CN114113263A - 一种检测氨苯胂酸的电化学免疫传感器及制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种检测氨苯胂酸的电化学免疫传感器，包括金电极表面滴加有rGO‑PEI‑Ag‑Nf复合溶液的纳米复合材料，在纳米复合材料上固定葡萄球菌A蛋白,然后滴加抗氨苯胂酸单克隆抗体，最外层为牛血清白蛋白，所述的rGO‑PEI‑Ag‑Nf复合溶液包括还原氧化石墨烯、聚乙烯亚胺和银纳米粒子和全氟磺酸，采用以上结构后，本发明具有如下优点：本发明提供了一种用于检测氨苯胂酸的电化学免疫传感器，具有检出限低，线性检测范围宽，灵敏度高，操作简便等优势，本发明将rGO‑PEI‑Ag‑Nf纳米复合材料作为电化学免疫传感器的基底材料，银纳米粒子不仅具有优良的导电性能，还能作为检测电化学信号的氧化还原探针。
Description
技术领域
本发明涉及金属纳米材料、免疫反应和生物传感检测技术领域，具体是指一种检测氨苯胂酸的电化学免疫传感器及制备方法。
背景技术
有机砷在20世纪50年代作为一种饲料添加剂，不仅可以促进家禽体重增加，增强肉类色素沉着，还可以抑制肠道有害细菌的生长和繁殖。其中，氨苯胂酸(ASA)和洛克沙胂(ROX)被广泛使用在动物生产中，作为控制我国家禽疾病的食品添加剂。然而，随着国家食品安全检测技术的快速发展，研究人员发现ASA添加剂的使用水平高于推荐水平，可能导致动物机体四肢瘫痪，共济失调，肌肉震颤和失明等毒性作用。残留在动物组织中的ASA可通过食物链进入人体，引起毒性和致畸作用。2020年，中国规定猪肉和猪肝中ASA的最大残留限量为500μg/kg。因此，需要制定有效的检测方法，以避免此类添加剂的滥用。
目前，有机砷残留的主要检测方法是HPLC和ELISA。然而，基于仪器的色谱检测方法需要昂贵的设备，复杂的样品制备，大量的有机试剂和专业的操作人员。ELISA具有灵敏度高，通量高的优点，但它也存在耗时且无法提供快速现场检测的缺点。因此，开发一种低成本，简单，灵敏和选择性的检测方法至关重要。电化学免疫传感器具有能耗低，设备简单，易于小型化等优点而受到越来越多的关注。它已被广泛应用在许多领域，如医疗诊断，环境监测，食品安全监测等。因此，这种分析方法将成为一种非常有前途的检测技术。本实验基于所制备的具有高亲和力的氨苯胂酸(ASA)单克隆抗体，制备了一种无标记的电化学免疫传感器，用于猪肉和猪肝中ASA的灵敏检测。
发明内容
本发明要解决上述技术问题，提供一种检测氨苯胂酸的电化学免疫传感器及制备方法，以解决上述现有技术存在的问题，本发明所设计、构建的传感器可实现定量、灵敏检测，具有较宽的检测范围和较低的检测限，并具有良好的重现性和稳定性。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：
一种检测氨苯胂酸的电化学免疫传感器，包括金电极表面滴加有rGO-PEI-Ag-Nf复合溶液的纳米复合材料，在纳米复合材料上固定葡萄球菌A蛋白,然后滴加抗氨苯胂酸单克隆抗体，最外层为牛血清白蛋白，所述的rGO-PEI-Ag-Nf复合溶液包括还原氧化石墨烯、聚乙烯亚胺和银纳米粒子和全氟磺酸。
采用以上结构后，本发明具有如下优点：
1.本发明提供了一种用于检测氨苯胂酸的电化学免疫传感器，具有检出限低，线性检测范围宽，灵敏度高，操作简便等优势，对于动物源性食品中氨苯胂酸的高灵敏度和高选择性定量检测有一定的实际应用前景。
2.本发明将rGO-PEI-Ag-Nf纳米复合材料作为电化学免疫传感器的基底材料，银纳米粒子不仅具有优良的导电性能，还能作为检测电化学信号的氧化还原探针，不需要额外加入氧化还原探针，从而制备了一种免标记的电化学免疫传感器，简化了电化学免疫传感器的制备过程。
3.本发明将rGO-PEI-Ag-Nf纳米复合材料作为电化学免疫传感器的基底材料，PEI不仅可以提高溶液的稳定性，延长材料的使用期限，而且可以作为GO的还原剂，生成具有高导电性的rGO，rGO和AgNPs的双重导电性，提高了传感器的灵敏性。
一种检测氨苯胂酸的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)金电极预处理；
(2)把制备rGO-PEI-Ag-Nf复合溶液，将溶液滴于步骤(1)预处理后的金电极上，室温干燥后，在PBS溶液中测试该电极的电流大小；
(3)将0.1-0.8mg/mL葡萄球菌A蛋白滴加在步骤(2)获得的电极表面，30℃40℃孵育50-70分钟后，冲洗电极表面，晾干，在PBS溶液中测试电流变化。
(4)将抗氨苯胂酸单克隆抗体滴加到步骤(3)获得的电极表面，37℃孵育30-50分钟后，冲洗电极表面，晾干，测试电流的变化值。
(5)在步骤(4)获得的电极表面滴加0.25％牛血清白蛋白进行孵育，孵育20-40分钟后冲洗电极表面，晾干，即得检测氨苯胂酸的电化学免疫传感器。
作为改进，所述的rGO-PEI-Ag-Nf复合溶液制备方法，包括以下步骤：
(a)将15-30mgrGO粉末分散到20mL水中，超声60分钟，之后向GO溶液中滴加1-4mLPEI(2mg/mL)，并在室温下剧烈搅拌5小时。
(b)然后添加20-50mg NaOH，并在90℃下搅拌24小时。将该混合物离心5分钟，并用水洗涤三次，将获得的rGO-PEI沉淀在60℃-90℃烘箱过夜干燥。
(c)向rGO-PEI粉末中添加2-6mL水并超声处理30分钟，然后在磁力搅拌下添加1.5g葡萄糖，同时，将氨水溶液缓慢逐滴添加到2-4mLAgNO3溶液中，直到沉淀突然消失，之后将该溶液添加到含有rGO-PEI的混合物中并搅拌几分钟，获得均匀混合物。
(d)将该混合物在室温下静置1.5小时。然后，在离心5分钟，获得的沉淀在80℃烘箱中干燥。
(e)最后，将所得沉积物(rGO-PEI-Ag纳米复合物)在研钵中研碎并重新分散在双蒸水和0.4％的Nf乙醇溶液中，比例为3：1，以获得rGO-PEI-Ag-Nf复合溶液。
作为改进，所述的步骤(4)中抗氨苯胂酸单克隆抗体的效价为1:204800,亲和常数为2.34×108L/mol。
一种检测氨苯胂酸的电化学免疫传感器检测氨苯胂酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以所述检测氨苯胂酸的电化学免疫传感器作为工作电极与参比电极和对电极构成三电极体系，在PBS缓冲溶液中采用差分脉冲伏安法(DPV)对不同浓度的氨苯胂酸进行电化学测试，得出所述电化学免疫传感器对氨苯胂酸的标准曲线；
(2)利用步骤(1)所得的标准曲线，即可计算出添加样品中氨苯胂酸的浓度。
作为改进，所述的步骤(1)中氨苯胂酸的浓度为0.5-500ng/mL，所述的参比电极为饱和甘汞电极，所述对电极为铂丝电极。
附图说明
图1是本发明制备流程示意图。
图2是本发明实施例二步骤(7)制备的rGO-PEI-Ag-Nf电极，步骤(8)制备的SPA/rGO-PEI-Ag-Nf电极，步骤(9)制备的anti-ASA/SPA/rGO-PEI-Ag-Nf电极、步骤(10)获得的BSA/anti-ASA/SPA/rGO-PEI-Ag-Nf和在所述电化学免疫传感器表面滴加氨苯胂酸后的电极循环伏安图(A)和电化学阻抗谱(B)。
图3是本发明实施例二制备的检测氨苯胂酸的电化学免疫传感器对不同浓度氨苯胂酸的差分脉冲伏安图，其中(A)为的差分脉冲伏安响应，(B)为对应的标准曲线。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明。
结合附图1-，一种检测氨苯胂酸的电化学免疫传感器，包括金电极表面滴加有rGO-PEI-Ag-Nf复合溶液的纳米复合材料，在纳米复合材料上固定葡萄球菌A蛋白,然后滴加抗氨苯胂酸单克隆抗体，最外层为牛血清白蛋白，所述的rGO-PEI-Ag-Nf复合溶液包括还原氧化石墨烯、聚乙烯亚胺和银纳米粒子和全氟磺酸。
一种检测氨苯胂酸的电化学免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：
(1)金电极预处理；
(2)把制备rGO-PEI-Ag-Nf复合溶液，将溶液滴于步骤(1)预处理后的金电极上，室温干燥后，在PBS溶液中测试该电极的电流大小；
(3)将0.1-0.8mg/mL葡萄球菌A蛋白滴加在步骤(2)获得的电极表面，30℃40℃孵育50-70分钟后，冲洗电极表面，晾干，在PBS溶液中测试电流变化；
(4)将抗氨苯胂酸单克隆抗体滴加到步骤(3)获得的电极表面，37℃孵育30-50分钟后，冲洗电极表面，晾干，测试电流的变化值；
(5)在步骤(4)获得的电极表面滴加0.25％牛血清白蛋白进行孵育，孵育20-40分钟后冲洗电极表面，晾干，即得检测氨苯胂酸的电化学免疫传感器。
所述的rGO-PEI-Ag-Nf复合溶液制备方法，包括以下步骤：
(a)将15-30mgrGO粉末分散到20mL水中，超声60分钟，之后向GO溶液中滴加1-4mLPEI(2mg/mL)，并在室温下剧烈搅拌5小时；
(b)然后添加20-50mg NaOH，并在90℃下搅拌24小时。将该混合物离心5分钟，并用水洗涤三次，将获得的rGO-PEI沉淀在60℃-90℃烘箱过夜干燥；
(c)向rGO-PEI粉末中添加2-6mL水并超声处理30分钟，然后在磁力搅拌下添加1.5g葡萄糖。同时，将氨水溶液缓慢逐滴添加到2-4mL AgNO3溶液中，直到沉淀突然消失，之后将该溶液添加到含有rGO-PEI的混合物中并搅拌几分钟，获得均匀混合物；
(d)将该混合物在室温下静置1.5小时。然后，在离心5分钟，获得的沉淀在80℃烘箱中干燥；
(e)最后，将所得沉积物(rGO-PEI-Ag纳米复合物)在研钵中研碎并重新分散在双蒸水和0.4％的Nf乙醇溶液中，比例为3：1，以获得rGO-PEI-Ag-Nf溶液。
所述的步骤(4)中抗氨苯胂酸单克隆抗体的效价为1:204800,亲和常数为2.34×108L/mol。
一种检测氨苯胂酸的电化学免疫传感器检测氨苯胂酸的方法，包括以下步骤：
(1)以所述检测氨苯胂酸的电化学免疫传感器作为工作电极与参比电极和对电极构成三电极体系，在PBS缓冲溶液中采用差分脉冲伏安法(DPV)对不同浓度的氨苯胂酸进行电化学测试，得出所述电化学免疫传感器对氨苯胂酸的标准曲线；
(2)利用步骤(1)所得的标准曲线，即可计算出添加样品中氨苯胂酸的浓度；
所述的步骤(1)中氨苯胂酸的浓度为0.5-500ng/mL，所述的参比电极为饱和甘汞电极，所述对电极为铂丝电极。
实施例一：
一种检测氨苯胂酸的电化学免疫传感器，包括金电极表面滴加有rGO-PEI-Ag-Nf复合溶液的纳米复合材料，在纳米复合材料上固定葡萄球菌A蛋白,然后滴加抗氨苯胂酸单克隆抗体，最外层为牛血清白蛋白，所述的rGO-PEI-Ag-Nf复合溶液包括还原氧化石墨烯、聚乙烯亚胺和银纳米粒子和全氟磺酸。
一种检测氨苯胂酸的电化学免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：
(1)金电极预处理；
(2)把制备rGO-PEI-Ag-Nf复合溶液，将溶液滴于步骤(1)预处理后的金电极上，室温干燥后，在PBS溶液(0.1M PH＝7.4)中测试该电极的电流大小；
(3)将0.3mg/mL葡萄球菌A蛋白(SPA)滴加在步骤(2)获得的电极表面，37℃孵育60分钟后，冲洗电极表面，晾干，在PBS溶液中测试电流变化；
(4)将抗氨苯胂酸单克隆抗体滴加到步骤(3)获得的电极表面，37℃孵育30分钟后，冲洗电极表面，晾干，测试电流的变化值；
(5)在步骤(4)获得的电极表面滴加0.25％牛血清白蛋白进行孵育，孵育30分钟后冲洗电极表面，晾干，即得检测氨苯胂酸的电化学免疫传感器；
所述的rGO-PEI-Ag-Nf复合溶液制备方法，包括以下步骤：
(a)将20mgrGO粉末分散到20mL水中，超声60分钟，之后向GO溶液中滴加2mL PEI(2mg/mL)，并在室温下剧烈搅拌5小时；
(b)然后添加40mg NaOH，并在90℃下搅拌24小时,将该混合物在12000rpm下离心5分钟，并用水洗涤三次，将获得的rGO-PEI沉淀在80℃烘箱过夜干燥；
(c)向rGO-PEI粉末中添加5mL水并超声处理30分钟，然后在磁力搅拌下添加1.5g葡萄糖,同时，将氨水溶液(0.55M)缓慢逐滴添加到3.35mL AgNO3溶液中，直到沉淀突然消失，之后将该溶液添加到含有rGO-PEI的混合物中并搅拌几分钟，获得均匀混合物；
(d)将该混合物在室温下静置1.5小时,在12000rpm下离心离心5分钟，获得的沉淀在80℃烘箱中干燥；
(e)最后，将所得沉积物(rGO-PEI-Ag纳米复合物)在研钵中研碎并重新分散在双蒸水和0.4％的Nf乙醇溶液中，比例为3：1，以获得rGO-PEI-Ag-Nf溶液；
所述的步骤(4)中抗氨苯胂酸单克隆抗体的效价为1:204800,亲和常数为2.34×108L/mol。
一种检测氨苯胂酸的电化学免疫传感器检测氨苯胂酸的方法，包括以下步骤：
(1)以所述检测氨苯胂酸的电化学免疫传感器作为工作电极与参比电极和对电极构成三电极体系，在PBS缓冲溶液中采用差分脉冲伏安法(DPV)对不同浓度的氨苯胂酸进行电化学测试，得出所述电化学免疫传感器对氨苯胂酸的标准曲线；
(2)利用步骤(1)所得的标准曲线，即可计算出添加样品中氨苯胂酸的浓度。
所述的步骤(1)中氨苯胂酸的浓度为0.5-500ng/mL，所述的参比电极为饱和甘汞电极，所述对电极为铂丝电极。
实施例二：
1)金电极，依次用1.0、0.3和0.05μm的Al2O3抛光粉打磨至镜面，然后分别在水和无水乙醇中超声3分钟，氮气吹干；
(2)将20mg GO粉末分散到20mL水中，超声60分钟，之后向GO溶液中滴加2mL PEI(2mg/mL)，并在室温下剧烈搅拌5小时；
(3)然后添加40mg NaOH，并在90℃下搅拌24小时，将该混合物在12000rpm下离心5分钟，并用水洗涤三次，将获得的rGO-PEI沉淀在80℃烘箱过夜干燥；
(4)向rGO-PEI粉末中添加5mL水并超声处理30分钟，然后在磁力搅拌下添加葡萄糖(1.5g)。同时，将氨水溶液(0.55M)缓慢逐滴添加到3.35mL AgNO3(0.12M)溶液中，直到沉淀突然消失，之后将该溶液添加到含有rGO-PEI的混合物中并搅拌几分钟，获得均匀混合物；
(5)将该混合物在室温下静置1.5小时。然后，将混合物在12000rpm下离心5分钟，获得的沉淀在80℃烘箱中干燥；
(6)最后，将所得沉积物(rGO-PEI-Ag纳米复合物)在研钵中研碎并重新分散在双蒸水和0.4％的Nf乙醇溶液(3：1)中，以获得rGO-PEI-Ag-Nf复合溶液；
(7)将9μL rGO-PEI-Ag-Nf溶液滴涂于金电极上，室温干燥，即得rGO-PEI-Ag-Nf电极；
(8)滴加20μL SPA于rGO-PEI-Ag-Nf电极表面，37℃孵育60分钟，用PBS缓冲液冲洗电极表面，晾干，即得SPA/rGO-PEI-Ag-Nf电极；
(9)20μL抗氨苯胂酸单克隆抗体(1：1000)，滴涂于SPA/rGO-PEI-Ag-Nf电极上，37℃孵育40分钟，用PBS冲洗电极表面，晾干，即得固定有抗氨苯胂酸单克隆抗体的anti-ASA/SPA/rGO-PEI-Ag-Nf电极；
(10)15μL质量浓度为0.25％的BSA溶液滴涂于anti-ASA/SPA/rGO-PEI-Ag-Nf电极上，37℃孵育30分钟，用PBS冲洗电极表面，晾干，即得一种检测氨苯胂酸的BSA/anti-ASA/SPA/rGO-PEI-Ag-Nf电极，将电极置于PBS溶液中4℃保存。
试验例一：
使用循环伏安法(CV)对实施例二步骤(7)制备的rGO-PEI-Ag-Nf电极，步骤(8)制备的SPA/rGO-PEI-Ag-Nf电极，步骤(9)制备的固定有抗氨苯胂酸单克隆抗体的anti-ASA/SPA/rGO-PEI-Ag-Nf电极、步骤(10)最终获得的检测氨苯胂酸的电化学免疫传感器，和在所述电化学免疫传感器表面滴加氨苯胂酸并37℃孵育80分钟后的电极进行电化学测试，测试缓冲液均为0.1M PBS溶液，测试结果见图2。
曲线a为裸金电极，其没有氧化还原峰，因为没有氧化还原物质。曲线b为rGO-PEI-Ag-Nf电极，显示出一对明显的氧化还原峰，主要是因为银纳米粒子可用作氧化还原探针，具有良好的电导率，可以增强电子的转移。曲线c为SPA/rGO-PEI-Ag-Nf，电流值显着降低，因为银纳米颗粒可以与SPA结合并阻断电子转移。SPA还具有定向结合抗体Fc片段的功能，因此加入抗ASA单克隆抗体后曲线d的峰值电流降低。然后加入BSA以阻断未结合的活性位点，曲线e的峰值电流再次下降。最后，加入ASA标品后，和抗体形成免疫复合物，进一步阻断电子转移并降低峰值电流(曲线f)。
然后在含有5.0m mol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]的PBS(pH 7.4)中测试了不同修饰电极的EIS。阻抗值可以由EIS频谱高频中半圆的直径表示。直径越大，阻抗值越大，相应的电导率越差。与曲线a的阻抗值相比，添加rGO-PEI-Ag-Nf电极的曲线b的阻抗值显着降低，表明制备的纳米复合材料具有优异的导电性。SPA/rGO-PEI-Ag-Nf(曲线c)，anti-ASA/SPA/rGO-PEI-Ag-Nf(曲线d)和BSA/anti-ASA/SPA/rGO-PEI-Ag-Nf(曲线e)修饰电极的阻抗值逐渐增加，表明SPA，抗ASA单克隆抗体和BSA可以阻断电子转移。加入ASA后，修饰电极的阻抗值(曲线f)进一步增加。电化学阻抗谱的结果与循环伏安图的结果一致，表明修饰电极的免疫传感器已成功制备。
试验例二：
(1)使用实施例二所制备的检测氨苯胂酸的电化学免疫传感器工作电极与参比电极和对电极构成三电极体系，在PBS缓冲溶液中采用差分脉冲伏安法对浓度为0.5ng/mL、1.6ng/mL、5ng/mL、16ng/mL、50ng/mL、160ng/mL、500ng/mL、的氨苯胂酸进行电化学测量。首先将不同氨苯胂酸滴涂于于所述电化学免疫传感器，并在37℃孵育80分钟，然后进行电化学测量，并使用差分脉冲伏安法(DPV)记录检测结果，结果见图3(A)，可以看到随着氨苯胂酸浓度的增大，DPV峰电流信号逐渐减小，将氨苯胂酸浓度的对数和DPV峰电流作图，得到DPV峰电流与氨苯胂酸浓度的对数间呈线性关系，结果见图3(B)。线性回归方程为Y＝25.29*Log CASA+27.18，(CASA代表ASA浓度的对数值)相关系数R2为0.9952，电化学传感器的低检测限为0.38ng/mL(基于S/N＝3)。
(2)猪肉和猪肝样品的处理：新鲜猪肉或猪肝样品从市场购买。首先，用组织研磨器研磨猪肉或猪肝。然后，称取约2.0g的均质猪肉或猪肝，加入2mL浓度为0.1M HCl超声约10分钟后，再加入8mL，0.1M、pH＝7.4的PBS溶液中继续超声5分钟。将上述混合物4500rpm离心5分钟。离心后，得到上清液用1M NaOH溶液调节pH为7.4,即得新鲜猪肉和猪肝样品。
(4)通过加标回收实验验证所制备的电化学免疫传感器的可行性：通过常规酶联免疫吸附测定法(ELISA)验证猪肉和猪肝样品均为ASA阴性。
(5)对步骤(3)获得的猪肉猪肝样品稀释20倍,分别加入10ng/mL、100ng/mL不同浓度的ASA样品。
(6)使用实施例1所制备的检测氨苯胂酸的电化学免疫传感器工作电极与参比电极和对电极构成三电极体系，在PBS缓冲溶液中采用差分脉冲伏安法对猪肉猪肝待测加标样品进行电化学测量。先将待测加标样品滴涂于制备的电化学免疫传感器电极表面，然后于37℃孵育80分钟后再进行电化学测量，并利用步骤(1)的标准方程即计算出待测加标样品中氨苯胂酸的浓度，计算相应的回收率，结果见表1，表1中列出的结果表明，本发明所提出的电化学免疫传感器检测氨苯胂酸实际样品具有较高的准确性和可行性。
表1实际样品中ASA免疫传感器的分析
对比例一：
(7)本实验基于电化学免疫传感器实现ASA的检测与其它检测方法相比，结果见表2，表2中列出的结果表明，电化学免疫传感器对于ASA的检测具有更宽的线性范围0.50-500ng/mL,以及0.38ng/mL低的检测线。
表2不同检测方法的比较
以上对本发明及其实施方式进行了描述，这种描述没有限制性，附图中所示的也只是本发明的实施方式之一，实际的结构并不局限于此。总而言之如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的结构方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种检测氨苯胂酸的电化学免疫传感器，其特征在于，包括金电极表面滴加有rGO-PEI-Ag-Nf复合溶液的纳米复合材料，在纳米复合材料上固定葡萄球菌A蛋白,然后滴加抗氨苯胂酸单克隆抗体，最外层为牛血清白蛋白，所述的rGO-PEI-Ag-Nf复合溶液包括还原氧化石墨烯、聚乙烯亚胺和银纳米粒子和全氟磺酸。
2.根据权利要求1所述的一种检测氨苯胂酸的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)金电极预处理；
(2)把制备rGO-PEI-Ag-Nf复合溶液，将溶液滴于步骤(1)预处理后的金电极上，室温干燥后，在PBS溶液中测试该电极的电流大小；
(3)将0.1-0.8mg/mL葡萄球菌A蛋白滴加在步骤(2)获得的电极表面，30℃40℃孵育50-70分钟后，冲洗电极表面，晾干，在PBS溶液中测试电流变化；
(4)将抗氨苯胂酸单克隆抗体滴加到步骤(3)获得的电极表面，37℃孵育30-50分钟后，冲洗电极表面，晾干，测试电流的变化值；
(5)在步骤(4)获得的电极表面滴加0.25％牛血清白蛋白进行孵育，孵育20-40分钟后冲洗电极表面，晾干，即得检测氨苯胂酸的电化学免疫传感器。
3.根据权利要求2所述的一种检测氨苯胂酸的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于：所述的rGO-PEI-Ag-Nf复合溶液制备方法，包括以下步骤：
(a)将15-30mgrGO粉末分散到20mL水中，超声60分钟，之后向GO溶液中滴加1-4mL PEI(2mg/mL)，并在室温下剧烈搅拌5小时。
(b)然后添加20-50mg NaOH，并在90℃下搅拌24小时，将该混合物离心5分钟，并用水洗涤三次，将获得的rGO-PEI沉淀在60℃-90℃烘箱过夜干燥。
(c)向rGO-PEI粉末中添加2-6mL水并超声处理30分钟，然后在磁力搅拌下添加1.5g葡萄糖，同时，将氨水溶液缓慢逐滴添加到2-4mL AgNO3溶液中，直到沉淀突然消失，之后将该溶液添加到含有rGO-PEI的混合物中并搅拌几分钟，获得均匀混合物；
(d)将该混合物在室温下静置1.5小时。然后，在离心5分钟，获得的沉淀在80℃烘箱中干燥；
(e)最后，将所得沉积物(rGO-PEI-Ag纳米复合物)在研钵中研碎并重新分散在双蒸水和0.4％的Nf乙醇溶液中，比例为3：1，以获得rGO-PEI-Ag-Nf溶液。
4.根据权利要求2所述的一种检测氨苯胂酸的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于：所述的步骤(4)中抗氨苯胂酸单克隆抗体的效价为1:204800,亲和常数为2.34×108L/mol。
5.一种权利要求1所述的检测氨苯胂酸的电化学免疫传感器检测氨苯胂酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以所述检测氨苯胂酸的电化学免疫传感器作为工作电极与参比电极和对电极构成三电极体系，在PBS缓冲溶液中采用差分脉冲伏安法(DPV)对不同浓度的氨苯胂酸进行电化学测试，得出所述电化学免疫传感器对氨苯胂酸的标准曲线；
(2)利用步骤(1)所得的标准曲线，即可计算出添加样品中氨苯胂酸的浓度。
6.根据权利要求5所述的一种检测氨苯胂酸的电化学免疫传感器检测氨苯胂酸的方法，其特征在于，所述的步骤(1)中氨苯胂酸的浓度为0.5-500ng/mL，所述的参比电极为饱和甘汞电极，所述对电极为铂丝电极。
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