CN110441293B - 一种基于蛋白活性保护的电化学发光传感器制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于蛋白活性保护的电化学发光传感器制备方法及应用,属于电化学发光检测技术领域。开发并首次验证了铕掺杂磷酸钆在低电位下激发可达到的高效电化学发光行为,一方面解决了发光材料在电极上的固定问题,另一方面解决了抗原抗体活性的有效保存问题。根据对不同浓度的原降钙素响应的电化学发光信号强度不同,实现对原降钙素的检测。通过采用F检验、T检验展示本方法的准确度和精密度,测试结果均小于理论值,说明该方法准确可靠。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于铕掺杂磷酸钆作为新的低电位电化学发光发射器并与核壳钯功能化的氧化亚铜纳米晶发生能量转移的传感器制备及应用,具体是采用铕掺杂磷酸钆空心球作为发光材料,钯功能化氧化亚铜作为猝灭剂,并且采用多肽链实现对抗体的定向固定,实现了在-1.15 V的低电位激发,有效保护了蛋白质的活性,提高对免疫物质检测的可行性,综上制备的一种检测原降钙素的猝灭型电化学发光传感器,属于电化学发光检测技术领域。
背景技术
SIRS指全身炎症反应即机体对多种细胞因子/炎症介质的反应。内毒素是全身炎症反应SIR的触发因素,目前尚无明显的治疗方法。因此,原降钙素作为血清中SIRS的典型生物标志物,对SIRS的早期准确可靠诊断起着至关重要的作用。
目前检测原降钙素的分析方法主要有放射免疫分析法、酶联免疫分析法和试剂盒法,但是所用的试剂有效期短,具有放射性污染,检测周期长,灵敏度低,步骤繁琐等缺点。为了克服以上传统分析方法的缺点,本发明设计了一种特异性强、灵敏度高、无放射性污染、操作快速简便的电致化学发光免疫分析方法。
电化学发光是由电化学反应直接或间接引发的化学发光现象,作为电化学和化学发光互相交叉渗透的产物,该方法既有发光分析的超高灵敏度,又结合了电化学电位可控的优点,所以引起了分析化学和生物分析等诸多领域的高度重视。传统的发光材料具有优秀的发光效果但是难以固载于电极表面,新兴的许多发光体,例如硫化镉等镉基材料具有生物毒性并且必须施加高电位激发。因此,无毒、低电位激发以保存生物活性且电极固载性好的发光材料成为了研究的重点。因此,本发明制备了一种铕掺杂磷酸钆空心球作为基底,以钯功能化氧化亚铜作为猝灭探针,构建了一种双猝灭型的电致化学发光传感器用于原降钙素的检测。
发明内容
本发明的目的是针对现有传感器的生物活性保护提供一种适合的应对方法,并且针对现有的全身炎症反应综合症的检测方法存在的问题,提供一种新颖的基于钯功能化氧化亚铜猝灭铕掺杂磷酸钆空心球的电致化学发光免疫传感器的制备并实行对实际样品的检测应用,实现对全身炎症反应综合症的疾病标志物的快速、灵敏、特异、高效检测,并且整个方法所用原料成本低,制备工艺简单,耗时小,具有良好的应用前景。
为实现上述目的,本发明采用的技术方案如下:
一种基于蛋白活性保护的电化学发光传感器制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)依次用1.0、0.3、0.05 μm的氧化铝粉末对玻碳电极进行抛光,在超纯水和乙醇中超声清洗,氮气吹干;
(2)在处理好的电极表面滴加6 μL、浓度为0.5~5 mg/mL的铕掺杂磷酸钆分散液作为传感基底材料,4 °C下晾干成膜;
(3)加入3~8 mM巯基乙酸在4 °C下浸泡5 h后转入EDC/NHS混合体系中浸泡30 min来活化羧基。
(4)继续在4 °C条件下浸泡浓度为5~15 μg/mL的原降钙素抗体1 h,用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液洗净电极表面,4°C下晾干;
(5)在质量浓度为1~3%的牛血清白蛋白中浸泡来封闭非特异性活性位点,用pH7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面,常温下晾干;
(6)滴加6 μL、浓度为0.0001~50 ng/mL的原降钙素抗原,在室温下孵化1 h后,用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面,室温下晾干;
(7)继续滴加6 μL、浓度为2~4 mg/mL的钯功能化的氧化亚铜立方晶捕获抗体孵化液于电极表面,室温下孵化1 h,用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液缓慢冲洗电极表面,室温下晾干。
所述的一种基于蛋白活性保护的电化学发光传感器制备方法,其特征在于,所述基底材料铕掺杂磷酸钆的制备,包括以下步骤:
(1)酚醛树脂模板球的制备
在45~55 mL去离子水中加入0.1806 g 3-氨基酚和质量分数为25%的氨水90~100µL,在30ºC下搅拌10 min,形成清晰的溶液。加入100~150 µL甲醛溶液后,30 s后溶液变白。再持续搅拌4 h后,将所得混合物转移到100 mL聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压釜中,在100ºC下保持24 h。最后用去离子水和酒精洗涤两次将样品离心纯化,最终在空气中干燥;
(2)铕掺杂磷酸钆的制备
首先,制备前驱体:将3 g尿素、0.5~1.5 mmol 硝酸钆水溶液、0.01~0.08 mmol硝酸铕水溶液和0.1~0.3 g上述合成的酚醛树脂球分别加入到20~30 mL去离子水中。搅拌10~40 min,超声15 min,最后将混合物放入100 mL圆底烧瓶中,在70~100ºC下加热3 h。离心收集沉淀,用去离子水洗涤三次,得到碳酸氢氧钆前驱体。将得到的前驱体超声分散于25 mL去离子水中。然后将0.1~0.2 g溶于10mL去离子水的磷酸氢氨溶液滴加到上述溶液中。10min后在搅拌下加入0.1~0.2 g的十六烷基三甲基溴化铵,最终将混合溶液转移到50 mL高压反应釜中并在180ºC下加热12 h。然后用去离子水和乙醇先后洗了三遍将所得样品纯化。最后,将所得样品干燥后在500ºC下煅烧2 h,得到分级铕掺杂磷酸钆空心球。
所述的一种基于蛋白活性保护的电化学发光传感器制备方法,其特征在于,所述钯功能化的氧化亚铜标记的原降钙素检测抗体溶液的制备,包括以下步骤:
(1)钯纳米晶的制备
首先,将0.048 g 氯化十六烷基三甲基铵、9.125 mL去离子水和0.7 mL 10 mM 氯钯酸溶液分别注入样品瓶中。瓶是保存在一个水浴35ºC。接下来,500µL 1毫米溴化钾溶液和1毫米50µL 碘化钾溶液添加并混合。10 min后,注射0.05 M抗坏血酸1.2 mL。瓶是保持原状的水浴30分钟,在7500转离心两次10分钟。最终产品于400年被分散µL去离子水;
(2)钯功能化的氧化亚铜的制备
将0.087 g十二烷基硫酸钠溶于去离子水,0.1 M氯化铜溶液0.1 mL和上一步制备的0.07 mL钯纳米晶溶液加入其中后注入1.0 M的氢氧化钠溶液0.25 mL,十秒后注入0.2 M的盐酸羟胺溶液0.15 mL。反应2 h后,纳米晶溶液为以3000~8000转/分的速度离心3分钟,用去离子水和乙醇体积比为1:1的混合溶液分别冲洗3次,最终得到的产品分散于600 µL的无水乙醇;
(3)钯功能化的氧化亚铜捕获抗体孵化液的制备
将1mL 50 ng/mL HWRGWVC多肽链溶液加入上述溶液中,在4°C振荡1h。12000 转/分离心后,将沉淀物分散到1 mL pH7.4的磷酸盐缓冲溶液中。随后400 μL 0.1% 牛血清白蛋白的加入溶液中用来封闭特异性活性位点。离心分离和洗涤后;随后加入100~300 μL 10mg/mL的原降钙素抗原的捕获抗体,在4°C下孵化10~15 h;随后离心去除上清液,重新分散到在1~3 mL pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中,得到钯功能化的氧化亚铜捕获抗体孵化液,储存在4 °C下备用。
所述的一种基于蛋白活性保护的电化学发光传感器制备方法,用于样品的检测,其特征在于,步骤如下:
(1)使用电化学工作站的三电极体系进行测试,Ag/AgCl电极作为参比电极,铂丝电极为对电极,所制备的电化学发光传感器为工作电极,将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起将光电倍增管的高压设置为700 V,循环伏安扫描电位范围为-1.15~0 V,扫描速率为0.12 V/s;
(2)将处理完毕的电致化学发光传感器浸入在10 mL、pH 6.5~8.6的含浓度为0.5~1.5 mol/L过硫酸钾的磷酸盐缓冲溶液中,接通电化学发光系统,孵化不同浓度的原降钙素时传感器进行测试,根据产生的不同的电化学发光信号强度,绘制工作曲线;
(3)将待测样品溶液代替待测物抗原进行检测。
本发明的有益成果
(1)以铕掺杂磷酸钆为发光材料,巨大的比表面积和中空结构有利于电子的传输,利用铕掺杂磷酸钆在低电位下就可以激发的优势以及高且稳定的发光效率来提高传感器信号的输出,从而获得对抗体抗原的蛋白活性保护的效果及高的灵敏度。
(2)以钯功能化氧化亚铜作为猝灭剂,在氧化亚铜的包覆下,钯的猝灭效果得到进一步提升,除此之外,一方面在于钯功能化氧化亚铜具有更好的生物相容性,另一方面是为了有效地增加抗体的固载量,整体实现了电致化学发光信号的有效控制。
(3)采用HWRGWVC多肽链作为特异性捕获体,实现抗体的定向位点捕获。该方法使蛋白的抗体活性获得了保护,提高了蛋白的有效利用率。
(4)本发明首次对铕掺杂磷酸钆的电化学发光性能进行验证,并发现了新的共振能量转移对。基于此构建的传感器可应用于疾病标志物的临床检测,具有操作简单,反应快速,信号响应范围宽为0.01 pg/mL~500 ng/mL,检出限极低至0.402 fg/mL的优点。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1铕掺杂磷酸钆的制备
(1)酚醛树脂模板球的制备
在50.4 mL去离子水中加入0.1806 g 3-氨基酚和质量分数为25%的氨水93 µL,在30ºC下搅拌10 min,形成清晰的溶液。加入123 µL甲醛溶液后,30 s后溶液变白。再持续搅拌4 h后,将所得混合物转移到100 mL聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压釜中,在100ºC下保持24 h。最后用去离子水和酒精洗涤两次将样品离心纯化,最终在空气中干燥;
(2)铕掺杂磷酸钆的制备
首先,制备前驱体:将3 g尿素、1 mmol 硝酸钆水溶液、0.05 mmol硝酸铕水溶液和0.2 g上述合成的酚醛树脂球分别加入到25 mL去离子水中。搅拌30 min,超声15 min,最后将混合物放入100 mL圆底烧瓶中,在85ºC下加热3 h。离心收集沉淀,用去离子水洗涤三次,得到碳酸氢氧钆前驱体。将得到的前驱体超声分散于25 mL去离子水中。然后将0.1150 g溶于10mL去离子水的磷酸氢氨溶液滴加到上述溶液中。10 min后在搅拌下加入0.1333 g的十六烷基三甲基溴化铵,最终将混合溶液转移到50 mL高压反应釜中并在180ºC下加热12 h。然后用去离子水和乙醇先后洗了三遍将所得样品纯化。最后,将所得样品干燥后在500℃下煅烧2 h,得到分级铕掺杂磷酸钆空心球。
实施例2 钯功能化的氧化亚铜标记的原降钙素捕获抗体孵化液的制备
(1)钯纳米晶的制备
首先,将0.048 g 氯化十六烷基三甲基铵、9.125 mL去离子水和0.7 mL 10 mM 氯钯酸溶液分别注入样品瓶中,将其保存在一个35ºC水浴环境中。随后,500 µL 1 mM溴化钾溶液和1 mM 50 µL 碘化钾溶液添加并混合。10 min后,注射0.05 M抗坏血酸1.2 mL,保持水浴30分钟,在7500转/分的离心转速下两次10分钟。最终产品于400 µL的去离子水中;
(2)钯功能化的氧化亚铜的制备
将0.087 g十二烷基硫酸钠溶于去离子水,0.1 M氯化铜溶液0.07 mL和上一步制备的0.08 mL钯纳米晶溶液加入其中后注入1.0 M的氢氧化钠溶液0.25 mL,十秒后注入0.2M的盐酸羟胺溶液0.15 mL。反应2 h后,纳米晶溶液为以5000转/分的转速下离心3分钟,用去离子水和乙醇体积比为1:1的混合溶液分别冲洗3次,最终得到的产品分散于600 µL的无水乙醇;
(3)钯功能化的氧化亚铜捕获抗体孵化液的制备
将1mL 50 ng/mL HWRGWVC多肽链溶液加入上述溶液中,在4°C振荡1h。12000转/分的速度离心后,将沉淀物分散到1 mL pH7.4的磷酸盐缓冲溶液中。随后400 μL 0.1% 牛血清白蛋白的加入溶液中用来封闭特异性活性位点。离心分离和洗涤后,加入100 μL 10 mg/mL的原降钙素抗原的捕获抗体,在4°C下孵化12 h;随后离心去除上清液,重新分散到在2mL pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中,得到钯功能化的氧化亚铜捕获抗体孵化液,储存在4 °C下备用。
实施例3钯功能化的氧化亚铜标记的原降钙素捕获抗体孵化液的制备
(1)钯纳米晶的制备
首先,将0.0100 g 氯化十六烷基三甲基铵、9.125 mL去离子水和0.2 mL 10 mM氯钯酸溶液分别注入样品瓶中,将其保存在一个35ºC水浴环境中。随后,300 µL 1 mM溴化钾溶液和1 mM 50 µL 碘化钾溶液添加并混合。10 min后,注射0.05 M抗坏血酸0.5 mL。保持水浴30分钟,在7500转/分的离心转速下两次10分钟。最终产品于400 µL的去离子水中;
(2)钯功能化的氧化亚铜的制备
将0.020 g十二烷基硫酸钠溶于去离子水,0.1 M氯化铜溶液0.03 mL和上一步制备的0.02 mL钯纳米晶溶液加入其中后注入1.0 M的氢氧化钠溶液0.25 mL,十秒后注入0.2M的盐酸羟胺溶液0.15 mL。反应2 h后,纳米晶溶液为以3000~8000转/分的转速下离心3分钟,用未知比例的去离子水和乙醇混合溶液分别冲洗3次,最终得到的产品分散于600 µL的无水乙醇;
(3)钯功能化的氧化亚铜捕获抗体孵化液的制备
将1mL 10 ng/mL HWRGWVC多肽链溶液加入上述溶液中,在4 °C振荡1 h。12000转/分离心后,将沉淀物分散到1 mL pH7.4的磷酸盐缓冲溶液中。随后200 μL 0.1% 牛血清白蛋白的加入溶液中用来封闭特异性活性位点。离心分离和洗涤后;随后加入100~300 μL10 mg/mL的原降钙素抗原的捕获抗体,在4°C下孵化10 h;随后离心去除上清液,重新分散到在1 mL pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中,得到钯功能化的氧化亚铜捕获抗体孵化液,储存在4 °C下备用。
实施例4钯功能化的氧化亚铜标记的原降钙素捕获抗体孵化液的制备
(1)钯纳米晶的制备
首先,将0.0100 g 氯化十六烷基三甲基铵、9.125 mL去离子水和0.2 mL 10 mM氯钯酸溶液分别注入样品瓶中,将其保存在一个35ºC水浴环境中。随后,300 µL 1 mM溴化钾溶液和1 mM 50 µL 碘化钾溶液添加并混合。10 min后,注射0.05 M抗坏血酸0.5 mL。保持水浴30分钟,在7500转/分的离心转速下两次10分钟。最终产品于400 µL的去离子水中;
(2)钯功能化的氧化亚铜的制备
将0.020 g十二烷基硫酸钠溶于去离子水,0.1 M氯化铜溶液0.03 mL和上一步制备的0.02 mL钯纳米晶溶液加入其中后注入1.0 M的氢氧化钠溶液0.25 mL,十秒后注入0.2M的盐酸羟胺溶液0.15 mL。反应2 h后,纳米晶溶液为以3000~8000转/分的转速下离心3分钟,用未知比例的去离子水和乙醇混合溶液分别冲洗3次,最终得到的产品分散于600 µL的无水乙醇;
(3)钯功能化的氧化亚铜捕获抗体孵化液的制备
将1mL 10 ng/mL HWRGWVC多肽链溶液加入上述溶液中,在4 °C振荡1 h。12000转/分离心后,将沉淀物分散到1 mL pH7.4的磷酸盐缓冲溶液中。随后200 μL 0.1% 牛血清白蛋白的加入溶液中用来封闭特异性活性位点。离心分离和洗涤后;随后加入100~300 μL10 mg/mL的原降钙素抗原的捕获抗体,在4°C下孵化10 h;随后离心去除上清液,重新分散到在1 mL pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中,得到钯功能化的氧化亚铜捕获抗体孵化液,储存在4 °C下备用。
实施例5 制备检测原降钙素的电致化学发光免疫传感器
(1)依次用1.0、0.3、0.05 μm的氧化铝粉末对玻碳电极进行抛光,在超纯水和乙醇中超声清洗,氮气吹干;
(2)在处理好的电极表面滴加6 μL、浓度为0.5 mg/mL的鲁米诺负载的中空多片层硫化铟分散液作为传感基底材料,4 °C下晾干成膜;
(3)加入5 mM巯基乙酸在4 °C下浸泡5 h后转入EDC/NHS混合体系中浸泡30 min来活化羧基。
(4)继续在4 °C条件下浸泡浓度为5 μg/mL的原降钙素抗体 1 h,用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液洗净电极表面,4 °C下晾干;
(5)在质量浓度为2%的牛血清白蛋白中浸泡来封闭非特异性活性位点,用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面,常温下晾干;
(6)滴加6 μL、浓度为0.0001~50 ng/mL的原降钙素抗原,在室温下孵化1 h后,用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面,室温下晾干;
(7)继续滴加6 μL、浓度为3 mg/mL的钯功能化氧化亚铜捕获抗体孵化液于电极表面,室温下孵化1 h,用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液缓慢冲洗电极表面,室温下晾干。
(8)传感器构建完毕,进行电致化学发光测试。
实施例6 制备检测原降钙素电致化学发光免疫传感器
(1)依次用1.0、0.3、0.05 μm的氧化铝粉末对玻碳电极进行抛光,在超纯水和乙醇中超声清洗,氮气吹干;
(2)在处理好的电极表面滴加6 μL、浓度为2 mg/mL的鲁米诺负载的中空多片层硫化铟分散液作为传感基底材料,4 °C下晾干成膜;
(3)加入3 mM巯基乙酸在4 °C下浸泡5 h后转入EDC/NHS混合体系中浸泡30 min来活化羧基。
(4)继续在4 °C条件下浸泡浓度为10 μg/mL的原降钙素抗体 1 h,用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液洗净电极表面,4 °C下晾干;
(5)在质量浓度为1 %的牛血清白蛋白中浸泡来封闭非特异性活性位点,用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面,常温下晾干;
(6)滴加6 μL、浓度为0.0001~50 ng/mL的原降钙素抗原,在室温下孵化1 h后,用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面,室温下晾干;
(7)继续滴加6 μL、浓度为2 mg/mL的钯功能化氧化亚铜捕获抗体孵化液于电极表面,室温下孵化1 h,用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液缓慢冲洗电极表面,室温下晾干。
(8)传感器构建完毕,进行电致化学发光测试。
实施例7 对原降钙素的检测
(1)使用电化学工作站的三电极体系进行测试,Ag/AgCl电极作为参比电极,铂丝电极为对电极,所制备的电化学发光传感器为工作电极,将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起将光电倍增管的高压设置为700 V,循环伏安扫描电位范围为-1.15~0 V,扫描速率为0.15 V/s;
(2)将处理完毕的电致化学发光传感器浸入在10 mL、pH 6.5的含浓度为1.5 mol/L过硫酸钾的磷酸盐缓冲溶液中,接通电化学发光系统,孵化不同浓度的原降钙素时传感器进行测试,根据产生的不同的电化学发光信号强度,绘制工作曲线;
(3)将待测样品溶液代替待测物抗原进行检测。
实施例8 对原降钙素的检测
(1)使用电化学工作站的三电极体系进行测试,Ag/AgCl电极作为参比电极,铂丝电极为对电极,所制备的电化学发光传感器为工作电极,将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起将光电倍增管的高压设置为700 V,循环伏安扫描电位范围为-1.15~0 V,扫描速率为0.12 V/s;
(2)将处理完毕的电致化学发光传感器浸入在10 mL、pH 7.6的含浓度为1 mol/L过硫酸钾的磷酸盐缓冲溶液中,接通电化学发光系统,孵化不同浓度的原降钙素时传感器进行测试,根据产生的不同的电化学发光信号强度,绘制工作曲线;
(3)将待测样品溶液代替待测物抗原进行检测。
实施例9 采用加标回收的方法对脑脊液中原降钙素的检测
(1)向稀释的血清中加入不同浓度的原降钙素;
(2)采用标准加入法测定样品中原降钙素的平均回收率;
(3)采用F,T检验测定样品中原降钙素,得出相应的F值,T值,结果见表1。
表1检测结果可以看出,所得出的F值,T值都小于相应置信区间的标准值,因此,表明本发明可以应用于实际生物样品的检测,结果准确可靠。
表1 样品中原降钙素的检测结果
Samplecontent | ELISA (pg/mL) | Mean(pg/mL) | s | RSD(%) | This method(pg/mL) | Mean(pg/mL) | s | RSD(%) | Fvalue | Ttest |
PCT | 6.59, 6.51, 6.43,6.52, 6.50 | 6.50 | 0.04 | 0.61 | 6.59, 6.41, 6.63,6.57, 6.65 | 6.46 | 0.05 | 0.77 | 1.01 | 1.25 |
Claims (4)
1.一种基于蛋白活性保护的电化学发光传感器制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)依次用1.0、0.3、0.05 μm的氧化铝粉末对玻碳电极进行抛光,在超纯水和乙醇中超声清洗,氮气吹干;
(2)在处理好的电极表面滴加6 μL、浓度为0.5~5 mg/mL的铕掺杂磷酸钆分散液作为传感基底材料,4 °C下晾干成膜;
(3)加入3~8 mM巯基乙酸在4 °C下浸泡5 h后转入EDC/NHS混合体系中浸泡30 min来活化羧基;
(4)继续在4 °C条件下浸泡浓度为5~15 μg/mL的原降钙素抗体1 h,用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液洗净电极表面,4°C下晾干;
(5)在质量浓度为1~3%的牛血清白蛋白中浸泡来封闭非特异性活性位点,用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面,常温下晾干;
(6)滴加6 μL、浓度为0.0001~50 ng/mL的原降钙素抗原,在室温下孵化1 h后,用pH7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面,室温下晾干;
(7)继续滴加6 μL、浓度为2~4 mg/mL的钯功能化的氧化亚铜立方晶捕获抗体孵化液于电极表面,室温下孵化1 h,用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液缓慢冲洗电极表面,室温下晾干。
2.如权利要求1所述的一种基于蛋白活性保护的电化学发光传感器制备方法,其特征在于,所述基底材料铕掺杂磷酸钆的制备,包括以下步骤:
(1)酚醛树脂模板球的制备
在45~55 mL去离子水中加入0.1806 g 3-氨基酚和质量分数为25%的氨水90~100 µL,在30ºC下搅拌10 min,形成清晰的溶液, 加入100~150 µL甲醛溶液后,30 s后溶液变白。再持续搅拌4 h后,将所得混合物转移到100 mL聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压釜中,在100ºC下保持24 h, 最后用去离子水和酒精洗涤两次将样品离心纯化,最终在空气中干燥;
(2)铕掺杂磷酸钆的制备
首先,制备前驱体:将3 g尿素、0.5~1.5 mmol 硝酸钆水溶液、0.01~0.08 mmol硝酸铕水溶液和0.1~0.3 g上述合成的酚醛树脂模板球分别加入到20~30 mL去离子水中, 搅拌10~40 min,超声15 min,最后将混合物放入100 mL圆底烧瓶中,在70~100ºC下加热3 h, 离心收集沉淀,用去离子水洗涤三次,得到碳酸氢氧钆前驱体, 将得到的前驱体超声分散于25mL去离子水中, 然后将0.1~0.2 g溶于10mL去离子水的磷酸氢氨溶液滴加到上述溶液中,10 min后在搅拌下加入0.1~0.2 g的十六烷基三甲基溴化铵,最终将混合溶液转移到50 mL高压反应釜中并在180ºC下加热12 h, 然后用去离子水和乙醇先后洗了三遍将所得样品纯化, 最后,将所得样品干燥后在500ºC下煅烧2 h,得到分级铕掺杂磷酸钆空心球。
3.如权利要求1所述的一种基于蛋白活性保护的电化学发光传感器制备方法,其特征在于,所述钯功能化的氧化亚铜立方晶捕获抗体孵化液的制备,包括以下步骤:
(1)钯纳米晶的制备
首先,将0.0100~0.1000 g 氯化十六烷基三甲基铵、9.125 mL去离子水和0.2 ~0.9 mL10 mM 氯钯酸溶液分别注入样品瓶中,将其保存在一个35ºC水浴环境中, 随后,300~800 µL 1 mM溴化钾溶液和1 mM 50 µL 碘化钾溶液添加并混合, 10 min后,注射0.05 M抗坏血酸0.5~1.8 mL, 保持水浴30分钟,在7500转/分的离心转速下两次10分钟, 最终产品于400µL的去离子水中;
(2)钯功能化的氧化亚铜的制备
将0.020~0.100 g十二烷基硫酸钠溶于去离子水,0.1 M氯化铜溶液0.03~0.10 mL和上一步制备的0.02~0.10 mL钯纳米晶溶液加入其中后注入1.0 M的氢氧化钠溶液0.25 mL,十秒后注入0.2 M的盐酸羟胺溶液0.15 mL, 反应2 h后,纳米晶溶液为以3000~8000转/分的转速下离心3分钟,用未知比例的去离子水和乙醇混合溶液分别冲洗3次,最终得到的产品分散于600 µL的无水乙醇;
(3)钯功能化的氧化亚铜捕获抗体孵化液的制备
将1mL 10~100 ng/mL HWRGWVC多肽链溶液加入上述溶液中,在4 °C振荡1 h, 12000转/分离心后,将沉淀物分散到1 mL pH7.4的磷酸盐缓冲溶液中, 随后200~600 μL 0.1%牛血清白蛋白的加入溶液中用来封闭特异性活性位点, 离心分离和洗涤后;随后加入100~300 μL 10 mg/mL的原降钙素抗原的捕获抗体,在4°C下孵化10~15 h;随后离心去除上清液,重新分散到在1~3 mL pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中,得到钯功能化的氧化亚铜捕获抗体孵化液,储存在4 °C下备用。
4.如权利要求1所制备的电化学发光传感器的应用,用于样品的检测,其特征在于,步骤如下:
(1)使用电化学工作站的三电极体系进行测试,Ag/AgCl电极作为参比电极,铂丝电极为对电极,所制备的电化学发光传感器为工作电极,将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起将光电倍增管的高压设置为700 V,循环伏安扫描电位范围为-1.15~0 V,扫描速率为0.12 V/s;
(2)将处理完毕的电致化学发光传感器浸入在10 mL、pH 6.5~8.6的含浓度为0.5~1.5mol/L过硫酸钾的磷酸盐缓冲溶液中,接通电化学发光系统,孵化不同浓度的原降钙素时传感器进行测试,根据产生的不同的电化学发光信号强度,绘制工作曲线;
(3)将待测样品溶液代替待测物抗原进行检测。
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