CN112730562A - 一种检测泰妙菌素抗原的电化学免疫传感器及制备方法 - Google Patents

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李永欣
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Abstract

本发明提供了一种检测泰妙菌素抗原的电化学免疫传感器及制备方法。本发明将AgNPs原位还原至GO上获得Ag‑GO纳米复合材料表现出良好的导电性和氧化还原活性。全氟磺酸具有优良的成膜能力和高的化学稳定性，作为分散剂获得Ag‑GO‑Nf复合溶液，并用该复合溶液在基础电极表面进行修饰。随后，将金纳米粒子电沉积在Ag‑GO‑Nf表面，起到固定抗体和放大电化学信号的作用。本发明应用上述方法构建的电化学免疫传感器简便、高效、灵敏，不仅检测泰妙菌素抗原具有较宽的检测范围和较低的检测限，而且应用于检测动物源性食品如鸡蛋、猪肉和猪肝等样品中的泰妙菌素残留具有较好的准确性。

Description

一种检测泰妙菌素抗原的电化学免疫传感器及制备方法
技术领域
本发明涉及新型功能纳米材料、免疫分子和生物传感检测技术领域，特别是涉及一种检测泰妙菌素抗原的电化学免疫传感器及制备方法。
背景技术
泰妙菌素(Tiamulin，TIA)是由截短侧耳素发展而来的半合成双萜类兽药，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌具有良好的抗菌活性，其抗菌机制是通过与核糖体的肽基转移酶中心(peptidyl transferase center，PTC)结合从而抑制细菌蛋白的合成，主要用于治疗畜禽的慢性呼吸系统疾病。适量摄入TIA不仅能有效治疗疾病，而且能提高饲料转化率。然而，大剂量和/或持续使用TIA会增加抗生素耐药性，其在动物可食用组织中的残留可导致食欲不振、发热、共济失调等人类健康问题。为了确保食品安全，许多国家对TIA规定了最大残留限量(MRLs)，我国和欧盟制定的MRLs为猪肉中100μg/kg，猪肝中500μg/kg，鸡蛋中1000μg/kg，日本制定的鸡蛋中MRLs为200μg/kg。
目前，TIA的检测和分析方法多种多样。最常用的方法是色谱法，如高效液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)。虽然色谱法具有较低的检出限和较高的准确度，但该方法需要复杂的预处理过程、昂贵的仪器设备和专业的操作人员，阻碍了它在快速检测中的应用。
免疫分析法由于能快速、灵敏、高效地检测抗生素残留而得到迅速发展，已成为快速检测动物源性食品中抗生素残留的首选方法。目前对TIA快速检测的研究主要集中在传统的酶联免疫吸附法和胶体金免疫层析法，而电化学免疫分析法的研究相对较少。电化学免疫传感器结合了免疫分析的特异性和电化学传感器技术的敏感性，具有灵敏度高、选择性好、成本低、可用于复杂系统的监测等优点。所以亟需研究一种利用电化学免疫传感器对TIA快速检测的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测泰妙菌素抗原的电化学免疫传感器及制备方法，以解决上述现有技术存在的问题，本发明所设计、构建的检测泰妙菌素抗原的电化学免疫传感器实现了泰妙菌素的定量、灵敏检测，具有较宽的检测范围和较低的检测限，并具有良好的重现性和稳定性。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
技术方案一：
本发明提供一种检测泰妙菌素抗原的电化学免疫传感器，基础电极表面具有金/银-氧化石墨烯-全氟磺酸纳米复合材料修饰层，所述修饰层上固定有抗泰妙菌素单克隆抗体，最外层为牛血清白蛋白封闭非特异性活性位点。
作为本发明的进一步优化，所述基础电极为金电极。
技术方案二：
一种所述检测泰妙菌素抗原的电化学免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：
(1)基础电极预处理；
(2)制备银-氧化石墨烯-全氟磺酸(Ag-GO-Nf)复合溶液，将所述溶液滴于步骤(1)预处理后的基础电极上，室温干燥,即得Ag-GO-Nf/Au电极；
(3)将步骤(2)获得的Ag-GO-Nf/Au电极浸于氯金酸溶液中，采用恒电位沉积法沉积金纳米粒子(AuNPs)，-0.2V恒电位沉积600-800秒，最优为750秒，用磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，晾干，获得修饰电极，所述修饰电极即为AuNPs/Ag-GO-Nf/Au电极；
(4)将抗泰妙菌素单克隆抗体溶液滴涂于步骤(3)获得的修饰电极上，在30℃-40℃孵育70-100分钟，最优为37℃孵育90分钟，孵育结束后用磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，晾干，然后取牛血清白蛋白(BSA)溶液滴涂于修饰电极上，在30℃-40℃孵育20-50分钟，最优为37℃孵育30分钟孵育结束后用磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，晾干，即得所述电化学免疫传感器。
作为本发明的进一步优化，所述基础电极预处理包括，用0.05-1.0μm的Al2O3抛光粉打磨至镜面，然后在无水乙醇和去离子水中超声3-8分钟，氮气吹干。
作为本发明的进一步优化，所述银-氧化石墨烯-全氟磺酸(Ag-GO-Nf)复合溶液的制备方法，包括以下步骤：
(a)将氧化石墨烯溶于水中并超声分散1-5小时，再将葡萄糖于搅拌状态下加入到上述水溶液中，氧化石墨烯与葡萄糖的质量比1∶(3-7)，进一步优化氧化石墨烯与葡萄糖的质量比为1∶5，获得溶液A；
(b)将0.3M-0.7M NH3·H2O加入到5-8mL浓度为0.06-0.27M的AgNO3溶液中，最优将0.55M NH3·H2O缓慢加入到6.7mL浓度为0.18M的AgNO3溶液中，获得溶液B；
(c)将溶液B缓慢加入到溶液A中，磁力搅拌8-10分钟后室温静置1-2小时得到溶液C，最优静置时间为1.5小时；
(d)将溶液C于转速10000-13000转/分钟，离心3-6分钟，弃上清液获得沉淀，用去离子水洗涤沉淀，直至洗涤液pH为中性，然后将洗涤后的于50℃-80℃干燥12-24小时，即得银-氧化石墨烯纳米材料；进一步优化转速为12000转/分钟，离心5分钟；进一步优化沉淀于60℃干燥16小时；
(e)将步骤(d)获得的银-氧化石墨烯纳米材料用玛瑙研钵研成粉末，称取适量研磨后的银-氧化石墨烯粉末，加入去离子水中，超声1小时，配成浓度为1mg/mL的银-氧化石墨烯水溶液，之后将所述银-氧化石墨烯水溶液添加到质量浓度为0.4％全氟磺酸溶液中，银-氧化石墨烯水溶液与全氟磺酸溶液的体积比为1mL:(1-4)mL获得银-氧化石墨烯-全氟磺酸(Ag-GO-Nf)复合溶液。进一步优化银-氧化石墨烯水溶液与全氟磺酸溶液的体积比为1:2，获得Ag-GO-Nf复合溶液。
作为本发明的进一步优化，步骤(3)中所述氯金酸溶液为质量浓度1.0％HAuCl4与0.5M H2SO4按照体积比1∶(8-10)混合制成，进一步优化体积比为1∶10。
作为本发明的进一步优化，步骤(4)中抗泰妙菌素单克隆抗体溶液浓度为11×10- 3mg/mL,滴涂量为20μL；所述牛血清白蛋白溶液质量浓度为0.25％，滴涂量为15μL；并将所述电化学免疫传感器置于4℃保存。
技术方案三：
一种所述的检测泰妙菌素抗原的电化学免疫传感器检测泰妙菌素抗原的方法，包括以下步骤：
(1)以所述检测泰妙菌素抗原的电化学免疫传感器作为工作电极与参比电极和对电极构成三电极体系，在PBS缓冲溶液中采用差分脉冲伏安法对泰妙菌素抗原进行电化学测量，得出所述电化学免疫传感器对泰妙菌素抗原的拟合线性回归方程，计算出最低检测限；
(2)以所述检测泰妙菌素抗原的电化学免疫传感器为工作电极与参比电极和对电极构成三电极体系，在PBS缓冲溶液中采用差分脉冲伏安法对将待测样品进行电化学测量，并利用步骤1)的拟合线性回归方程即可计算出待测样品中泰妙菌素的浓度。
作为本发明的进一步优化，步骤(1)所述泰妙菌素抗原的浓度为0.01-1000ng/mL，所述参比电极为饱和甘汞电极，所述对电极为铂丝电极。
作为本发明的进一步优化，所述电化学测量包括以下步骤，将待测样品滴涂于所述电化学免疫传感器后于30-50℃孵育40-70分钟后进行电化学测量，最优为在37℃孵育60分钟。
电极材料是构建电化学免疫传感器的关键。其中氧化石墨烯(graphene oxide，GO)具有比表面积大、导电性好等优良特性，在生物传感等生物领域得到了广泛的应用。银纳米粒子因其良好的导电性、良好的生物相容性和氧化还原活性而被广泛应用于生物传感器中。AgNPs与氧化石墨烯的结合可能表现出较大的表面积、良好的水溶性、优异的生物相容性和良好的导电性，还可能表现出氧化还原活性。金纳米粒子(AuNPs)具有良好的导电性、催化性和生物相容性，可以将抗体牢固地附着在金电极上，而氧化石墨烯的大表面积可以提高抗体的负载量。Nafion(Nf)是全氟磺酸型聚合物溶液，具有良好的分散性、热稳定性和化学稳定性，能很好地解决氧化石墨烯在水溶液中的分散问题。
本发明公开了以下技术效果：
1.本发明提供了一种用于检测泰妙菌素抗原的电化学免疫传感器，具有检出限低，线性检测范围宽，灵敏度高，操作简便等优势，对于动物源性食品中泰妙菌素的高灵敏度和高选择性定量检测有一定的实际应用前景。
2.本发明将AuNPs/Ag-GO-Nf纳米复合材料作为电化学免疫传感器的基底材料，银纳米粒子不仅具有优良的导电性能，还能作为检测电化学信号的氧化还原探针，不需要额外加入氧化还原探针，从而制备了一种免标记的电化学免疫传感器，简化了电化学免疫传感器的制备过程。
3.本发明将AuNPs/Ag-GO-Nf纳米复合材料作为电化学免疫传感器的基底材料，金纳米粒子不仅能高效的固定单克隆抗体，还能加快电化学免疫传感器敏感界面的电子转移，从而提高电化学免疫传感器的灵敏性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明检测泰妙菌素抗原的电化学免疫传感器的制备流程示意图；
图2为对实施例1步骤(4)制备的Ag-GO-Nf/Au电极，步骤(5)制备的AuNPs/Ag-GO-Nf/Au电极，步骤(6)制备的固定有抗泰妙菌素单克隆抗体的AuNPs/Ag-GO-Nf/Au电极，步骤(7)最终获得的检测泰妙菌素抗原的电化学免疫传感器以及在所述电化学免疫传感器表面滴涂泰妙菌素抗原并孵育后的电极循环伏安图；
图3为实施例1制备的检测泰妙菌素抗原的电化学免疫传感器对不同浓度泰妙菌素抗原检测图，其中图A为差分脉冲伏安响应曲线，其中A图所示曲线波谷位置从上至下依次为曲线a-k，图B为对应校准曲线。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1
(1)以金电极为基础电极，依次用1.0、0.3和0.05μm的Al2O3抛光粉打磨至镜面，然后在无水乙醇中超声3分钟，N2吹干；
(2)将10mg氧化石墨烯溶于水溶液中并超声分散3小时，再将0.5g葡萄糖于搅拌状态下加入到上述水溶液中，获得溶液A；将0.55M NH3·H2O缓慢加入到6.7mL浓度为0.18MAgNO3溶液中，获得溶液B；将溶液B缓慢加入到溶液A中，磁力搅拌8分钟后室温静置1.5小时得到溶液C；将溶液C在转速12000转/分钟，离心5分钟，弃上清，用去离子水洗涤沉淀多次，直至溶液pH为中性，然后将洗涤后的沉淀于60℃干燥16小时，即得银-氧化石墨烯纳米材料；
(3)将银-氧化石墨烯纳米材料用玛瑙研钵研成粉末，称取适量研磨后的银-氧化石墨烯粉末，加入去离子水中，超声1小时，配成浓度为1mg/mL的银-氧化石墨烯水溶液，之后将银-氧化石墨烯水溶液添加到质量浓度为0.4％全氟磺酸溶液中，银-氧化石墨烯水溶液与全氟磺酸溶液的体积比为1mL:2mL，获得Ag-GO-Nf复合溶液；
(4)将10μL Ag-GO-Nf溶液滴涂于金电极上，室温干燥，即得Ag-GO-Nf/Au电极；
(5)将上述Ag-GO-Nf/Au电极浸于5mL 1.0％HAuCl4/0.5M H2SO4(1:10,v/v)溶液中，采用恒电位沉积法，-0.2V恒电位沉积金纳米粒子750秒，然后用磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，晾干，即得AuNPs/Ag-GO-Nf/Au电极；
(6)取20μL浓度为11×10-3mg/mL抗泰妙菌素单克隆抗体，滴涂于AuNPs/Ag-GO-Nf/Au电极上，37℃孵育90分钟，用磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，晾干，即得固定有抗泰妙菌素单克隆抗体的AuNPs/Ag-GO-Nf/Au电极；
(7)然后取15μL质量浓度为0.25％的BSA溶液滴涂于固定有抗泰妙菌素单克隆抗体的AuNPs/Ag-GO-Nf/Au电极上，37℃孵育30分钟，用磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，晾干，即得一种检测泰妙菌素抗原的电化学免疫传感器，将所述电化学免疫传感器置于4℃中保存。
试验例1
使用循环伏安法(CV)对实施例1步骤(4)制备的Ag-GO-Nf/Au电极，步骤(5)制备的AuNPs/Ag-GO-Nf/Au电极，步骤(6)制备的固定有抗泰妙菌素单克隆抗体的AuNPs/Ag-GO-Nf/Au电极、步骤(7)最终获得的检测泰妙菌素抗原的电化学免疫传感器，和在所述电化学免疫传感器表面滴涂泰妙菌素抗原并30℃孵育70分钟后的电极进行电化学测试，测试缓冲液均为0.1M磷酸盐缓冲溶液，测试结果见图2。
如图2所示，曲线a为Ag-GO-Nf/Au电极，可以看到明显的氧化还原峰。曲线b为AuNPs/Ag-GO-Nf/Au电极，可以看到氧化还原峰电流显著增加，这是由于AuNPs具有良好的导电性，在电化学反应中促进了电子转移，从而起到放大电流信号的作用。然而，将抗体固定在AuNPs/Ag-GO-Nf/Au电极上后，峰电流响应减少，这是由于蛋白质阻碍了电子传递，见曲线c。在电极上继续滴加BSA后，峰电流进一步降低，见曲线d。最后，将泰妙菌素抗原与抗体孵育后，峰电流进一步降低，见曲线e，证明泰妙菌素抗原与抗体成功结合，说明电化学传感界面构建成功。
试验例2
(1)使用实施例1所制备的检测泰妙菌素抗原的电化学免疫传感器工作电极与参比电极和对电极构成三电极体系，所述参比电极为饱和甘汞电极，所述对电极为铂丝电极，在PBS缓冲溶液中采用差分脉冲伏安法对浓度为10pg/mL、33pg/mL、100pg/mL、333pg/mL、1ng/mL、3.3ng/mL、10ng/mL、33ng/mL、100ng/mL、333ng/mL、1000ng/mL的泰妙菌素抗原进行电化学测量。首先将不同泰妙菌素抗原滴涂于于所述电化学免疫传感器，并在37℃孵育60分钟，然后进行电化学测量，并使用差分脉冲伏安法(DPV)记录检测结果，结果见图3(A)，可以看到随着泰妙菌素抗原浓度的增大，DPV峰电流信号逐渐减小，将泰妙菌素抗原浓度的对数和DPV峰电流作图，得到DPV峰电流与泰妙菌素抗原浓度的对数间呈线性关系，结果见图3(B)，拟合线性回归方程为I＝37.1LogCTIA-421.5(CTIA代表TIA浓度)，R2＝0.9905，计算得到最低检测限为1.28pg/mL(S/N＝3)。
(2)鸡蛋样品的处理：新鲜鸡蛋样品从市场购买。首先，用高速搅拌机将蛋白和蛋黄搅拌均匀。取匀浆后的鸡蛋样品2.0g，加入10mL乙醇超声10分钟，4500rpm离心5分钟，收集上清，按前一步骤再次提取沉淀。随后，将两次离心得到的上清液用氮气吹干。将所得物质溶解于10mL乙醇/PBS(0.1M，pH7.4)(5:95，v/v)
中，过滤，即得鸡蛋样品。
(3)猪肉和猪肝样品的处理：新鲜猪肉或猪肝样品从市场购买。首先，用研钵研磨猪肉或猪肝。然后，称取约2.0g的均质猪肉或猪肝，加入2mL浓度为0.1M HCl超声约10分钟后，再加入8mL浓度为0.1M、pH＝7.4的PBS溶液中继续超声5分钟。将上述混合物4500rpm离心液5分钟。离心后，得上清液的并用1M NaOH溶液调节pH＝7.4,即得新鲜猪肉或猪肝样品。
(4)通过加标回收实验验证所制备的电化学免疫传感器的可行性：先用常规酶联免疫吸附测定法(ELISA)验证鸡蛋样品、猪肉样品和猪肝样品均为TIA阴性。
(5)为了避免背景信号的干扰，在稀释20倍的鸡蛋样品中分别加入不同浓度的TIA，获得TIA的浓度为500ng/mL、50ng/mL、5ng/mL、0.5ng/mL以及0.05ng/mL 5个鸡蛋待测加标样品。
(6)对步骤(3)获得的猪肉样品或猪肝样品采用步骤(5)方法进行相同处理，获得5个TIA浓度不同的猪肉待测加标样品以及5个TIA浓度不同的猪肝加标待测样品。
(7)使用实施例1所制备的检测泰妙菌素抗原的电化学免疫传感器工作电极与参比电极和对电极构成三电极体系，在PBS缓冲溶液中采用差分脉冲伏安法对15个待测加标样品进行电化学测量。先将待测加标样品滴涂于电化学免疫传感器，然后于37℃孵育60分钟后再进行电化学测量，并利用步骤(1)的拟合线性回归方程即可计算出15个待测加标样品中泰妙菌素的浓度，计算回收率，结果见表1，表1中列出的结果表明，本发明所提出的电化学免疫传感器检测泰妙菌素实际样品具有较高的准确性和可行性。
表1
Figure BDA0002849725350000131
实施例2
(1)以金电极为基础电极，依次用1.0，0.3和0.05μm的Al2O3抛光粉打磨至镜面，然后在去离子水中超声5分钟，N2吹干；
(2)将10mg氧化石墨烯溶于水溶液中并超声分散1小时，再将0.7g葡萄糖于搅拌状态下加入到上述水溶液中，获得溶液A；将0.3M NH3·H2O缓慢加入到8mL浓度为0.06M AgNO3溶液中，获得溶液B；将溶液B缓慢加入到溶液A中，磁力搅拌9分钟后室温静置1小时得到溶液C；将溶液C在转速10000转/分钟，离心3分钟，弃上清，用去离子水洗涤沉淀多次，直至溶液pH为中性，然后将洗涤后的沉淀于50℃干燥24小时，即得银-氧化石墨烯纳米材料；
(3)将银-氧化石墨烯纳米材料用玛瑙研钵研成粉末，称取适量研磨后的银-氧化石墨烯粉末，加入去离子水中，超声1小时，配成浓度为1mg/mL的银-氧化石墨烯水溶液，之后将银-氧化石墨烯水溶液添加到质量浓度为0.4％全氟磺酸溶液中，银-氧化石墨烯水溶液与全氟磺酸溶液的体积比为1mL:1mL，获得Ag-GO-Nf复合溶液；
(4)将10μL Ag-GO-Nf溶液滴涂于金电极上，室温干燥,即得Ag-GO-Nf/Au电极；
(5)将上述修饰电极浸于5mL 1.0％HAuCl4/0.5M H2SO4(1:8,v/v)溶液中，采用恒电位沉积法，-0.2V恒电位沉积金纳米粒子600秒，然后用磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，晾干，即得修饰电极AuNPs/Ag-GO-Nf/Au电极；
(6)取20μL浓度为11×10-3mg/mL抗泰妙菌素单克隆抗体，滴涂于AuNPs/Ag-GO-Nf/Au电极上，30℃孵育100分钟，用磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，晾干；然后取15μL质量浓度为0.25％的BSA溶液滴涂于电极上，30℃孵育40分钟，用磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，晾干，即得一种检测泰妙菌素抗原的电化学免疫传感器，将所述电化学免疫传感器置于4℃中保存。
实施例3
(1)以金电极为基础电极，依次用1.0、0.3和0.05μm的Al2O3抛光粉打磨至镜面，然后在无水乙醇中超声8分钟，N2吹干；
(2)将10mg氧化石墨烯溶于水溶液中并超声分散5小时，再将0.3g葡萄糖于搅拌状态下加入到上述水溶液中，获得溶液A；将0.3M NH3·H2O缓慢加入到5mL浓度为0.27M AgNO3溶液中，获得溶液B；将溶液B缓慢加入到溶液A中，磁力搅拌10分钟后室温静置2小时得到溶液C；将溶液C在转速13000转/分钟，离心6分钟，弃上清，用去离子水洗涤沉淀多次，直至溶液pH为中性，然后将洗涤后的沉淀于80℃干燥12小时，即得银-氧化石墨烯纳米材料；
(3)将银-氧化石墨烯纳米材料用玛瑙研钵研成粉末，称取适量研磨后的银-氧化石墨烯粉末，加入去离子水中，超声1小时，配成浓度为1mg/mL的银-氧化石墨烯水溶液，之后将银-氧化石墨烯水溶液添加到质量浓度为0.4％全氟磺酸溶液中，银-氧化石墨烯水溶液与全氟磺酸溶液的体积比为1mL:4mL，获得Ag-GO-Nf复合溶液；
(4)将10μL Ag-GO-Nf溶液滴涂于金电极上，室温干燥,即得Ag-GO-Nf/Au电极；
(5)将上述修饰电极浸于5mL 1.0％HAuCl4/0.5M H2SO4(1:9,v/v)溶液中，采用恒电位沉积法，-0.2V恒电位沉积金纳米粒子600秒，然后用磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，晾干，即得修饰电极AuNPs/Ag-GO-Nf/Au电极；
(6)取20μL浓度为11×10-3mg/mL抗泰妙菌素单克隆抗体，滴涂于AuNPs/Ag-GO-Nf/Au电极上，40℃孵育70分钟，用磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，晾干；然后取15μL质量浓度为0.25％的BSA溶液滴涂于电极上，50℃孵育70分钟，用磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，晾干，即得一种检测泰妙菌素抗原的电化学免疫传感器，将所述电化学免疫传感器置于4℃中保存。
对比例1
Guanqiong Na等人将沃尼妙林与牛血清白蛋白偶联制备免疫原免疫Balb/c小鼠，成功制备了一种同时识别沃尼妙林和泰妙菌素的高灵敏度单克隆抗体，以此单克隆抗体为基础，建立了快速筛查猪肝脏中沃尼妙林和泰妙菌素的免疫层析试纸条方法，沃尼妙林和泰妙菌素的检出限分别为0.96和0.29ng/g。Xianlu Lei等人将泰妙菌素与血蓝蛋白偶联制备免疫原，免疫Balb/c小鼠，成功制备了一种特异性识别泰妙菌素的单克隆抗体，以此单克隆抗体为基础，建立了间接竞争酶联免疫吸附试验(ic-ELISA)检测鸡肉中的泰妙菌素残留，检测范围为0.14-0.9ng/mL,建立了胶体金免疫层析试纸条法检测鸡肉中的泰妙菌素残留，最低检测限为5ng/mL。Ewelina Patyra等基于高效液相色谱-串联质谱，建立了兽药泰妙菌素、甲氧苄啶、泰乐菌素、磺胺嘧啶和磺胺二甲基嘧啶的多组分分析方法，并在含药饲料中进行了验证，测定条件为色谱柱为联苯色谱柱，流动相为含0.1％甲酸的乙腈和0.1％甲酸溶液，利用该方法检测饲料中的泰妙菌素残留，检测范围为20-160mg/kg，最低检测限为4.09mg/kg。
本发明检测泰妙菌素抗原的检测范围为0.01-1000ng/mL，最低检测限(LOD)为1.28pg/mL。与以上现有技术中检测泰妙菌素抗原的方法的检测范围以及最低检测限相比，本发明检测泰妙菌素抗原的检测范围更广，LOD更低。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种检测泰妙菌素抗原的电化学免疫传感器，其特征在于，基础电极表面具有金/银-氧化石墨烯-全氟磺酸纳米复合材料修饰层，所述修饰层上固定有抗泰妙菌素单克隆抗体，最外层为牛血清白蛋白。
2.根据权利要求1所述的检测泰妙菌素抗原的电化学免疫传感器，其特征在于，所述基础电极为金电极。
3.一种如权利要求1-2任一项所述的检测泰妙菌素抗原的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)基础电极预处理；
(2)制备银-氧化石墨烯-全氟磺酸复合溶液，将所述复合溶液滴于步骤(1)预处理后的基础电极上，室温干燥；
(3)将步骤(2)获得的电极浸于氯金酸溶液中，采用恒电位沉积法沉积金纳米粒子，-0.2V恒电位沉积600-800秒，冲洗电极表面，晾干，获得修饰电极；
(4)将抗泰妙菌素单克隆抗体溶液滴涂于步骤(3)获得的修饰电极上，进行孵育，孵育结束后冲洗电极表面，晾干，然后取牛血清白蛋白溶液滴涂于修饰电极上，进行孵育，孵育结束后冲洗电极表面，晾干，即得检测泰妙菌素抗原的电化学免疫传感器。
4.根据权利要求3所述的一种检测泰妙菌素抗原的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述基础电极预处理包括：用Al2O3抛光粉打磨至镜面，然后在无水乙醇或去离子水中超声3-8分钟，氮气吹干。
5.根据权利要求3所述的一种检测泰妙菌素抗原的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述银-氧化石墨烯-全氟磺酸复合溶液的制备方法，包括以下步骤：
(a)将氧化石墨烯溶于水中并超声分散1-5小时，再将葡萄糖于搅拌状态下加入到上述水溶液中，氧化石墨烯与葡萄糖的质量比1∶(3-7)，获得溶液A；
(b)将0.3M-0.7M NH3·H2O加入到5-8mL浓度为0.06-0.27M的AgNO3溶液中，获得溶液B；
(c)将溶液B缓慢加入到溶液A中，磁力搅拌8-10分钟后室温静置1-2小时得到溶液C；
(d)将溶液C于转速10000-13000转/分钟，离心3-6分钟，弃上清液获得沉淀，用去离子水洗涤沉淀，直至洗涤液pH为中性，然后将沉淀于50℃-80℃干燥12-24小时，即得银-氧化石墨烯纳米材料；
(e)将步骤(d)获得的银-氧化石墨烯纳米材料用玛瑙研钵研成粉末，加入去离子水，配成1mg/mL的银-氧化石墨烯水溶液，然后将所述银-氧化石墨烯水溶液添加到质量浓度为0.4％全氟磺酸溶液中，银-氧化石墨烯水溶液与全氟磺酸溶液的体积比为1mL:(1-4)mL获得银-氧化石墨烯-全氟磺酸复合溶液。
6.根据权利要求3所述的一种检测泰妙菌素抗原的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述氯金酸溶液为质量浓度1.0％HAuCl4与0.5M H2SO4按照体积比1∶10混合制成。
7.根据权利要求3所述的一种检测泰妙菌素抗原的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，步骤(4)中抗泰妙菌素单克隆抗体溶液浓度为11×10-3mg/mL；所述牛血清白蛋白溶液质量浓度为0.25％。
8.一种如权利要求1-2任一项所述的检测泰妙菌素抗原的电化学免疫传感器检测泰妙菌素抗原的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以所述检测泰妙菌素抗原的电化学免疫传感器作为工作电极与参比电极和对电极构成三电极体系，在PBS缓冲溶液中采用差分脉冲伏安法对泰妙菌素抗原进行电化学测量，得出所述电化学免疫传感器对泰妙菌素抗原的拟合线性回归方程；
(2)以所述检测泰妙菌素抗原的电化学免疫传感器为工作电极与参比电极和对电极构成三电极体系，在PBS缓冲溶液中采用差分脉冲伏安法对将待测样品进行电化学测量，并利用步骤(1)的拟合线性回归方程即可计算出待测样品中泰妙菌素的浓度。
9.根据权利要求8所述的检测泰妙菌素抗原的电化学免疫传感器检测泰妙菌素抗原的方法，其特征在于，步骤(1)所述泰妙菌素抗原的浓度为0.01-1000ng/mL，所述参比电极为饱和甘汞电极，所述对电极为铂丝电极。
10.根据权利要求8所述的检测泰妙菌素抗原的电化学免疫传感器检测泰妙菌素抗原的方法，其特征在于，所述电化学测量包括以下步骤：将待测样品滴涂于所述电化学免疫传感器于30-50℃孵育40-70分钟后进行电化学测量。
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