CN103472052B - 一种多功能纳米探针GOx/Au NPs/DNA的制备方法及其激酶检测应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种以葡萄糖氧化酶功能化的金纳米粒子为探针的电致化学发光生物传感器构建方法及其在蛋白质激酶活性检测和抑制剂筛选中的应用，属于电致化学发光领域。将生物素标记的DNA和GOx共轭修饰到Au NPs表面制备多功能纳米探针GOx/Au NPs/DNA；在蛋白质激酶A和三磷酸腺苷的作用下，修饰于电极表面的多肽发生磷酸化，通过抗原-抗体的特异性识别作用，将生物素标记的抗磷酸化丝氨酸抗体结合到多肽的磷酸化位点上；再利用亲和素对生物素反应的介导作用，将GOx/Au NPs/DNA捕获到电极表面。蛋白质激酶A的浓度越大，多肽修饰电极表面产生的磷酸化位点越多，组装于传感界面的GOx就越多，GOx催化葡萄糖产生的H2O2越多，鲁米诺的发光越强，实现了对蛋白质激酶A的高灵敏检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种多功能纳米探针GOx/Au NPs/DNA的制备方法及其激酶检测应用，属于电致化学发光领域。
背景技术
目前，有成百上千种蛋白质激酶能催化蛋白质磷酸化，而蛋白质的磷酸化在信号传导网络工程、细胞功能化（细胞增殖、激素分泌、基因复制和细胞分化等）的调试等众多领域起着关键作用。蛋白质激酶能将三磷酸腺苷（ATP）上的磷酸基团催化转移到多肽链氨基酸残基的-OH上，在这一过程中，ATP转化成二磷酸腺苷（ADP）。大多数激酶催化的磷酸化作用在丝氨酸或者苏氨酸位点上，有的激酶作用在酪氨酸位点上，也有的激酶同时作用在这三个位点上被称为双特异性激酶。蛋白质激酶的过表达将导致各种疾病的产生，如糖尿病、恶性肿瘤或者阿兹海默病和慢性炎症性疾病等，因此，蛋白质激酶活性及其潜在抑制剂的检测成为一个重要的研究课题，该研究不仅为了解疾病发生和发展的基本生物过程提供宝贵意见，而且，对蛋白激酶靶向药物的设计发现和分子靶疗法研究具有重要作用。
电致化学发光法（ECL）是结合了电化学方法的简单灵敏和化学发光法的低背景信号等优点而形成的一种新型检测技术。由于具有高通用性、简单的光窗设备、良好的时间和空间控制能力、分析速度快和检测限低等优点，ECL生物传感技术在超灵敏生物分子检测和定量分析中得到了良好应用。尤其是结合了生物识别元素的高选择性和ECL技术的高灵敏度之后，ECL生物传感器被广泛应用于免疫检测、DNA分析和临床诊断等领域。然而，迄今为止，只有极少数ECL生物传感器用于蛋白质激酶的检测研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种多功能纳米探针GOx/Au NPs/DNA的制备方法及其激酶检测应用，它具有检测灵敏可靠和操作简单方便的优点。
本发明是这样来实现的，利用Au NPs良好的生物相容性和大比表面积，将biotin-DNA和GOx组装于Au NPs表面，制备多功能纳米探针GOx/Au NPs/DNA-biotin；在PKA和ATP的作用下，修饰于电极表面的多肽发生磷酸化，通过抗原-抗体特异性识别作用将生物素标记的抗磷酸化丝氨酸抗体结合到多肽的磷酸化位点上；利用亲和素-生物素反应，将GOx/Au NPs/DNA-biotin捕获到电极表面，构建基于ECL信号放大增强效应的生物传感器；在含葡萄糖和鲁米诺的底液中，GOx催化葡萄糖而原位产生H2O2，产生的H2O2则作为共生物促进鲁米诺的电致化学发光，用于对PKA活性的高灵敏检测及其抑制剂筛选研究。本方法的优点在于：（1）Au NPs与GOx对鲁米诺的电致化学发光具有良好的协同催化效应；（2）Au NPs具有高的比表面积，能够负载大量的GOx以增强ECL信号；（3）通过GOx催化葡萄糖的氧化而原位产生鲁米诺发光的共生物H2O2，一方面克服了H2O2不稳定的缺点，另一方面在电极表面产生的H2O2使得其在电极表面的浓度增大，增强了传感器的灵敏度和稳定性；（4）亲和素是四聚体结构，一个亲和素可与四个生物素相结合，在本发明中，一个亲和素分子能够与三个GOx/Au NPs/DNA-biotin多功能纳米探针相结合，增加了电极表面GOx的负载量，从而放大增强了鲁米诺的ECL信号。本发明基于多功能纳米探针设计构建的ECL生物传感器，为蛋白质激酶活性研究和抑制剂检测提供了简单、灵敏、选择性和通用性的传感平台。
为成功构建所述的ECL生物传感器，本发明采用以下技术方案：
（1）Au NPs的制备：将50mL浓度为0.05g/L的氯金酸加入到100mL的圆底烧瓶中，加热至沸腾后，在机械搅拌下迅速加入5mL质量百分浓度为1%的柠檬酸钠溶液并持续沸腾10min，当溶液颜色由黄色变成深酒红色时，即获得平均粒径约为14nm的稳定且单分散的Au NPs，于4℃保存备用；
（2）GOx/Au NPs/DNA多功能纳米探针的制备：先将0.3mL生物素标记的DNA溶液加入到5mL步骤（1）制备的Au NPs溶液中，孵化24h，将DNA修饰的Au NPs分散于0.1M NaCl溶液中；将0.2mL浓度为2mg/mL的GOx加入到0.2mL上述溶液中，25℃搅拌1h，再加入1mL质量百分浓度为1%的BSA溶液以封闭Au NPs表面多余的活性位点；将得到的溶液于13000rpm离心10min，除去上层清液后得到多功能纳米探针GOx/Au NPs/DNA，将其重悬于PBS缓冲溶液中备用；
（3）ECL传感器的组装：金电极在修饰之前，先分别在粒径为1.0、0.3和0.05μm的α-Al2O3糊中抛光，再用乙醇和水超声清洗1min，在0.5M的H2SO4中于-0.2～1.55V电位范围内循环伏安扫描，直到得到重复性良好的循环伏安曲线为止；将清洗好的金电极浸入100μM半胱氨酸终端的多肽溶液中反应16h，用空白PBS缓冲溶液清洗后，将多肽修饰电极插入5mM巯基己醇溶液中，室温下反应1h以封闭金电极表面的非特异性吸附位点；再将电极插入含有PKA和ATP的检测缓冲溶液中，室温下反应1h，此时，PKA将ATP上的磷酸根转移到多肽链上氨基酸残基的-OH位点上，从而获得磷酸化多肽修饰电极；随后将磷酸化多肽修饰电极插入生物素化的抗磷酸化丝氨酸抗体中室温下孵化1h，再插入200μL浓度为0.1mg/mL的亲和素溶液中，室温下反应30min；最后将电极插入200μL的GOx/Au NPs/DNA溶液中，室温下孵化30min，即制得ECL生物传感器。
基于多功能纳米探针GOx/Au NPs/DNA构建的电致化学发光生物传感器在PKA活性检测中的应用：随着PKA浓度的增加，鲁米诺的ECL信号逐渐增大，PKA在0.02-40U/mL范围内与ECL强度呈线性，检测限为0.013U/mL，表明基于多功能纳米探针GOx/Au NPs/DNA构建的生物传感器，可用于对PKA的宽范围和高灵敏检测。
上述方法中，所述的空白PBS缓冲溶液的浓度为20mM，pH为7.6；所述的PBS缓冲溶液浓度为10mM，pH为7.4，其中包含0.1MNaCl；所述的检测缓冲溶液为20mM的Tris-HCl，pH为7.4，其中包含20mM的MgCl2。
本发明的技术效果是：本发明利用制备的多功能纳米探针对鲁米诺电致化学发光的放大增强作用，构建了一种ECL生物传感器，用于对蛋白激酶活性的灵敏性检测和抑制剂筛选。此ECL生物传感器具有高灵敏度、低检测限、宽线性范围和良好的稳定性，原因如下：（1）Au NPs与GOx对鲁米诺的电致化学发光具有良好的协同催化效应；（2）Au NPs具有高的比表面积，能够负载大量的GOx以增强ECL信号；（3）通过GOx催化葡萄糖的氧化而原位产生鲁米诺发光的共生物H2O2，一方面克服了H2O2不稳定的缺点，另一方面在电极表面产生的H2O2使得其在电极表面的浓度增大，增强了传感器的灵敏度和稳定性；（4）亲和素是四聚体结构，一个亲和素可与四个生物素结合，本发明中，一个亲和素分子还能再结合三个GOx/Au NPs/DNA-biotin多功能纳米探针，增加了电极表面GOx的负载量，从而放大增强了鲁米诺的ECL信号。本发明基于多功能纳米探针设计构建的ECL生物传感器，为蛋白质激酶活性研究和抑制剂检测提供了简单、灵敏、选择性和通用性的传感平台。
附图说明
图1是ECL生物传感器检测PKA活性和抑制剂的原理图。
图2是(a)Au NPs,(b)DNA,(c)Au NPs/DNA-biotin,(d)GOx和(e)GOx/Au NPs/DNA-biotin的紫外-可见光谱图。
图3是(A)多肽修饰电极、(B)生物素化抗磷酸化丝氨酸抗体/磷酸化多肽修饰电极和(C)GOx/Au NPs/DNA-biotin/亲和素/生物素化抗磷酸化丝氨酸抗体/磷酸化多肽修饰电极的AFM表征图。
图4是(a)金电极、(b)多肽修饰电极、(c)磷酸化多肽修饰电极、电极(c)依次组装了(d)生物素化抗磷酸化丝氨酸抗体、(e)亲和素、(f)GOx/Au NPs/DNA-biotin后的修饰电极在含有5mM的[Fe(CN)6]3-/4-和0.1M KCl的PBS溶液中的循环伏安图，扫描速率为100mV/s。
图5是(a)金电极、(b)多肽修饰电极、(c)磷酸化多肽修饰电极、电极(c)依次组装了(d)生物素化抗磷酸化丝氨酸抗体、(e)亲和素、(f)GOx/Au NPs/DNA-biotin后的修饰电极在含有5mM的[Fe(CN)6]3-/4-和0.1M KCl的PBS溶液中的电化学交流阻抗谱，频率范围为0.1-105Hz，扰动电压为5mV。
图6是(a)金电极，磷酸化多肽修饰电极在结合GOx/AuNPs/DNA-biotin多功能纳米探针前(b)和结合后(c)的ECL-电位曲线，磷酸化多肽修饰电极在(d)Au NPs和(e)biotin-GOx溶液中孵育后的ECL-电位曲线。PKA检测在含有20mM MgCl2、50μM ATP和50U/mL PKA的Tris-HCl缓冲溶液中进行，ECL测量底液为含有100μM鲁米诺和10mM葡萄糖的pH7.6的PBS溶液。扫描速率为100mV/s，光电倍增管的电压为800V。
图7是(A)biotin-DNA浓度、(B)GOx浓度和(C)磷酸化时间与ECL强度的线性关系图，其他条件与图6相同。
图8是不同浓度PKA的ECL强度-时间曲线和标准曲线。(A)基于多功能纳米探针GOx/Au NPs/DNA-biotin构建的ECL生物传感器，PKA浓度为(a)0.02,(b)0.05,(c)1,(d)5,(e)10,(f)20,(g)30,(h)35,(i)40,(j)50,(k)80和(l)100U/mL，内插图为PKA检测的标准曲线。(B)基于探针biotin-GOx构建的ECL生物传感器，PKA浓度为(a)0.5,(b)1,(c)5,(d)10,(e)20,(f)30,(g)50和(h)100U/mL，内插图为PKA检测的标准曲线。其他条件与图6相同。
图9是ECL生物传感器对50U/mL的PKA连续循环伏安扫描的ECL-时间曲线图，扫描速率为100mV/s，其他条件与图6相同。
图10是(A)不同浓度鞣花酸存在时，ECL生物传感器的ECL强度-时间图。(B)抑制剂(a)鞣花酸、(b)5,6-二氯-l-β-D-呋喃核糖基苯丙咪唑(DRB)和(c)槲皮素对生物传感器的ECL响应。PKA浓度为50U/mL和ATP浓度为50μM，其他条件与图6相同。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步阐述，本发明并不限于此。
实施例1
（1）Au NPs的制备：将50mL浓度为0.05g/L的氯金酸加入到100mL的圆底烧瓶中，加热至沸腾后，在机械搅拌下迅速加入5mL质量百分浓度为1%的柠檬酸钠溶液并持续沸腾10min，当溶液颜色由黄色变成深酒红色时，即获得平均粒径约为14nm的稳定且单分散的Au NPs，于4℃保存备用；
（2）GOx/Au NPs/DNA多功能纳米探针的制备：先将0.3mL生物素标记的DNA溶液加入到5mL步骤（1）制备的Au NPs溶液中，孵化24h，将DNA修饰的Au NPs分散于0.1M NaCl溶液中；将0.2mL浓度为2mg/mL的GOx加入到0.2mL上述溶液中，25℃搅拌1h，再加入1mL质量百分浓度为1%的BSA溶液以封闭Au NPs表面多余的活性位点；将得到的溶液于13000rpm离心10min，除去上层清液后得到多功能纳米探针GOx/Au NPs/DNA，将其重悬于PBS缓冲溶液中备用。
采用紫外-可见光谱对GOx/Au NPs/DNA-biotin多功能纳米探针的制备进行表征，结果如图2所示。曲线a中520nm处的吸收峰表明合成的Au NPs粒径约14nm。将biotin-DNA吸附到Au NPs表面后，Au NPs在520nm处的吸收峰红移到了525nm（曲线c），表明biotin-DNA与Au NPs发生了相互作用。进而将GOx修饰到AuNPs/biotin-DNA表面后，在268nm和527nm处出现了两个吸收峰（曲线e），分别对应于GOx（曲线d）和Au NPs的特征吸收。与AuNPs/biotin-DNA和GOx的紫外可见光谱相比，这两个吸收峰的位置稍有偏移，表明Au NPs与GOx之间发生了相互作用，形成了GOx/AuNPs/DNA-biotin多功能纳米探针，且其在0.1M NaCl的高盐浓度下非常稳定。
实施例2
ECL生物传感器的构建过程
（1）金电极的预处理：金电极在修饰之前，先分别在粒径为1.0、0.3和0.05μm的α-Al2O3糊中抛光，再用乙醇和水超声清洗1min，在0.5M的H2SO4中于-0.2～1.55V（vs Ag/AgCl）的电位范围内循环伏安扫描，直到得到重复性良好的循环伏安曲线为止。
（2）ECL生物传感器的组装过程如图1所示。将清洗好的金电极浸入100μM半胱氨酸终端的多肽溶液中反应16h，用空白PBS缓冲溶液清洗后，将多肽修饰电极插入5mM巯基己醇溶液中，室温下反应1h以封闭金电极表面的非特异性吸附位点；再将电极插入含有PKA和ATP的检测缓冲溶液中，室温下反应1h，此时，PKA将ATP上的磷酸根转移到多肽链上氨基酸残基的-OH位点上，从而获得磷酸化多肽修饰电极；随后将磷酸化多肽修饰电极插入生物素化的抗磷酸化丝氨酸抗体中室温下孵化1h，再插入200μL浓度为0.1mg/mL的亲和素溶液中，室温下反应30min；最后将电极插入200μL的GOx/AuNPs/DNA溶液中，室温下孵化30min，即制得ECL生物传感器。
采用原子力显微镜（AFM）对生物传感器的构建过程进行表征（图3）。在多肽修饰金基底表面呈现出均匀分布的高度约3nm的小凸起（图3A）；将多肽磷酸化后，利用抗原-抗体间的特异性识别作用将生物素化的抗磷酸化丝氨酸抗体修饰到金基底表面，AFM图中凸起的高度增大到约30nm（图3B）；在亲和素对生物素反应的介导作用下，GOx/Au NPs/DNA-biotin被组装到基底表面，AFM图中凸起的高度继续增大到约60nm（图3C），表明多功能纳米探针成功组装到了金基底表面。
采用循环伏安法和电化学交流阻抗法对生物传感器的制备过程进行表征。由图4可见，裸金电极上呈现一对可逆的[Fe(CN)6]3-/4-的氧化还原峰（曲线a）；利用Au-S键将多肽修饰于电极表面后，[Fe(CN)6]3-/4-的氧化还原峰电流下降，阴极峰和阳极峰的电位差增大（曲线b），这是由于多肽的电子惰性阻碍了电活性探针向电极表面的电子传递；在PKA和ATP的作用下，修饰于电极表面的多肽发生磷酸化后，[Fe(CN)6]3-/4-的峰电流进一步减小，峰电位差变得更宽（曲线c），这是由于电极表面的多肽磷酸化后，磷酸根的存在增大了电极表面的负电荷，静电排斥作用阻碍了电活性探针向电极表面的电子传递；当通过抗原-抗体间的特异性识别作用将生物素化抗磷酸化丝氨酸抗体组装于磷酸化肽修饰电极表面，并进而利用生物素-亲和素作用将GOx/Au NPs/DNA-biotin多功能纳米探针捕获到电极表面之后，[Fe(CN)6]3-/4-的峰电流逐渐减小，峰电位差逐渐增大（曲线d,e,f），这是由于在电极表面形成的免疫复合物大大阻碍了电活性物质向其表面的电子和质子传递。图5为不同修饰电极的EIS表征，裸电极的EIS曲线几乎为一条直线（曲线a），这是扩散控制电子传递过程的特征。在多肽修饰到电极表面之后，EIS曲线呈现了一个半圆，电子传递阻力（Ret）为1490Ω（曲线b）；在PKA催化多肽磷酸化反应后，Ret增大到1955Ω（曲线c）；在磷酸化多肽修饰电极表面依次组装生物素化抗磷酸化丝氨酸抗体、亲和素、GOx/Au NPs/DNA-biotin后，Ret逐渐增大（曲线d,e,f），以上趋势与循环伏安法所得结果一致。以上研究表明，本方法成功构建了ECL生物传感器。
实施例3
ECL生物传感器用于蛋白质激酶A的活性检测
（1）图6为裸电极和磷酸化肽修饰电极在结合GOx/AuNPs/DNA-biotin多功能纳米探针之前和之后，在测试底液（含有100μM鲁米诺和10mM葡萄糖的0.1M pH7.6的PBS）中的ECL强度-电位图。裸金电极（曲线a）和磷酸化多肽修饰电极（曲线b）在0.55V处均出现了较弱的鲁米诺的ECL峰；当将GOx/Au NPs/DNA-biotin多功能纳米探针组装到磷酸化多肽修饰电极表面之后，ECL的强度明显增强（曲线c），是未组装多功能纳米探针之前（曲线b）的10倍。
（2）为了考察GOx/Au NPs/DNA-biotin纳米探针对鲁米诺ECL发光信号的放大能力，分别用biotin-GOx和BSA-Au NPs代替GOx/AuNPs/DNA-biotin多功能纳米探针，在相同的实验条件下测量ECL响应。由图6可见，以GOx/Au NPs/DNA-biotin为纳米探针构建的生物传感器的ECL发光强度分别是用BSA-Au NPs（曲线d）和biotin-GOx（曲线e）构建的传感器的10倍和5倍。以上研究表明，以GOx/AuNPs/DNA-biotin为多功能纳米探针构建ECL生物传感器，可大大提高PKA检测的灵敏度。
（3）biotin-DNA浓度、GOx浓度以及磷酸化反应时间对ECL强度的影响
在含有100μM鲁米诺和10mM葡萄糖的0.1M pH7.6的PBS溶液中，考察了biotin-DNA和GOx的浓度对ECL信号的影响。由图7A可见，在0.1-1.0μM浓度范围内，ECL强度随着biotin-DNA浓度的增加而增大，当biotin-DNA浓度为1.0μM时ECL强度达到最大，继续增大其浓度则导致ECL强度下降，这是因为在Au NPs表面组装的biotin-DNA过多时，会降低其对GOx的负载量，从而减小ECL信号。因此，选择biotin-DNA的浓度为1.0μM。在biotin-DNA浓度为1.0μM的条件下，随着GOx浓度的增加（0.1-1.0mg/mL），传感器的ECL强度明显增大，进一步增加GOx浓度，ECL响应没有明显变化（图7B），因此，选择GOx的浓度为1.0mg/mL。通过在不同时间停止催化反应和分析ECL信号研究PKA反应时间的影响，由图7C可见，随着磷酸化反应时间的延长，ECL强度先迅速增大，逐渐缓慢增加，当反应时间超过1h后，ECL强度基本保持不变，因此，选择的磷酸化时间为1h。
（4）在最优实验条件下，以GOx/Au NPs/DNA-biotin为多功能纳米探针构建ECL生物传感器并用于检测蛋白质激酶A的活性。由图8A可见，ECL信号随着PKA浓度的增加而增大，当PKA浓度为80U/mL时，ECL强度达到最大。图8A的内插图为PKA检测的标准曲线，PKA浓度为0.02-40U/mL时，PKA浓度与ECL信号呈良好的线性关系，线性方程为I=902.5+220.0c（I为ECL强度，c为PKA浓度），线性相关系数为0.992，信噪比为3时的检测限为0.013U/mL。为了进一步证明GOx/Au NPs/DNA-biotin多功能纳米探针对PKA检测灵敏度的增强能力，以biotin-GOx代替GOx/Au NPs/DNA-biotin构建传感器，在相同的实验条件下测量ECL响应信号。由图8B可见，ECL强度随PKA浓度的增加而增大，在0.5-30U/mL浓度范围内呈线性关系，线性方程为I=490.7+49.3c，线性相关系数为0.991，检测限为0.1U/mL，比基于GOx/Au NPs/DNA-biotin多功能纳米探针构建的生物传感器的检测限高了7.5倍。以上研究表明，基于GOx/Au NPs/DNA-biotin多功能纳米探针构建的生物传感器，对PKA的检测范围宽、灵敏度高、检出限低。
（5）ECL生物传感器的稳定性、重现性和再现性研究
图9为在含100μM鲁米诺和10mM葡萄糖的0.1M pH7.6的PBS溶液中，生物传感器在电位范围为0-0.6V(vs Ag/AgCl)、扫描速率为100mV/s时连续扫描25圈的ECL图。由图可见，连续扫描25圈后的ECL信号仍然非常强且稳定，相对标准偏差为0.67%，表明生物传感器具有良好的电位循环稳定性。对ECL传感器的重现性和再现性进行了考察，PKA浓度为50U/mL时，测量10次ECL响应以评估生物传感器的批内分析精确度，批间分析精确度的测量用制备的10根电极对同一50U/mL的PKA进行测量，批内分析和批间分析的偏差系数分别为5.3%和6.2%。以上结果表明本发明设计的ECL生物传感器具有良好的稳定性、重现性和再现性，可用于对激酶活性的高效检测。
实施例4
ECL生物传感器用于PKA抑制剂的筛选
鞣花酸是一种强有效的和细胞可穿透性的抗氧化剂，具有抗突变和抗致癌等功能，本研究以鞣花酸为例对PKA的抑制剂筛选进行研究（图10）。ECL信号随着鞣花酸的浓度增加而减小，当鞣花酸浓度超过10μM时，ECL信号基本不变（图10A）。由图10B测量得到鞣花酸对PKA的半抑制浓度为4.07μM（曲线a）。为了进一步研究生物传感器对抑制剂特异性的影响，还考察了另外两种非PKA特异性抑制剂如5,6-二氯-l-β-D-呋喃核糖基苯丙咪唑（DRB）和槲皮素对PKA活性的影响。由图10B曲线b和曲线c可见，在这两种抑制剂的浓度高达30μM时，ECL信号几乎没有变化，表明本发明构建的生物传感器对PKA激酶抑制剂具有良好的特异性。
Claims (4)
1.多功能纳米探针GOx/Au NPs/DNA的制备方法，其特征在于所述制备方法包括以下步骤：
（1）Au NPs的制备：将50 mL浓度为0.05 g/L的氯金酸加入到100 mL的圆底烧瓶中，加热至沸腾后，在机械搅拌下迅速加入5 mL质量百分浓度为1%的柠檬酸钠溶液并持续沸腾10 min，当溶液颜色由黄色变成深酒红色时，即获得平均粒径为14 nm的稳定且单分散的Au NPs，于4 °C保存备用；
（2）GOx/Au NPs/DNA多功能纳米探针的制备：先将0.3 mL生物素标记的DNA溶液加入到5 mL步骤（1）制备的Au NPs溶液中，孵化24 h，将DNA修饰的Au NPs分散于0.1 M NaCl溶液中；将0.2 mL浓度为2 mg/mL的GOx加入到0.2 mL上述溶液中，25 °C搅拌1 h，再加入1 mL质量百分浓度为1%的牛血清白蛋白溶液以封闭Au NPs表面多余的活性位点；将得到的溶液于13000 rpm离心10 min，除去上层清液后得到多功能纳米探针GOx/Au NPs/DNA，将其重悬于磷酸盐缓冲溶液中备用；
（3）ECL传感器的组装：金电极在修饰之前，先分别在粒径为1.0、0.3和0.05 μm的α-Al2O3糊中抛光，再用乙醇和水超声清洗1 min，在0.5 M的H2SO4中于-0.2~1.55 V电位范围内循环伏安扫描，直到得到重复性良好的循环伏安曲线为止；将清洗好的金电极浸入100 μM半胱氨酸终端的多肽溶液中反应16 h，用空白磷酸盐缓冲溶液清洗后，将多肽修饰电极插入5 mM巯基己醇溶液中，室温下反应1 h以封闭金电极表面的非特异性吸附位点；再将电极插入含有蛋白质激酶A和三磷酸腺苷的检测缓冲溶液中，室温下反应1 h，此时，蛋白质激酶A将三磷酸腺苷上的磷酸根转移到多肽链上氨基酸残基的-OH位点上，从而获得磷酸化多肽修饰电极；随后将磷酸化多肽修饰电极插入生物素化的抗磷酸化丝氨酸抗体中室温下孵化1 h，再插入200 μL浓度为0.1 mg/mL的亲和素溶液中，室温下反应30 min；最后将电极插入200 μL的GOx/Au NPs/DNA溶液中，室温下孵化30 min，即制得ECL生物传感器。
2.如权利要求1所述的多功能纳米探针GOx/Au NPs/DNA的制备方法，其特征在于步骤（2）中，所述的磷酸盐缓冲溶液浓度为10 mM，pH为7.4，其中包含0.1 M NaCl。
3.如权利要求1所述的多功能纳米探针GOx/Au NPs/DNA的制备方法，其特征在于步骤（3）中，所述的检测缓冲溶液为20 mM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，pH为7.4，其中包含20 mM的MgCl2。
4.如权利要求1、2或3所述制备方法所制备的多功能纳米探针GOx/Au NPs/DNA在蛋白质激酶A活性检测中的应用，其特征在于，随着蛋白质激酶A浓度的增加，鲁米诺的电致化学发光信号逐渐增大，蛋白质激酶A在0.02-40 U/mL范围内与电致化学发光信号呈线性，检测限为0.013 U/mL，表明基于多功能纳米探针GOx/Au NPs/DNA构建的生物传感器，可用于对蛋白质激酶A的宽范围和高灵敏检测。
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