理加入15~50mL超纯水中5~20 min，再将2.0~12.0 mmol硫代乙酰胺加入上述混合体系中搅拌10~40min，得到的混合溶液转移到50 mL聚四氟乙烯内衬的高压釜中加热至100~250℃并保持6h，通过蒸馏水及无水乙醇的轮流洗涤并干燥获得产物；
2）二硫化锡/二氧化锡纳米晶捕获抗体孵化液的制备
将1）步骤中获得的产物，分散到5~20 mL乙醇中形成稳定分散液，加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，在30~150℃下回流0.5~3.5 h，然后放入35℃真空干燥箱中干燥6~18 h，得到氨基化的二硫化锡/二氧化锡纳米晶，将其分散在1 mL蒸馏水中， 接着，将1mL 10 ng/mLHWRGWVC多肽链溶液加入上述溶液中，在4 °C振荡1 h， 12000 转/分离心后，将沉淀物分散到1 mL pH7.4的磷酸盐缓冲溶液中， 随后100~300 μL 0.1% 牛血清白蛋白的加入溶液中用来封闭特异性活性位点， 离心分离和洗涤后；随后加入100~300 μL 10 mg/mL的原降钙素抗原的捕获抗体，在4°C下孵化6~12 h；随后离心去除上清液，重新分散到在1 mL pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中，得到二硫化锡/二氧化锡纳米晶捕获抗体孵化液，储存在4 °C下备用；
（3）传感器的制备
1）依次用1.0、0.3、0.05 μm的氧化铝粉末对玻碳电极进行抛光，在超纯水和乙醇中超声清洗，氮气吹干；
2）在处理好的电极表面滴加6 μL、浓度为0.5~5 mg/mL的四苯乙烯纳米簇分散液作为传感基底材料，4 °C下晾干成膜；
3）加入3~8 mM巯基乙酸在4 °C下浸泡5 h后转入EDC/NHS混合体系中浸泡30 min来活化羧基；
4）继续在4 °C条件下浸泡浓度为5~15 μg/mL的原降钙素抗体1 h，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液洗净电极表面，4°C下晾干；
5）在质量浓度为1~3%的牛血清白蛋白中浸泡来封闭非特异性活性位点，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面，常温下晾干；
6）滴加6 μL、浓度为0.0001~50 ng/mL的原降钙素抗原，在室温下孵化1 h后，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面，室温下晾干；
7）继续滴加6 μL、浓度为2~4 mg/mL的二硫化锡/二氧化锡复合纳米晶捕获抗体孵化液于电极表面，室温下孵化1 h，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液缓慢冲洗电极表面，室温下晾干；
8）传感器构建完毕，进行电致化学发光测试。
2.如权利要求1所述的一种基于四苯乙烯纳米簇的电化学发光传感器制备方法，用于样品的检测，其特征在于，步骤如下：
（1）使用电化学工作站的三电极体系进行测试，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，所制备的电化学发光传感器为工作电极，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起将光电倍增管的高压设置为700 V，循环伏安扫描电位范围为-1.15~0 V，扫描速率为0.12 V/s；
（2）将处理完毕的电致化学发光传感器浸入在10 mL、pH 6.5~8.6的含浓度为0.5~1.5mol/L过硫酸钾的磷酸盐缓冲溶液中，接通电化学发光系统，孵化不同浓度的原降钙素时传感器进行测试，根据产生的不同的电化学发光信号强度，绘制工作曲线；
（3）将待测样品溶液代替待测物抗原进行检测。
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