CN105938095B

CN105938095B - 基于激子-等离子激元能量相互作用检测蛋白激酶的传感器及其制备方法、应用

Info

Publication number: CN105938095B
Application number: CN201610300655.XA
Authority: CN
Inventors: 赵凯; 闫志勇; 王宗花
Original assignee: Qingdao University
Current assignee: Shandong Zhonghe Tiancheng Inspection Co ltd
Priority date: 2016-05-09
Filing date: 2016-05-09
Publication date: 2018-11-13
Anticipated expiration: 2036-05-09
Also published as: CN105938095A

Abstract

本发明提供基于激子‑等离子激元能量相互作用检测蛋白激酶的传感器及其制备方法、应用。包括：导电基体；组装在导电基体上的量子点层；偶联在量子点层上的多肽；修饰在所述导电基体上的一端含有磷酸基的DNA/AuNPs探针；所述多肽在活性待测生物酶与三磷酸腺苷ATP存在条件下，可发生磷酸化反应。在蛋白激酶的定量筛选及在复杂的细胞裂解液中蛋白激酶活性的分析方面，该光电化学生物传感器表现优异。因此，由于同时具备灵敏性、简单易操作以及在细胞实验中的实用性，该工作不仅提供了一种利用EPI能量转移检测蛋白激酶活性的方法，同时在临床医疗及药物研发方面也表现出了极大的潜力。步骤简单、操作方便、实用性强。

Description

基于激子-等离子激元能量相互作用检测蛋白激酶的传感器及其制备方法、应用

技术领域

本发明属于光电生物传感器领域，特别涉及基于激子-等离子激元能量相互作用检测蛋白激酶的传感器及其制备方法、应用。

背景技术

蛋白激酶在真核细胞信号转导中起重要作用，影响了生长、发育、迁移以及凋亡等各个细胞过程。其表达水平或活性异常时，就有可能导致癌症、心血管疾病以及其他各种疾病，因此蛋白激酶是治疗这些疾病很好的分子靶点。迄今为止，美国食品药品监督管理局已经批准了多种蛋白激酶的抑制剂作为上市药物，用于相应的临床治疗。目前存在着各种检测激酶活性的方法，激酶生化检测方法尤为众多，比较传统的有放射性同位素的方法。但是放射性同位素法其操作步骤比较复杂并且具有危害性的放射性产物，因此这种方法已逐渐被其他的方法所替代。目前，多种检测方法被用来对蛋白激酶进行活性分析及进行蛋白激酶抑制剂的筛选实验，诸如酶联免疫法、反相高效液相色谱法、核磁共振分析法等等。而各种均相非放射性同位素的检测方法，由于其污染小、操作便捷，逐渐成为激酶抑制剂筛选的首选。

然而，现有的生物传感器中的工作电极主要为玻碳电极或金电极，其中，玻碳电极不能直接进行物理方法或者化学方法固载酶，只能通过在玻碳电极表面进行其他处理，例如化学交联或者溶胶凝胶使得玻碳电极表面固载少量酶。由于玻碳电极的固载酶量低，使得其灵敏度未能达到理想水平。而金电极通常只对含有或者修饰有特定基团比如巯基的酶进行固载，有一定的局限性。此外，玻碳电极及金电极在使用之前都要打磨抛光及活化处理，过程比较繁琐。因此，提供一种酶固载量高、分析灵敏度高且简单快速的工作电极具有重要的现实意义。

中国专利(CN105021575A)公开了一种基于局域表面等离子体共振检测激酶活性的光电传感器。通过含有贵金属纳米粒子及光敏剂三联吡啶钌的DNA探针发生局域表面等离子体共振效应，使得其更多的电子跃迁到半导体金属氧化物导带上从而产生光电流，实现了激酶活性的检测。但该设计中采用的光敏剂吡啶钌成本较为高昂，另一方面，组装过程中，染料常常非特异性的吸附到电极上，产生较大误差，且制备工艺要求高。

发明内容

为了克服上述不足，本发明提供一种基于纳米金(Au NPs)贵金属粒子与硫化镉量子点 (CdS QDs)相互作用的光电化学生物传感器来检测蛋白激酶活性及蛋白激酶抑制剂的筛选。在蛋白激酶的定量筛选及在复杂的细胞裂解液中蛋白激酶活性的分析方面，该光电化学生物传感器表现优异。由于同时具备灵敏性、简单易操作以及在细胞实验中的实用性，该工作不仅提供了一种利用EPI能量转移检测蛋白激酶活性的方法，同时在临床医疗及药物研发方面也表现出了极大的潜力。

研究中，为了克服现有吡啶钌作为光敏剂成本过高的问题，本发明对现有的光敏剂进行了大量筛选，结果不甚理想。为此，发明人对现有的光电转化材料进行了系统分析和实验摸索，发现：QDs(量子点)比如CdS QDs等由于电子和空穴被量子限域，连续的能带结构变成了分立能级结构，当受到光激发后会导致电子从CdS QDs的价带传到导带，从而导致电子-空穴的产生，导带当中的电子被注入电极，与此同时，溶液中的电子供体源源不断补充到价带中去，从而形成稳定的光电流响应。当CdS QDs与纳米金Au NPs在一定条件下相互接近时，其粒子与粒子之间会发生能量转移，从而能够影响光电流的大小。因此，将QDs与纳米金结合，可以构建一种“signal off”PEC生物传感器来检测蛋白激酶的活性。进一步实验结果表明：在本体系中，CdS QDs不仅充当光电活性物质构建PEC生物传感界面，而且通过CdSQDs与Au NPs之间发生EPI实现信号传导，使检测器的光稳定性和准确性大幅提高。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种基于激子-等离子激元能量相互作用的电极，包括：

导电基体；

组装在导电基体上的QDs层；

偶联在QDs层上的多肽；

修饰在所述导电基体上的一端含有磷酸基的DNA/Au NPs探针；

所述多肽在活性待测生物酶与三磷酸腺苷ATP存在条件下，可发生磷酸化反应。

本发明中QDs作为一种基于EPI(激子-等离子体能量相互作用)的光电化学信号传导元件，在生物传感器中对生物识别反应进行分析。而当入射光子频率与Au NPs的整体振动频率相匹配时，Au NPs会对光子能量产生很强的吸收作用，就会产生LSPR(局域表面等离子体效应)。在本体系中，首先，将CdS QDs组装到TiO₂/ITO电极上，然后修饰上肯普肽。当PKA(蛋白激酶)催化肯普肽发生磷酸化作用之后，我们利用DNA双链将Au NPs通过Zr⁴⁺离子对磷酸根的螯合作用连接到磷酸化的肯普肽/TiO₂/ITO电极上。在光照射下，CdS QDs辐射发光进而继续激发Au NPs产生表面等离子体激元。激发状态下，粒子间会发生能量转移，能量转移会影响CdS QDs的激子状态从而导致CdS QDs的光电流强度发生一定程度的降低，通过光电流的变化来反映出蛋白激酶的活性。

优选的，所述量子点层采用CdS QDs制成；研究中对多种量子点材料进行筛选后发现：采用CdS QDs与Au NPs配合时，其能量相互作用显著增强。

优选的，所述纳米贵金属为Au NPs；

优选的，所述多肽为肯普肽；

优选的，所述生物酶为蛋白激酶。

优选的，所述导电基体为半导体金属氧化物/ITO电极，其中，半导体金属氧化物为氧化钛TiO₂或氧化锌ZnO。

本发明还提供了一种基于激子-等离子激元能量相互作用的光电化学传感器，其包括任一上述的工作电极。

本发明还提供了一种基于激子-等离子激元能量相互作用检索蛋白激酶活性的光电化学传感器，所述光电化学传感器包括工作电极，所述工作电极包括：

导电基体；

组装在导电基体上的量子点层；

偶联在量子点层上的多肽；

修饰在所述导电基体上的一端含有磷酸基的DNA/Au NPs探针；

优选的，所述量子点层采用CdS QDs制成；

优选的，所述纳米贵金属为Au NPs；

优选的，所述多肽为肯普肽；

优选的，所述生物酶为蛋白激酶。

本发明还提供了一种基于激子-等离子激元能量相互作用的电极的制备方法，包括：

在导电电极上组装量子点，形成量子点层；

在量子点层上偶联多肽；

在所述导电基体上修饰一端含有磷酸基的DNA/Au NPs探针；

优选的，所述量子点层采用CdS QDs制成；

优选的，所述纳米贵金属为Au NPs；

优选的，所述多肽为肯普肽；

优选的，所述生物酶为蛋白激酶。

本发明还提供了一种较优的基于激子-等离子激元能量相互作用的生物传感器的制备方法，包括：

TGA修饰的CdS QDs参照文献方法合成并稍作修改。在100mL三颈瓶中加入50mL0.01M CdCl₂溶液和250μL TGA，搅拌同时向溶液中通入氮气30min。在此期间，使用1M的NaOH溶液调节混合液的pH到一定数值。然后加入5.0mL 0.1M Na₂S溶液，氮气环境下下110℃加热回流4h。

Au NPs的合成：100mL 0.01％(w/v)的氯金酸水溶液置于磁力搅拌器上搅拌加热至沸腾，之后1％(w/v)柠檬酸钠水溶液快速加入沸腾的氯金酸溶液中，当溶液变为酒红色时，停止加热得到Au NPs，将其置于4℃保存备用。

DNA/Au NPs探针的合成：DNA1(5′-SH-C6-ATCGTTTAGGATTTGGATGA-P-3′)和DNA2(3′-GCAAATCCTAAAC)配置成10^-6M的溶液，之后混合摇床37℃杂交孵育一个小时，待反应完全结束后将杂交后的DNA双链加入1mL的Au NPs溶液中，室温搅拌24h之后，将150μL1M的氯化钠溶液逐滴缓慢加入，放置24h，最后，混合溶液在12000rpm每分钟的情况下离心15min两次，撇去上清液，将沉淀重新分散于包含有300mM的氯化钠，50mM的Tris-HCI溶液中。之后将修饰有DNA的Au NPs在紫外下进行表征。

ITO玻璃依次在丙酮、氢氧化钠(1M)的乙醇水(1:1v/v)溶液、水中超声清洗15min，然后将其放在90℃烘箱中12h，烘干备用。预处理之后的ITO玻璃取出之后，滴加0.5mg/mL的氧化钛于固定面积(0.5cm²)的ITO玻璃片之上，之后将其放入200℃环境中15h。之后将电极依次浸入2％PDDA(用0.5M NaCl溶液配制)10min，取出后用水洗涤，再放入CdS QDs溶液中10min，取出后用水洗涤，重复之后得到所需的多层膜修饰电极。

肯普肽通过CdS QDs表面的羧基与肯普肽表面的氨基通过EDC偶联到一起。首先，室温下，将CdS/TiO₂/ITO电极浸入EDC与NHS溶液中60min，清洗过后将50μL浓度为500μM的肯普肽溶液滴加到电极上室温黑暗处反应12h使得肯普肽连接到电极上，二次水清洗之后氮气吹干，得到肯普肽修饰的电极；1mM的6-氨基己酸封闭空白位点30min以减轻非特异性吸附，之后用二次水淋洗并用N₂干燥；含有一系列浓度的PKA和ATP的缓冲溶液(50mM Tris-HCl和20mM MgCl₂,pH 7.4)滴加到电极上，在37℃下反应80min之后滴加50μL的Zr⁴⁺溶液；1h后将探针DNA/Au NPs滴加到电极上反应，用大量缓冲溶液进行清洗，氮气吹干，得到制备好的光电生物传感器准备检测。

本发明还提供了通过任一项的上述方法获得的电极。

研究还发现：CdS/TiO₂/ITO电极在可见光的照射下具有强烈而稳定的光电流，当CdS/TiO₂/ITO电极修饰上肯普肽之后，然后被PKA磷酸化，光电流明显的降低，这主要是肯普肽的位阻效应造成的，修饰的物质阻碍了溶液中的电子供体AA(抗坏血酸)向电极表面的扩散。

基于上述发现，本发明还提供了一种基于量子点光电效应的电极，包括：

导电基体；

组装在导电基体上的量子点层；

偶联在量子点层上的多肽；

优选的，所述量子点层采用CdS QDs制成；

优选的，所述多肽为肯普肽；

优选的，所述生物酶为蛋白激酶。

本发明还提供了一种基于量子点激子光电效应的光电化学传感器，包括任一上述的工作电极。

本发明还提供了一种基于量子点光电效应的电极的制备方法，包括：

在导电电极上组装量子点，形成量子点层；

在量子点层上偶联多肽；

优选的，所述量子点层采用CdS QDs制成；

优选的，所述多肽为肯普肽；

优选的，所述生物酶为蛋白激酶。

本发明的有益效果

(1)在本发明中，我们将利用QDs与Au NPs粒子之间的相互作用构建了一种“signal off”PEC生物传感器来检测蛋白激酶的活性。首先，CdS QDs组装到TiO₂/ITO电极上，然后修饰上肯普肽。当PKA催化肯普肽发生磷酸化作用之后，我们利用DNA双链将Au NPs通过Zr⁴⁺离子对磷酸根的螯合作用连接到磷酸化的肯普肽/TiO₂/ITO电极上。在光照射下，CdS QDs辐射发光进而继续激发Au NPs产生表面等离子体激元。激发状态下，粒子间会发生能量转移，能量转移会影响CdS QDs的激子状态从而导致CdS QDs的光电流强度发生一定程度的降低，通过光电流的变化来反映出蛋白激酶的活性。在本体系中，CdS QDs不仅充当光电活性物质构建PEC生物传感界面，而且通过CdS QDs与Au NPs之间发生EPI实现信号传导。本工作对蛋白激酶活性检测提供了新的方法。

(2)构建了一种基于贵金属纳米粒子Au NPs与CdS QDs相互作用的光电化学生物传感器来检测蛋白激酶活性及蛋白激酶抑制剂的筛选。CdS QDs的PL谱与Au NPs的紫外吸收峰存在重叠，因此CdS QDs的PL可以激发Au NPs的LSPR，激发状态下，Au NPs与CdS QDs之间的相互作用影响着CdS QDs的激子状态从而导致系统光电流的猝灭，达到对蛋白激酶活性分析的效果。同时，在蛋白激酶的定量筛选及在复杂的细胞裂解液中蛋白激酶活性的分析方面，该光电化学生物传感器表现优异。因此，由于同时具备灵敏性、简单易操作以及在细胞实验中的实用性，该工作不仅提供了一种利用EPI能量转移检测蛋白激酶活性的方法，同时在临床医疗及药物研发方面也表现出了极大的潜力。

(3)本发明制备方法简单、检测效率高、实用性强，易于推广。

附图说明

图1(a)是基于激子-等离子激元能量相互作用的光电化学传感器组装示意图和(b)实验机理示意图:主要过程包括光子吸收及电子从导带跃迁到价带产生电子-空穴对；空穴将电子供体d氧化成d⁺；电子从CdS QDs转移到TiO₂/ITO电极上形成光电流，用于分析蛋白激酶的活性；电子-空穴对复合包含两部分，非辐射衰变(nD)与辐射衰变(rD)，同时伴随CdS QDs与Au NPs之间EPI。

图2是紫外光谱图。其中，(A)CdS QDs(a)和Au NPs(b)的紫外吸收峰，插图分别为所合成的CdS QDs和Au NPs溶液；(B)Au NPs(a)和DNA/Au NPs(b)的紫外谱图。

图3是CdS/TiO₂/ITO修饰电极的稳定性测试图，测试在含有0.1M AA的0.1PBS溶液中进行。光密度190mWcm^-2，电极反应面积0.5cm²。

图4是光电化学传感器的光电流响应图。其中，(a)ITO电极，(b)CdS/TiO₂/ITO电极，(c)肯普肽酸化的肯普肽/CdS/TiO₂/ITO电极的光电流响应图。光密度190mWcm^-2，电极反应面积0.5cm²。

图5是将DNA/Au NPs分别修饰到肯普肽(a)和磷酸化肯普肽(b)修饰电极上的光电流响应图。光密度190mWcm^-2，电极反应面积0.5cm²。

图6是ATP浓度对光电流的影响图。光密度190mWcm^-2，电极反应面积0.5cm²。

图7是磷酸化时间对光电流的影响图。光密度190mWcm^-2，电极反应面积0.5cm²。

图8是不同浓度PKA对应的光电流图。内插图为光电流强度与PKA浓度的线性关系曲线图。其中，光密度190mWcm^-2，电极反应面积0.5cm²。PKA的浓度为:0.0065UmL^-1,0.0075UmL^-1,0.01UmL^-1,0.015UmL^-1,0.025UmL^-1,0.05UmL^-1,0.06UmL^-1,0.065UmL^-1。

图9是用激活剂Forskolin和抑制剂ellagicacid分别处理细胞MCF-7得到的细胞裂解液中的PKA所对应的光电流响应图。光密度190mWcm^-2，电极反应面积0.5cm²。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明特征及其它相关特征作进一步详细说明，以便于同行业技术人员的理解：

实施例1

1实验部分

1.1实验试剂与材料

蛋白激酶PKA，抑制剂鞣花酸4,4′,5,5′,6,6′-137hexahydroxydiphenic acid 2,6,2′,6′-dilactone(Ellagic acid)，络氨酸抑制剂N-138(3-chlorophenyl)-6,7-dimethoxy-4-quinazolinamine(Tyrphos-139tinAG1478)，激活剂毛喉素Forskolin和IBMX购于Sigma公司；肯普肽(Cysteine-terminated kemptide(CLRRASLG))购于GL biochem(上海，中国)；ATP由鼎国生物试剂公司提供；氯金酸HAuCl₄·3H₂O(48％w/w)购自于上海试剂公司；CdCl₂ 2.5H₂O购于Aladdin试剂公司(上海，中国)，其他试剂均购自于北京化学品公司。

1.2实验仪器

光电系统用到的光源为氙灯，采用460nm以上波长的可见光滤光片，辐照强度为190mW/cm²；光电实验在CHI802B电化学工作站上进行(上海辰华)，使用三电极体系(参比电极：Ag/AgCl电极，对电极：铂丝电极，工作电极：ITO电极)，试验过程在恒定电压(0V vs饱和Ag/AgCl)下进行，以含有0.1M抗坏血酸为电子供体的PBS磷酸盐溶液为反应溶液；UV-vis紫外吸收光谱由UV-3900紫外分光光度计上进行(Hitachi,Japan)。

1.3CdS QDs、Au NPs和探针DNA/Au NPs的合成

DNA/Au NPs探针的合成：DNA₁(5′-SH-C6-ATCGTTTAGGATTTGGATGA-P-3′)和DNA₂(3′-GCAAATCCTAAAC)配置成10^-6M的溶液，之后混合摇床37℃杂交孵育一个小时，待反应完全结束后将杂交后的DNA双链加入1mL的Au NPs溶液中，室温搅拌24h之后，将150μL 1M的氯化钠溶液逐滴缓慢加入，放置24h，最后，混合溶液在12000rpm每分钟的情况下离心15min两次，撇去上清液，将沉淀重新分散于包含有300mM的氯化钠，50mM的Tris-HCI溶液中。之后将修饰有DNA的Au NPs在紫外下进行表征。

1.4电极的组装及肯普肽在电极上的磷酸化反应

肯普肽通过CdS QDs表面的羧基与肯普肽表面的氨基通过EDC偶联到一起。首先，室温下，将CdS/TiO₂/ITO电极浸入EDC与NHS溶液中60min，清洗过后将50μL浓度为500μM的肯普肽溶液滴加到电极上室温黑暗处反应12h使得肯普肽连接到电极上，二次水清洗之后氮气吹干，得到肯普肽修饰的电极；1mM的6-氨基己酸封闭空白位点30min以减轻非特异性吸附，之后用二次水淋洗并用N₂干燥；含有一系列浓度的PKA和ATP的缓冲溶液(50mMTris-HCl and 20mM MgCl₂,pH 7.4)滴加到电极上，在37℃下反应80min之后滴加50μL的Zr⁴⁺溶液；1h后将探针DNA/Au NPs滴加到电极上反应，用大量缓冲溶液进行清洗，氮气吹干，得到制备好的光电生物传感器准备检测。

1.5细胞的培养与细胞裂解液的提取

MCF-7细胞分成三组，在DMEM细胞培养液中培养。在5％CO₂、37℃下培养，在添加激活剂和抑制剂之前，改用无血清培养基(1mL)培养四小时，随后，细胞被分别加入蛋白激酶激活剂(毛喉素Forskolin，IBMX)和蛋白激酶抑制剂(ellagic acid)使其最终浓度分别为25μM，最后一组为对照组。经过一段时间的孵育之后，细胞分别加入2mL的细胞裂解液，五分钟之后，对三组细胞裂解液进行离心，最后将获得的上清液存在-80℃处备用。

细胞裂解液中的PKA活性检测通过将获得的细胞裂溶解于不同的PKA缓冲溶液(50mM Tris-HCl，20mM MgCl₂，100μM ATP，pH 7.4)中，对细胞中的PKA活度的光学检测与单独PKA蛋白激酶的活性方法相同。

2.实验结果与讨论

2.1PEC传感器的组装及实验原理

PEC传感器的组装及检测PKA活性机理如图1所示，肯普肽在蛋白激酶及ATP与金属镁离子的存在下，由于蛋白激酶的催化，其丝氨酸上的羟基会被ATP中的磷酸基取代从而发生肯普肽磷酸化。由于金属离子Zr⁴⁺对磷酸基团的络合作用，因此，一端修饰有磷酸根的DNA/Au NPs探针与磷酸化的肯普肽被Zr⁴⁺连接到一起。在可见光的照射下，由于CdS QDs和Au NPs之间的吸收峰有明显的重合，有利于激发这两种粒子分别产生激子和等离子体激元，从而迅速产生EPI。抗坏血酸在此方法中作为电子供体，使体系不断产生连续、稳定的光电流。随着激酶活度的不同，光电流的变化也会随之变化，由此达到灵敏高效检测蛋白激酶的目的。图1(a)基于激子-等离子激元能量相互作用的光电化学传感器组装示意图。(b)实验机理示意图:主要过程包括光子吸收及电子从导带跃迁到价带产生电子-空穴对；空穴将电子供体d氧化成d⁺；电子从CdS QDs转移到TiO₂/ITO电极上形成光电流，用于分析蛋白激酶的活性；电子-空穴对复合包含两部分，非辐射衰变(nD)与辐射衰变(rD)，同时伴随CdS QDs与Au NPs之间EPI。

2.2CdS QDs、Au NPs和DNA/Au NPs的表征

由图2A可以看到，CdS QDs具有较宽的吸收谱，适合作为PEC活性基底材料。此外，CdS QDs还具有一个对称的峰值在约510nm的发射峰(曲线a)。曲线b是所制备的Au NPs的吸收谱，在约522nm处呈现出典型的表面等离子体共振(LSPR)吸收峰。很明显，CdS QDs的荧光发射谱与Au NPs的SPR吸收谱之间有着较大的谱图重叠，这将有利于在Au NPs的表面引发SPR进而在两者粒子之间产生EPI相互作用。图2B为DNA/Au NPs探针的紫外表征：紫外可见分光光度计证明Au NPs吸收峰在522nm处(a)，而DNA修饰到Au NPs之后可以看到，Au NPs的紫外吸收峰由522nm红移到529nm(b)，这是由于杂交链的DNA修饰到Au NPs所引起的，由此证明DNA/Au NPs的成功组合。

2.3CdS/TiO₂/ITO电极的光电性能

对于PEC生物传感器来说，具有稳定响应的基底是非常重要的。因此，我们对所制备的CdS/TiO₂/ITO修饰电极的光响应稳定性进行了考查。如图3所示，当光照射电极时，产生的光电流迅速上升达到稳定值，这说明CdS QDs中快速的电荷分离以及CdS QDs与TiO₂/ITO电极之间高效的电子转移。控制每次光照的时间为50s，对电极连续激发10次以上，由图看见，光电流信号稳定并且几乎没有任何衰减的现象。这表明制备的CdS/TiO₂/ITO修饰电极在AA溶液中有良好的稳定性，比较适合构建PEC生物传感器。

2.4光电化学传感器的光电流响应

本节讨论了本体系构建的光电化学传感器的光电流行为。图4为在可见光照射下，在含有0.1M抗坏血酸的0.1M PBS缓冲溶液中测量得到的修饰电极的光电流图。由图4中可见，CdS/TiO₂/ITO电极在可见光的照射下具有强烈而稳定的光电流，当CdS/TiO₂/ITO电极修饰上肯普肽之后，然后被PKA磷酸化，光电流明显的降低，这主要是肯普肽的位阻效应造成的，修饰的物质阻碍了溶液中的电子供体AA(抗坏血酸)向电极表面的扩散。将探针DNA/AuNPs通过Zr⁴⁺连接到磷酸化kemptide/CdS/TiO₂/ITO电极上的时候，可以观察到光电流继续下降。已有报道表明，在光激发条件下，当CdS QDs与Au NPs紧密靠近，激发电子便会从CdSQDs向Au NPs转移并被捕获，继而与停留在CdS QDs-Au NPs界面的光生空穴非辐射复合、或者由Au NPs电子载体转移到电极表面。由于Au NPs的存在使得CdS QDs内部的电子-空穴在在空间分开，使得电子-空穴复合延缓，从而提高光电流的效率。然而在本体系中，肯普肽及双链DNA的存在使得CdS QDs与Au NPs保持一定的距离。如果电子依旧能够从CdS QDs转移到Au NPs上同时无能量转移的话，光电流应该是上升的，然而事实上光电流出现明显的下降。这是由于CdS QDs与Au NPs之间机理的增大，势垒的增加极大的降低了CdS QDs与AuNPs之间的电子转移的可能性。而Au NPs的表面引发SPR进而使CdS QDs与Au NPs两者粒子之间产生EPI，发生能量转移从而使得光电流的降低。

蛋白激酶PKA能够磷酸化肯普肽，从而通过金属络合将探针修饰到电极上。图5为肯普肽连接上DNA/Au NPs探针的光电流(曲线a)探针和磷酸化的肯普肽连接上DNA/Au NPs(曲线b)对比图。由图5可见，当肯普肽没有被蛋白激酶PKA磷酸化时，修饰电极的光电流值比较大，这是因为没有被磷酸化的肯普肽不能被Zr⁴⁺离子将DNA/Au NPs连接到电极上，没有EPI反应，因此产生强烈的光响应。而肯普肽被磷酸化之后，由于Zr⁴⁺对磷酸根具有络合作用，一端含有磷酸基的DNA/Au NPs探针被修饰到电极上，在可见光的照射下，CdS QDs与AuNPs之间发生EPI能量转移，从而导致光电流明显的降低。

2.5光实验条件的优化

在肯普肽的磷酸化过程中，ATP提供了磷酸根的供体，在磷酸化的过程中起着至关重要的作用，因此，我们对实验所用的ATP的浓度进行了优化。由图6可见，光电流的变化值随着ATP的浓度的增加而增大，当ATP的浓度达到100mM时光电流变化值得到最大，随着ATP的浓度继续增加，光电流变化值不再变化，因此本实验选取ATP的浓度为100mM时进行实验。

在酶催化实验中，反应时间也很重要。如图7所示，随着磷酸化时间的延长，光电流的变化值逐渐增大，当磷酸化时间达到80min时达到最大，之后不再变化，因为本发明选择80min的磷酸化时间。

2.6PKA的光电化学检测

EPI作用强度与蛋白激酶的活性相关。蛋白激酶活性的强弱决定着修饰到电极上的DNA/Au NPs的量的多少，从而影响EPI的强度大小，因此，通过检测光电流的变化我们可以实现对蛋白激酶活性的分析。在最优条件下，我们利用构建的光电化学传感器对蛋白激酶PKA的活度进行了分析。图8为不同的PKA激酶所对应的光电流的变化值。由图8可见，随着PKA浓度的增加，光电流不断降低。在PKA的浓度为0.0065～0.065U/mL范围内，光电流呈线性下降，线性方程为I＝1.178–5.601×c，相关系数R＝0.994，其中，I为光电流的强度，c为蛋白激酶PKA的活度，求得检测限为0.0059UmL^-1(S/N＝3)。为了考察本体系对构建的检测PKA激酶活性的光电生物传感器的重复性，我们利用五根相同组装的电极对同一活度(0.5UmL^-1)的PKA进行检测，测得其RSD＝6.15％，重复性良好。

2.7细胞裂解液中PKA活性的检测

当蛋白激酶的表达发生异常的时候，能够导致多方面的细胞问题，比如细胞的增值和分化以及肿瘤的生长等。除此之外，蛋白激酶还是一些肿瘤的标志物等，因此，本体系将构建的生物传感器还应用到了MCF-7细胞内的蛋白激酶PKA的活性检测。将MCF-7细胞用鞣花酸和毛喉素培养后裂解细胞得到细胞裂解液，然后分别测量不同的细胞裂解液中的蛋白激酶的活性。图9为其对应的光电流相应图。可以看到，当MCF-7细胞用用鞣花酸处理后，其裂解液中的PKA活度最低，而用毛喉素处理的细胞裂解液测得的蛋白激酶的活度最高。证明本体系构建的光电传感界面可以应用于在细胞裂解液中对蛋白激酶活性的分析及蛋白激酶抑制剂的筛选，为在细胞中进行蛋白激酶活性分析及蛋白激酶抑制剂的筛选提供理论依据。

最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims

1.一种基于激子-等离子激元能量相互作用检测蛋白激酶活性的电极的制备方法，其特征在于，包括：

在导电基体上组装量子点，形成量子点层；

在量子点层上偶联多肽；

在所述导电基体上修饰一端含有磷酸基的DNA/Au NPs探针；

所述多肽在活性待测生物酶与三磷酸腺苷ATP存在条件下，可发生磷酸化反应；

所述量子点为CdS QDs；

所述多肽为肯普肽；

所述生物酶为蛋白激酶；

所述导电基体为半导体金属氧化物/ITO电极，其中，半导体金属氧化物为氧化钛TiO₂；

所述在量子点层上偶联多肽的具体步骤包括：首先，室温下，将CdS/TiO₂/ITO电极浸入EDC与NHS溶液中60min，清洗过后将50μL浓度为500μM的肯普肽溶液滴加到电极上室温黑暗处反应12h使得肯普肽连接到电极上，二次水清洗之后氮气吹干，得到肯普肽修饰的电极；1mM的6-氨基己酸封闭空白位点30min以减轻非特异性吸附，之后用二次水淋洗并用N₂干燥；含有一系列浓度的PKA和ATP的缓冲溶液50mMTris-HCl and 20mM MgCl₂，pH 7.4滴加到电极上，在37℃下反应80min之后滴加50μL的Zr⁴⁺溶液；1h后将探针DNA/Au NPs滴加到电极上反应，用大量缓冲溶液进行清洗，氮气吹干。

2.能通过权利要求1所述的方法获得的电极。

3.一种基于量子点激子光电效应检测蛋白激酶活性光电化学传感器，其特征在于，包括权利要求2所述的电极。