CN113252754A - 一种用于磺胺间二甲氧嘧啶检测的电化学免疫传感器及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于磺胺间二甲氧嘧啶检测的电化学免疫传感器的制备方法，属于分析检测技术领域。制备方法：将制备的Ag‑GO纳米复合材料配制成Ag‑GO‑Nf溶液；利用Ag‑GO‑Nf溶液对金电极进行修饰，得到Ag‑GO‑Nf修饰的金电极；将Ag‑GO‑Nf修饰的金电极至于HAuCl₄中，进行恒电位沉积，得到AuNPs/Ag‑GO‑Nf修饰的金电极；然后依次利用anti‑SDM溶液、BSA溶液进行电极的后续修饰，得到BSA/anti‑SDM/AuNPs/Ag‑GO‑Nf修饰的金电极，即为本发明的电化学免疫传感器。该电化学免疫传感器对SDM具有极高的选择性，且检测准确度高。

Description

一种用于磺胺间二甲氧嘧啶检测的电化学免疫传感器及其制 备方法

技术领域

本发明涉及分析检测技术领域，特别是涉及一种用于磺胺间二甲氧嘧啶检测的电化学免疫传感器及其制备方法。

背景技术

近年，食品安全方面所产生的问题层出不穷，人们也逐渐的对食物质量和食品安全越来越重视。现如今，动物性食品安全已然成为焦点，怎样控制其质量安全也被人们提上日程。兽药残留作为一种重要因素，很大程度与动物源性食品质量相关，动物源性食品的兽药的残留，通过进食最后进入人的机体内，最终会危害人体健康。常见的兽药残留有磺胺类药物、四环素药物和激素类药物等，能够被应用于饲料添加剂，畜牧业或者渔业的疾病防控与治疗，但是目前其残留对人体所造成的危害已然逐渐加剧，其中致畸致癌致突变以及耐药菌株及耐药基因的产生引起人类的深思。

磺胺类抗生素(Sulfonamides,SAs)是较早的人工合成抗菌药物。从20世纪初被用作工业染料，再到1932年首次由德国化学家G.Domagk发现其具有抗感染的作用，并且，此后越来越多的磺胺类药物在数十年间相继被开发出来。目前，磺胺类药物已经被应用于临床医用和兽药抗生素等领域。SAs是白色或者略带黄色的无味粉末，大多数的SAs为两性化合物，并且较难溶于水。磺胺间二甲氧嘧啶(Sulfadimethoxine,SDM)是种常见的磺胺类抗生素，分子式为C₁₂H₁₄N₄O₄S，呈现出黄色或者稻黄色粉末的外部特征。磺胺间二甲氧嘧啶不仅具有广谱的抗菌效果，还可以对球型虫或者弓形体具有相应的药理作用。它也可以被作为饲料添加剂应用于养殖禽兽以及鱼类的疾病治疗和预防。广泛应用磺胺类药物为我们带来巨大效益的同时，不在少数的副作用也将接踵而来。其中主要存在着过敏反应，以及对造血系统、消化系统或泌尿系统等产生不利的影响。除此之外，由于磺胺类抗生素的滥用产生了大量的抗性基因与耐药菌株，给临床上带来了极大的挑战，甚至有些细菌所造成的感染遇到无药可治的境地。

目前磺胺类抗生素的残留检测方法有多种，例如，液相色谱，质谱法，毛细管电泳以及酶联免疫吸附测试(ELISA)等生物分析方法，除此之外，还有电化学生物传感器与表面等离子共振等分析方法。气相色谱法近年来基本上很少来检测磺胺类，是因为需要用到重氮甲烷对SAs进行改造(甲基化)，但是同时存在着一些难以解决的问题，比如其衍生物比率不稳定并且操作相对繁琐。高效毛细管电泳是近年来的一种较为实用的检测技术，具有快速，微量且造成的污染较小等优点。免疫学方法由于其检测灵敏且耗时较少，也越来越得到重视与发展。磺胺类的药物多残留ELISA检测试纸条也得到了长足的进展，其灵敏度也变得越来越好，并且拥有快速且便捷的优势。与此同时，电化学生物传感器的检测方法也逐步展现出其强而有力的优势，设备低廉且便携，检测快速又灵敏，越来越受到科研工作者的关注。

国际食品法典委员会规定SAs总量不超过0.1mg/kg。美国的FDA作出规定，动物源性食品的磺胺类残留量为100ng/mL，且不能含磺胺甲噁唑(SMZ)。欧盟也对磺胺类制定了最高限量，总量在肉或奶中不得超过100μg/kg。近年来，各个国家对磺胺类残留制定了越来越严格的规定，比如我国农业农村部，在2019年制定了国家标准(GB31650-2019),磺胺类(按总量计)在动物源性食品中的最高残留量为100μg/kg。

作为生物传感器的一种，电化学生物传感器将生物传感技术与电化学分析技术结合在一起。电化学生物传感器具有许多优良特性，比如，具有高的灵敏度，较好的选择性，便携且能够实现对较为复杂体系中的样品进行快速的检测而深受人们的关注。目前，电化学免疫传感器在许多领域受到人们广泛的使用，包括食品工业，环境检测，临床医学和兽医学等领域。随着科研工作者对其不断地探索，电化学生物传感器的种类不断的多元化发展，其相应的分析性能也不断地提高，并且，该传感器在设备便携化、自动化与智能化等走在了世界发展的前列。

目前，检测磺胺间二甲氧嘧啶的方法中，液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)使用较为广泛，虽然结果精准，但是操作较为复杂且耗时，电化学免疫传感器虽然具有高灵敏度、快速检测的特点，但目前的电化学免疫传感器对于SDM的选择性较差，因此，提供一种对SDM选择性好、准确度高的电化学免疫传感器用于SDM的电化学免疫检测具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于磺胺间二甲氧嘧啶检测的电化学免疫传感器及其制备方法，以解决上述现有技术存在的问题，实现对SDM高选择性、高准确度的检测。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明的目的之一是提供一种用于磺胺间二甲氧嘧啶检测的电化学免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：

(1)制备Ag-GO纳米复合材料：

a.将氧化石墨烯在水溶液中进行超声分散处理，得到GO胶体溶液；

b.将葡萄糖溶解于GO胶体溶液中，得到溶液A；

c.将NH₃·H₂O和AgNO₃溶液进行搅拌反应，至溶液中的沉淀消失，得到溶液B；

d.将溶液B和溶液A混合搅拌反应，静置，离心后洗涤，收集沉积物，即得Ag-GO纳米复合材料；

(2)制备Ag-GO-Nf溶液：

将Ag-GO纳米复合材料分散在Nafion-乙醇溶液中，得到Ag-GO-Nf溶液；

(3)电化学免疫传感器的制备：

e.将Ag-GO-Nf溶液加至金电极表面，干燥后得到Ag-GO-Nf修饰的金电极；

f.将Ag-GO-Nf修饰的金电极置于HAuCl₄中，进行恒电位沉积，得到AuNPs/Ag-GO-Nf修饰的金电极；

g.将anti-SDM溶液加至AuNPs/Ag-GO-Nf修饰的金电极表面，在37℃下进行孵育，得到anti-SDM/AuNPs/Ag-GO-Nf修饰的金电极；

h.将BSA溶液加至anti-SDM/AuNPs/Ag-GO-Nf修饰的金电极表面，在37℃下进行孵育，得到BSA/anti-SDM/AuNPs/Ag-GO-Nf修饰的金电极，即为用于磺胺间二甲氧嘧啶检测的电化学免疫传感器。

进一步地，所述HAuCl₄溶液的浓度为3‰，恒电位沉积时的电位为-0.2V。

进一步地，anti-SDM溶液的浓度为22μg mL^-1。

进一步地，在步骤e之前，还包括对金电极进行预处理的步骤。

本发明的目的之二是提供一种上述制备方法得到的用于磺胺间二甲氧嘧啶检测的电化学免疫传感器。

本发明的目的之三是提供一种磺胺间二甲氧嘧啶的电化学免疫检测方法，包括以下步骤：将含有磺胺间二甲氧嘧啶的样品加至电化学免疫传感器表面，用差分脉冲伏安法进行检测；所述电化学免疫传感器为上述用于磺胺间二甲氧嘧啶检测的电化学免疫传感器。

本发明公开了以下技术效果：

本发明制备的电化学免疫传感器对SDM具有极高的选择性，且检测准确度高。电化学免疫传感器的重现性相对标准偏差为1.15％，体现出良好的重现性；循环伏安法实验结果显示，电流信号在保存2天后没有明显的降低，在14天的时候，电流信号值为初始电流值的84.5％，体现出极高的稳定性；经干扰物及SDM修饰，免疫传感器的电流信号的变化与仅有SDM存在时检测结果基本一致，体现出极好的选择性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明Ag-GO-Nf纳米复合材料制备流程图；

图2为氧化石墨烯(GO)和Ag-GO纳米复合材料的SEM图，其中，图2A为GO的SEM图，图2B为Ag-GO纳米复合材料的SEM图；

图3为GO和Ag-GO纳米复合材料的紫外可见光光谱；

图4为GO和Ag-GO纳米复合材料的XRD表征图谱；

图5为Ag-GO-Nf和GO-Nf复合材料的CV表征图谱；

图6为SDM电化学免疫传感器的制备流程图；

图7为AuNPs/Ag-GO-Nf修饰金电极的EDS图；

图8是AuNPs/Ag-GO-Nf修饰电极的SEM图，其中，图8(A)为放大300倍的SEM图，图8(B)为放大200倍的SEM图；

图9为各修饰电极的CV图；

图10为所制备的免疫传感器不同扫速与氧化还原峰电流的关系以及氧化还原峰电流与扫速的拟合曲线，其中，图10(A)为所制备的免疫传感器不同扫速与氧化还原峰电流的关系，图10(B)为氧化还原峰电流与扫速的拟合曲线；

图11为五支传感器的重现性测试、稳定性测试、循环伏安法测试和选择性测试；

其中，图11(A)对5根独立的不同免疫传感器进行SDM的重现性测试，图11(B)为连续50圈的循环伏安法测试，图11(C)为SDM免疫传感器的稳定性测试(20ng mL^-1)，图11(D)制备的SDM免疫传感器的选择性测试；

图12为HPLC峰面积与SDM浓度值的关系。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1

银-氧化石墨烯(Ag-GO)纳米复合材料的制备:

(1)取10mg的氧化石墨烯(GO)加入到含有10mL超纯水的25mL的玻璃烧杯中，将玻璃烧杯置于冰水混合物中，利用超声波清洗仪进行超声分散处理，期间不断加新冰保持其冰水混合物。然后得到稳定且呈现出黄色透明的GO胶体溶液，离心(6000rpm,10min)除去未分散的GO，最后定容至10毫升，得到GO胶体溶液(1mg/mL)。

(2)在不断的搅拌下，将葡萄糖(0.5g)溶解于上述GO溶液中(1mg mL^-1)，得到A溶液。

(3)将5mol mL^-1NH₃·H₂O缓缓滴加于6.7mlAgNO₃溶液中(0.06mol L^-1)，期间需要不断地搅拌并观测，直至AgOH/Ag₂O沉淀消失，获得新鲜的银氨溶液(B溶液)。

(4)将获得的B溶液加到溶液A后搅拌3-5min，室温静置1.5h。离心(3000rpm,10min)，随后用超纯水洗涤数次，利用精密pH试纸，测量其pH值，直至达到接近中性即可，否则再次离心后洗涤。将所得到的沉积物，Ag-GO纳米复合物，干燥(60℃)过夜。

将Ag-GO纳米复合材料制备成Ag-GO-Nf纳米复合材料：

将上述制得的Ag-GO纳米复合物沉淀分散在0.4％Nafion-乙醇溶液，即为Ag-GO-Nf溶液，在冰箱中4℃中保存即可。

图1为Ag-GO-Nf纳米复合材料制备流程图。

实施例2

银-氧化石墨烯(Ag-GO)纳米复合材料的表征

将Ag-GO纳米复合材料固定在样品台上，利用扫描电镜进行表面形貌的观测。图2为氧化石墨烯(GO)和Ag-GO纳米复合材料的SEM图，其中，图2A为GO的电镜图，图2B为Ag-GO纳米复合材料的SEM图；由图2A可以看出，GO具有褶皱边缘的单层片层，并且显示出GO的皱褶结构，此结构形态又轻又薄，如纸片状；由图2B可以看出，银纳米粒子(AgNPs)在GO片层上分布均匀，证明了Ag-GO的合成成功。

将所合成的Ag-GO-Nf溶液使用PBS(0.01M，7.4)稀释20倍得到溶液C，再将上述GO溶液也用同样的方式稀释20倍，得到溶液D，使用NanoDrop 2000c分光光度计进行试验。首先用超纯水清洗，再使用PBS(0.01M，7.4)进行对比，然后依次采用紫外可见光谱法(UV-vis)和X-射线衍射技术(XRD对溶液C和溶液D进行表征。UV-vis结果如图3所示曲线(A)对应着的是GO的紫外可见光谱图，并且在该波长的范围中，不存在吸收峰；曲线(B)对应着的是Ag-GO的紫外可见光谱图，在这个相应的波长范围中，于410nm处存在一个明显的吸收峰，对应着银的特征吸收峰，证明了银元素结合到GO上，可初步判断，Ag-GO纳米复合材料合成成功。

XRD实验条件：采用CuKα辐射(λ＝0.154nm)，管压40kV，管流30mA，2θ值的范围为2-80°。XRD结果如图4所示，中2θ的范围是2°-80°；Ag-GO中出现了四个2θ分别为37.3°，44.1°，64.2°和77.1°的衍射峰，其分别对应于银(111)、(200)、(220)和(311)的晶面衍射峰，由此可以推断，Ag-GO纳米复合材料的合成成功。

将7μL的上述Ag-GO-Nf溶液和GO-Nf溶液(GO分散在Nafion-乙醇溶液中制得)分别滴加在金电极表面，室温下，晾干。使用CV法进行测试，参数如下：扫描电位为-0.2V-0.6V(vs.SCE)，扫速为50mV s^-1。在0.1M的PBS缓冲溶液中进行测试。

利用CV法分别对Ag-GO-Nf和GO-Nf复合材料修饰的金电极进行表征。结果如图5所示，当仅用GO-Nf复合材料修饰金电极时，没有出现明显的氧化还原峰，即未产生明显的电流信号，是因为GO-Nf复合材料修饰的金电极表面没有氧化还原探针的存在，因而没有电流信号的产生。但是由于银纳米粒子具有氧化还原特性，Ag-GO-Nf可以充当氧化还原探针，因此Ag-GO-Nf纳米复合材料修饰的金电极出现了明显的氧化还原峰，即明显的电流信号。综上所述，已成功的将银纳米粒子原位还原至GO片层上，并且Ag-GO-Nf修饰的金电极能得出很好的电流信号。

实施例3

金电极的预处理及打磨标准

修饰之前，需要将金电极(Φ＝4mm)分别用0.1、0.3和0.05μm的氧化铝粉打磨抛光，时间在1-3min之间，通过划“8”字形进行打磨，从而处理为镜面，接着，再按顺序使用超纯水，无水乙醇对其进行超声处理，最后再使用一遍超纯水进行处理，每次超声清洗的时间不超过2min，防止超声时间过长可能会导致金电极使用寿命的减少。超声清洗是用来除去电极表面因物理吸附而产生的些许杂质。电极的打磨是修饰前的重要步骤，不能够随意省略步骤，否则很可能会导致后续的实验不能正常的进行。随后，需要将打磨好的电极进行一系列的检测，从而保证打磨后的效果。其操作如下：(1)将电极置于K₃Fe(CN)₆检测液中(5mM)，CV法检测参数为：扫速50mV s^-1，扫描电压的范围-0.4V-0.6V(vs.SCE)。扫描10圈左右，直到观察并得到稳定的基线，电位差小于100mV。(2)在0.1M的硫酸中，利用循环伏安法(CV)进行检测，可将参数调制为：扫速100mVs^-1，扫描电压的范围-0.2V-0.6V。扫描10圈左右后，可在电压为0.85V处有较为尖锐的还原峰，1-1.5V左右处有两到三个连小的氧化峰。(3)最后，符合上述标准的电极预示着其清洗干净，再使用超纯水彻底冲洗并在室温下晾干备用即可。

实施例4

SDM电化学免疫传感器的建立

建立一种基于AuNPs/Ag-GO-Nf纳米复合材料的电化学免疫传感器，用来检测猪肉和猪肝中SDM的含量，制备过程如下：

(1)首先，将7μL Ag-GO-Nf溶液在室温下滴涂至处理过后的金电极表面，晾干后得到Ag-GO-Nf修饰的金电极。(2)然后，将此修饰的金电极于15mL的HAuCl₄(3‰)溶液中，在电位为-0.2V的条件下，在电极表面进行恒电位沉积AuNPs沉积时间为750s，从而得到AuNPs/Ag-GO-Nf敏感界面。(3)再将AuNPs/Ag-GO-Nf修饰电极表面滴加20μL anti-SDM(22μg mL^-1)溶液，在37℃下孵育90min。由于AuNPs具有较强的吸附能力，anti-SDM可以通过Au-N键被固定在电极表面。得到anti-SDM/AuNPs/Ag-GO-Nf修饰的金电极。(4)最后，需要消除非特异性结合的影响，使用10μL BSA(0.25％)溶液滴加在电极表面，37℃孵育30min，起到封闭其表面残留的活性位点的作用。得到BSA/anti-SDM/AuNPs/Ag-GO-Nf修饰的金电极。(5)将含有SDM的处理样品，滴加在上述制备的BSA/anti-SDM/AuNPs/Ag-GO-Nf修饰的金电极，用差分脉冲伏安法进行检测。在电极修饰过程中的每一步修饰后，都需要用PBS(pH7.4)冲洗，除去由物理吸附产生的杂质。SDM电化学免疫传感器制备流程图如图6所示。

采用能谱分析技术(Energy Dispersive Spectrometer,EDS)对AuNPs/Ag-GO-Nf纳米修饰金电极元素组成进行表征，结果见图7，由图7(A)可以看出不同元素的组分，图谱显示：(1)金属元素中，金的含量显示最高，约占有所有元素总量的70％。因为电极本身属于金电极，并且由于本申请也采取了恒电位沉积金纳米粒子，所以其金元素所占比例最大。(2)在金属元素中，银的含量次之，占所有元素总量的10％左右。本申请在电极表面滴加了Ag-GO-Nf溶液，因为存在大量的银纳米粒子，所以有金属银存在，并且含量的大小仅次于金元素。(3)在非金属元素中，存在大量的碳元素(C)和氧元素(O)，这是由于本申请所采用的纳米粒子的载体为氧化石墨烯(GO)，其本身含有大量的羰基、羧基以及含氧基团，因此存在大量的C、O元素。由图7(B)可以看出，电极表面存在金元素、银元素、氧元素和碳元素。颜色对应元素分别为：紫色对应的是银元素，绿色对应的是金元素，浅蓝色对应的是氧元素以及红色对应的是碳元素。由图7(C)可知，紫色对应的是银元素，并且紫色分布较为密集，并且分散程度很好，从而得知，银元素在电极表面的分布较为密集且均匀。图7(D)可以看到，绿色对应的是金元素，由于绿色的分布非常密集且分散程度很好，从而可知，金元素在电极的表面存在非常密集，并且分布也很均匀。由此可见，上述分析结果也可以初步判断，Ag-GO纳米复合材料合成比较成功。

图8是AuNPs/Ag-GO-Nf修饰电极的SEM图，其中，图8(A)为放大300倍的SEM图，图8(B)为放大200倍的SEM图，图8(A)显示金纳米粒子AuNPs成功沉积，图8(B)可以看出金纳米颗粒具有球形结构，直径约为650nm，并且金纳米颗粒的分散程度较好。

实施例5

电化学免疫传感器的电化学表征：

电极的电化学表征所采用的是CV法，在20mL的PBS(含0.1M KCl，pH7.4)缓冲溶液中进行，扫描电位：-0.2-0.6V(vs.SCE)，扫速：50mV s^-1。用CV法测试并保存每一步修饰过程后的数据。

图9为各电极的CV图，其中，a为Ag-GO-Nf修饰的电极CV图，图b为AuNPs/Ag-GO-Nf修饰的电极CV图，c为anti-SDM/AuNPs/Ag-GO-Nf修饰的电极CV图,d为BSA/anti-SDM/AuNPs/Ag-GO-Nf修饰的电极CV图。如图9所示，曲线a具有一对很好的氧化还原电流响应，因为银纳米粒子可以充当氧化还原的电子媒介体，表明了Ag-GO具有良好的氧化还原活性。当在传感器电极的表面进一步恒电位沉积金纳米粒子后，曲线b得到了一对电流信号增强很多的氧化还原峰。这是因为，金纳米粒子具有很好的导电性，能够极快的增强氧化还原探针和电极表面间电子的转移速率。从曲线c和d可知，在传感器电极的表面进一步孵育SDM抗体和封闭剂BSA后，电流信号都会明显下降。最后，比较曲线d与e可知，曲线e呈现出显著的下降电流相应，是因为该电化学免疫传感器电极的表面修饰了目标抗原SDM，由于抗原抗体的特异性结合，产生的免疫复合物能够极大的阻碍电子的转移。有研究表明，抗体和BSA等不导电的蛋白质生物大分子或封闭剂均可以阻碍电子传输。综上所述，利用电化学分析方法(CV法)，证明SDM免疫传感器的制备成功。

实施例6

电化学免疫传感器扫速与电压的关系

研究电化学免疫传感器扫速和电压的关系，可以通过循环伏安法(CV)进行测试，可以在20mL的PBS(0.1mol L^-1，pH 7.4)中进行。其扫描电位：-0.2-0.6V(vs.SCE)，扫速分别为：25，50，75，100，125，150，175，200，225，250mV s^-1。用电化学工作站测试并保存各项数据。

图10为所制备的免疫传感器不同扫速与氧化还原峰电流的关系以及氧化还原峰电流与扫速的拟合曲线，其中，(A)为所制备的免疫传感器不同扫速与氧化还原峰电流的关系，(B)为氧化还原峰电流与扫速的拟合曲线。由图10可知，在25-250mV s^-1扫速之间，随着扫速的增加，阳极峰电流(Ipa)和阴极峰电流(Ipc)均增加。其中阳极峰电流的拟合曲线为：Y＝60.11*X+23.52(R²＝0.9915)；阴极峰电流的拟合曲线为：Y＝-57.46*X+71.52(R²＝0.9924)。并且扫速的平方根和两峰电流均呈线性关系，预示着银纳米粒子在电极上的氧化还原过程是受扩散控制的。

实施例7

电化学免疫传感器性能的分析

电化学免疫传感器性能的评价，需要对其重现性、稳定性以及选择性进行测试。

(1)重现性测试：其他条件不变的情况下，用制备好的5根传感器去检测同一浓度的SDM(20ng mL^-1)，利用DPV法测定其相关的电流信号强度，并计算相应的相对标准偏差。

(2)稳定性测试：利用CV法，将制备好的免疫传感器表面滴加含20ng mL^-1的SDM溶液。将一根电极连续扫描50圈，再做2组重复组，测定其电流信号并计算相对标准偏差。将5根传感器在4℃冰箱中长期保存，每隔2天拿出并对该免疫传感器进行CV法测试，测试的天数分别为：0d，2d，4d，6d，8d，10d，12d，14d。

(3)选择性测试：为了获得特异性的电化学免疫传感器，需要对所制备的SDM传感器进行选择性测试。选择性实验测试如下：

磺胺类干扰：磺胺间甲氧嘧啶(Sulfamonomethoxine，SMM)，磺胺甲基嘧啶(Sulfamerazine，SM1)以及磺胺二甲基嘧啶(sulfamethazine，SM2)等磺胺类药物干扰实验的测定。将所制备的SDM免疫传感器分别滴加20μL的上述SMM、SM1以及SM2等干扰物(100ngmL^-1)，利用DPV法进行测试。

其他抗生素干扰：沃尼妙林(Valnemulin，VAL)和莱克多巴胺(Ractopamine，RAC)等抗生素的干扰实验的测定。分别在制备完好的SDM免疫传感器表面滴20μL上述VA和RAC等干扰物(100ng mL^-1)，然后可以使用DPV法进行测试。混合后的干扰实验：第一组混合物，含有浓度为100ng mL^-1的SMM、SM1、SM2、VAL、RAC以及SDM混合溶液。第二组为，含有浓度为100ng mL-1的SMM、SM1、SM2、VAL以及RAC的混合溶液。分别将上述混合溶液，滴加在组装完好的SDM电化学免疫传感器表面，随后，用DPV法测试。设置仅含有PBS的空白对照组，以及仅含有100ng mL^-1的SDM进行实验。

为了研究该电化学免疫传感器的重现性，本申请将已经制备好的五支传感器来检测同一浓度的SDM(20ng mL^-1)，结果见图11。由图11(A)可知，五支传感器呈现出基本一致的电流信号并获得了1.15％相对标准偏差，表明了该电化学免疫传感器具有良好的重现性。

该电化学免疫传感器的稳定性可以通过循环伏安法连续扫描50圈以及长期保存等方式进行测试。由图11(B)可知，在PBS缓冲溶液中进行50圈的循环伏安扫描后，该传感器的电流仅下降了5.51％。并且，将所制备的免疫传感器置于4℃保存，每隔2天对该免疫传感器进行循环伏安法测试。由图11(C)可知，电流信号在保存2天后没有明显的降低，在14天的时候，电流信号值为初始电流值的84.5％，说明此传感器的稳定性是可以接受的。这可能是因为以下原因：①Nafion分散剂具有很好的化学稳定性以及良好的成膜能力，促进了Ag-GO-Nf稳定的修饰在电极表面。②金纳米粒子具有很强的吸附能力可以稳定固抗体分子从而有显著改善该电化学免疫传感器的稳定性。

电化学免疫传感器的选择性可以通过该传感器对干扰物的电流响应进行测量。结果如图11(D)所示，孵育干扰物(SMM，SM1，SM2，RAC和VAL，浓度均为20ng mL^-1)前后，传感器的电流信号没有明显的变化，而孵育目标物SDM(20ng mL^-1)之后，电流信号发生了较大的变化。将上述干扰物混合后，修饰到免疫传感器表面，测得的电流信号没有发生较大的变化。再将上述干扰物与SDM组成的混合物修饰到免疫传感器上，此时得到的电流信号的变化与仅有SDM存在时时检测结果基本一致。说明该传感器具有较好的选择性。

实施例8

猪肉和猪肝样品的处理以及添加回收实验

(1)猪肉和猪肝样品的处理：准确称量均质后的猪肉和猪肝样品各4g，分别放置在50mL离心管再加入4gNa₂SO₄和16mL乙腈，并搅拌均匀，振荡10分钟左右后离心5min(5000rpm)，将上清液放入干净的离心管中，再次将剩余的猪肉和猪肝组织再次加入16mL乙腈，再次搅拌离心，取上清后收集。将上清液转至分液漏斗，加16mL正己烷混匀静置0.5h后将下层置于鸡心瓶中，加入正丙醇10mL后利用旋转蒸发仪旋蒸(40℃)。旋蒸后用乙腈溶解并过滤(0.45μm滤膜)。

(2)SDM添加回收实验：将处理好的猪肉肌肉组织和猪肝稀释液加入SDM，其含量设置3梯度：0.5ng·mL^-1，5ng·mL^-1，50ng·mL^-1。并且每次的检测均需要设置3个重复组。在样品处理的过程中，由于SDM的溶解度在中性环境中较低，需要略微调节猪肉肌肉组织和猪肝稀释液的pH值(略酸环境)，以便SDM在其中彻底溶解。

为了测试建立的电化学免疫方法的准确性，采用添加回收实验检测含有样品(SDM)的猪肉和猪肝。将猪肉和猪肝提取物混合不同浓度的SDM(5ng mL^-1，50ng mL^-1，100ngmL^-1)滴加在电极表面并测试，根据标准曲线确定混合溶液中SDM的含量。结果如下表1可知。在猪肉样品中的添加回收实验中，SDM的回收率为90.69％-111.10％，相对标准偏差为7.04％-13.75％；在猪肝样品中的添加回收实验中，SDM的回收率为94.88％-110.55％，相对标准偏差为7.34％-12.45％。

表1 SDM在猪肉和猪肝样品中的分析(n＝3)

实施例9

高效液相色谱检测磺胺间二甲氧嘧啶

(1)标准曲线的绘制以及线性关系

精确取得10μg mL^-1的SDM标准工作液，用流动相分别稀释，浓度为0.001，0.005，0.01，0.05，0.1，0.5μg mL^-1的SDM标准工作液，用高效液相色谱进行检测。SDM浓度为横坐标，再以相对应的峰面积为纵坐标，绘制出标准曲线。通过向空白的猪肉和猪肝样品中，添加标准溶液来确定最低检测限(LOD)，最低检测限的标准是以信噪比为3(S/N＝3)时，对应的药品浓度来确定的。

用相应的色谱峰面积为纵坐标(y)，对应样品中的SDM溶液浓度为横坐标(x)，从而绘制出标准曲线，其标准曲线如图所示。线性方程为Y＝54.55*X+41.85，相关系数R²为0.9998。如图11所示，其线性响应范围可以很好的满足测定的要求。

(2)添加回收实验

将空白的猪肉和猪肝样品，分别配置成浓度为0.005，0.05，0.1μg mL^-1的样品，每个浓度设置为3个平行样本，计算并求出回收率。

通过添加回收实验可知，猪肉和猪肝样品的SDM磺胺类药物的回收率较为接近，猪肉样品的回收率在90.00％-96.05％之间，猪肝样品的回收率在92.08％-96.40％之间。且相对标准偏差小于13.75％。满足方法测定的要求，具体如下表2所示。

表2 HPLC测定猪肉和猪肝中的SDM(n＝3)

实施例10

制备参数对电化学免疫传感器检测SDM效果的影响

1.调整HAuCl₄的浓度为1％：

该条件下制备得到的电化学免疫传感器用于上述猪肉和猪肝样品的处理以及添加回收实验中，将猪肉和猪肝提取物混合不同浓度的SDM(5ng mL^-1，50ng mL^-1，100ng mL^-1)滴加在电极表面并测试。

在猪肉样品中的添加回收实验中，实验效果最优的为，SDM浓度为5ng mL^-1时，SDM回收率为90.58％，相对标准偏差为13.28％；在猪肝样品中的添加回收实验中，实验效果最优的为，SDM浓度为5ng mL^-1时，SDM的回收率为92.63％，相对标准偏差为13.21％。

2.调整HAuCl₄的浓度为5‰：

该条件下制备得到的电化学免疫传感器用于上述猪肉和猪肝样品的处理以及添加回收实验中。将猪肉和猪肝提取物混合不同浓度的SDM(5ng mL^-1，50ng mL^-1，100ng mL^-1)滴加在电极表面并测试。

在猪肉样品中的添加回收实验中，实验效果最优的为，SDM浓度为100ng mL^-1时，SDM的回收率为91.16％，相对标准偏差为14.26％；在猪肝样品中的添加回收实验中，实验效果最优的为，SDM浓度为5ng mL^-1时，SDM的回收率为112.65％，相对标准偏差为13.15％。

3.调整anti-SDM的浓度为10μg mL^-1：

该条件下制备得到的电化学免疫传感器用于上述猪肉和猪肝样品的处理以及添加回收实验中。将猪肉和猪肝提取物混合不同浓度的SDM(5ng mL^-1，50ng mL^-1，100ng mL^-1)滴加在电极表面并测试。

在猪肉样品中的添加回收实验中，实验效果最优的为，SDM浓度为5ng mL^-1时，SDM的回收率为123.15％，相对标准偏差为14.33％；在猪肝样品中的添加回收实验中，实验效果最优的为，SDM浓度为100ng mL^-1时，SDM的回收率为90.23％，相对标准偏差为12.67％。

4.调整anti-SDM的浓度为30μg mL^-1：

该条件下制备得到的电化学免疫传感器用于上述猪肉和猪肝样品的处理以及添加回收实验中。将猪肉和猪肝提取物混合不同浓度的SDM(5ng mL^-1，50ng mL^-1，100ng mL^-1)滴加在电极表面并测试。

在猪肉样品中的添加回收实验中，实验效果最优的为，SDM浓度为5ng mL^-1时，SDM的回收率为91.16％，相对标准偏差为2.98％；在猪肝样品中的添加回收实验中，实验效果最优的为，SDM的回收率为109.11％，相对标准偏差为11.54％。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (6)

1.一种用于磺胺间二甲氧嘧啶检测的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)制备Ag-GO纳米复合材料：

a.将氧化石墨烯在水溶液中进行超声分散处理，得到GO胶体溶液；

b.将葡萄糖溶解于GO胶体溶液中，得到溶液A；

c.将NH₃·H₂O和AgNO₃溶液进行搅拌反应，至溶液中的沉淀消失，得到溶液B；

d.将溶液B和溶液A混合搅拌反应，静置，离心后洗涤，收集沉积物，即得Ag-GO纳米复合材料；

(2)制备Ag-GO-Nf溶液：

将Ag-GO纳米复合材料分散在Nafion-乙醇溶液中，得到Ag-GO-Nf溶液；

(3)电化学免疫传感器的制备：

e.将Ag-GO-Nf溶液加至金电极表面，干燥后得到Ag-GO-Nf修饰的金电极；

f.将Ag-GO-Nf修饰的金电极置于HAuCl₄中，进行恒电位沉积，得到AuNPs/Ag-GO-Nf修饰的金电极；

g.将anti-SDM溶液加至AuNPs/Ag-GO-Nf修饰的金电极表面，在37℃下进行孵育，得到anti-SDM/AuNPs/Ag-GO-Nf修饰的金电极；

h.将BSA溶液加至anti-SDM/AuNPs/Ag-GO-Nf修饰的金电极表面，在37℃下进行孵育，得到BSA/anti-SDM/AuNPs/Ag-GO-Nf修饰的金电极，即为用于磺胺间二甲氧嘧啶检测的电化学免疫传感器。

2.根据权利要求1所述的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述HAuCl₄溶液的浓度为3‰，恒电位沉积时的电位为-0.2V。

3.根据权利要求1所述的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，anti-SDM溶液的浓度为22μg mL^-1。

4.根据权利要求1所述的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，在步骤e之前，还包括对金电极进行预处理的步骤。

5.根据权利要求1-4任一项所述的制备方法得到的用于磺胺间二甲氧嘧啶检测的电化学免疫传感器。

6.一种磺胺间二甲氧嘧啶的电化学免疫检测方法，其特征在于，包括以下步骤：将含有磺胺间二甲氧嘧啶的样品加至电化学免疫传感器表面，用差分脉冲伏安法进行检测；所述电化学免疫传感器为权利要求5所述的用于磺胺间二甲氧嘧啶检测的电化学免疫传感器。

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