CN106093148B - 一种可视化光致电生物传感器检测细胞中h2s的构建方法 - Google Patents

一种可视化光致电生物传感器检测细胞中h2s的构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种操作简单、低成本、可视化光致电生物传感器并成功用于细胞中H2S的检测。首先通过水热法制备三维树枝状的二氧化钛纳米棒，三维树枝状二氧化钛纳米棒具有极大的表面积，能够改善对光的吸收，提高灵敏度；在三维树枝状二氧化钛表面吸附Cd2+，制备光电阳极，利用Cd2+与S2‑反应生成CdS，可以增加对可见光的吸收；利用普鲁士蓝的电致变色特性构建光电阴极，将光电阴阳极通过导线连接，在500 W氙灯照射下，光电阳极产生的光电子通过外电路传递到光电阴极，通过测定光电阴极的紫外吸收即可实现定量测定，绘制工作曲线；通过试剂刺激癌细胞释放H2S，利用该方法即可实现对癌细胞内H2S的测定。

Description

一种可视化光致电生物传感器检测细胞中H2S的构建方法
技术领域
本发明涉及葡萄糖半定量分析检测领域，构建了一种便携式可视化光致电生物传感器实现肿瘤细胞中H2S的定量检测，利用水热法，在导电玻璃表面生长三维树枝状的二氧化钛纳米棒，利用Cd2+与S2-反应在三维树枝状二氧化钛纳米棒表面原位生成CdS构建光阳极基底，利用普鲁士蓝做为电致变色材料构成阴极，实现光致电可视化检测。
背景技术
H2S是一种具有臭鸡蛋气味的有害气体，同时也是一种重要的气体信号分子，在生命活动中，H2S起到十分重要的作用，包括调控神经递质传递、调控细胞生长、调控胰岛素的释放、调制氧化还原反应以及抗炎作用。同时研究表明，H2S的含量还与帕金森综合征、唐氏综合症、糖尿病以及慢性肝硬化发病相关。因此，快速准确的检测H2S的含量对于研究生物进程以及疾病诊断方面具有十分重要的意义。长期以来，在研究人员不断的努力下，产生各式各样的检测原理。在已有检测原理的基础之上，人们又不断寻求反应时间更快，检测时间更短，灵敏度更高的方法。
目前测定H2S的方法主要有电化学法、电感耦合等离子体原子发射、气象色谱法及荧光等方法。但是上述方法一起仪器比较昂贵、操作复杂，甚至需要专业人员操作，不利于实现便携式快速现场检测，限制了其广泛应用和发展。因此需要研制一种灵敏度高、选择性好、快速、低成本、应用范围广的检测方法。
发明内容
鉴于现有技术中存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题是提供了一种操作简单、检测速度快、成本低廉的可视化光致电生物传感器检测H2S的方法。
为了解决上述技术问题，本发明是通过构建一种新型的可视化光致电生物传感器，该可视化光致电生物传感器的制备方法为：
（1）利用长为5 cm宽为1 cm的导电玻璃作为基底，利用水热法在导电玻璃表面合成三维树枝状的二氧化钛纳米棒；
（2）在三维树枝状二氧化钛纳米棒表面固定Cd2+作为光电阳极，将制备好的光电阳极保存在4℃备用；
（3）在导电玻璃表面电聚合普鲁士蓝作为电致变色材料构成光电阴极；
（4）将制备的光电阳极插入不同浓度的S2-标准溶液中反应一段时间；
（5）如附图1所示，将S2-标准溶液处理的光电阳极与电聚合普鲁士蓝的光电阴极通过导线连接，插入电子供体的溶液中，在500W氙灯照射下引发反应，照射一段时间，通过测定光电阴极电聚合普鲁士蓝的紫外吸收，构建标准曲线；
（6）将制备的光电阳极插入一定数量的癌细胞溶液中，加入刺激试剂，引发细胞释放H2S，反应一段时间，冲洗，将处理过的光电阳极与电聚合普鲁士蓝的光电阴极通过导线连接，在500W氙灯照射下引发反应，照射一段时间，通过测定光电阴极电聚合普鲁士蓝的紫外吸收，即可得到每个细胞释放H2S的浓度。
本发明所述的导电玻璃为氟掺杂氧化锡导电玻璃（FTO），电子供体为抗坏血酸（AA），癌细胞为乳腺癌细胞，刺激试剂为血管内皮生长因子（VEGF）。
本发明所述三维树枝状二氧化钛纳米棒的制备过程如下：首先将FTO分别置于丙酮、乙醇和二次水中各自超声10 min清洗，6 M HCl溶液搅拌10 min，随后加入0.8 mL钛酸四丁酯继续搅拌30 min，将上述混合溶液转入50 mL高压釜，将4片FTO放入高压釜中，导电面朝下，将高压釜拧紧，放入150 ℃烘箱中反应4 h，反应完毕，取出FTO用二次水冲洗，即得到二氧化钛纳米棒；随后将0.5 mL HCl加入40 mL二次水中搅拌10 min，然后加入0.5 mL三氯化钛溶液继续搅拌10 min，将上述制备的含有二氧化钛纳米棒FTO置于上述溶液中，导电面向下，用保鲜膜封口，置入80 ℃烘箱中反应40 min，反应完毕取出用二次水冲洗，置于450 ℃马弗炉中煅烧1 h，升温速率5 ℃/min，即可得到三维树枝状二氧化钛纳米棒。
本发明所述光电阳极的制备，包括以下步骤：将上述制备的三维树枝状二氧化钛纳米棒浸入50 mM CdSO4溶液中30 min，反应完毕二次水冲洗即可得到需要的光电阳极。
本发明所述光电阴极的制备过程包括以下步骤：将FTO浸入体积比1:1的乙醇：浓度为1 M的氢氧化钠混合溶液，随后用二次水冲洗，氮气干燥，将FTO插入0.1 M KCl、0.1 MHCl、2.5 mM K3[Fe(CN)6]和2.5 mM FeCl3混合溶液中，采用恒电位沉积法沉积600 s，沉积电位为0.4 V，反应完毕二次水冲洗，即可得到光电阴极材料。
本发明所述可视化光致电生物传感器工作曲线的制作包括以下步骤：将制备的光电阳极插入配置的一系列S2-标准溶液中反应30 s，随后用二次水冲洗，将处理后的光电阳极与光电阴极通过导线连接，置入0.1 M AA溶液中，利用500 W氙灯照射光电阳极引发反应，照射时间为10 s，反应完毕，断开光电阴阳极连接，冲洗光电阴极，测定光电阴极的紫外吸收，制备工作曲线。
本发明所述测定癌细胞内的H2S测定步骤包括以下步骤：将制备得到的光电阳极置于含有数量一定的MCF-7细胞培养液中，加入35 ng/mL VEGF，反应5 min，取出处理的光电阳极用二次水冲洗，将处理后的光电阳极与光电阴极通过导线连接，放入含有0.1 M的AA溶液中，利用500 W氙灯照射光电阳极引发反应，照射时间为10 s，反应完毕，断开光电阴阳极连接，冲洗光电阴极，测定光电阴极的紫外吸收，即可得到每个细胞释放的H2S的浓度。
本发明的有益效果：
（1）通过原位生长合成CdS，避免在预先合成过程中所造成的误差；
（2）合成三维树枝状的二氧化钛纳米棒，极大地增大了二氧化钛的表面积，有利于改善灵敏度；
（3）将光致电生物传感器结合电致变色，构建可视化光致电生物传感器，可以通过肉眼确定被测物浓度范围，有利于推广应用。
附图说明
下面结合附图和具体实施方案对本发明作进一步详细描述
图1为该可视化光致电生物传感器的机理图。
具体实施方式
实施例1：乳腺癌细胞中H2S的检测
（1）首先将FTO分别置于丙酮、乙醇和二次水中各自超声10 min清洗，6 M HCl溶液搅拌10 min，随后加入0.8 mL钛酸四丁酯继续搅拌30 min，将上述混合溶液转入50 mL高压釜，将4片FTO放入高压釜中，导电面朝下，将高压釜拧紧，放入150 ℃烘箱中反应4 h，反应完毕，取出FTO用二次水冲洗，即得到二氧化钛纳米棒；随后将0.5 mL HCl加入40 mL二次水中搅拌10 min，然后加入0.5 mL三氯化钛溶液继续搅拌10 min，将上述制备的含有二氧化钛纳米棒FTO置于上述溶液中，导电面向下，用保鲜膜封口，置入80 ℃烘箱中反应40 min，反应完毕取出用二次水冲洗，置于450 ℃马弗炉中煅烧1 h，升温速率5 ℃/min，即可得到三维树枝状二氧化钛纳米棒；
（2）将上述制备的三维树枝状二氧化钛纳米棒浸入50 mM CdSO4溶液中30 min，反应完毕二次水冲洗即可得到需要的光电阳极；
（3）将FTO浸入体积比1:1的乙醇：浓度为1M的氢氧化钠混合溶液，随后用二次水冲洗，氮气干燥，将FTO插入0.1 M KCl、0.1 M HCl、2.5 mM K3[Fe(CN)6]和2.5 mM FeCl3混合溶液中，采用恒电位沉积法沉积600 s，沉积电位为0.4 V，反应完毕二次水冲洗，即可得到光电阴极材料；
（4）配置一系列S2-的标准溶液；
（5）将制备的光电阳极插入配置的一系列S2-标准溶液中反应30 s，随后用二次水冲洗，将处理后的光电阳极与光电阴极通过导线连接，置入0.1 M AA溶液中，利用500 W氙灯照射光电阳极引发反应，照射时间为10 s，反应完毕，断开光电阴阳极连接，冲洗光电阴极，测定光电阴极的紫外吸收，制备工作曲线；
（6）将制备得到的光电阳极置于含有数量一定的MCF-7细胞培养液中，加入35 ng/mL VEGF，反应5 min，取出处理的光电阳极用二次水冲洗，将处理后的光电阳极与光电阴极通过导线连接，放入含有0.1 M的AA溶液中，利用500 W氙灯照射光电阳极引发反应，照射时间为10 s，反应完毕，断开光电阴阳极连接，冲洗光电阴极，测定光电阴极的紫外吸收，即可得到每个细胞释放的H2S的浓度，每个MCF-7细胞释放的H2S浓度大约为1.23 ×10−7 M。

Claims (7)

1.一种可视化光致电生物传感器检测细胞中H2S的构建方法，其特征是包括以下步骤：
（1）利用长为5 cm宽为1 cm导电玻璃作为基底，利用水热法在导电玻璃表面合成三维树枝状的二氧化钛纳米棒；
（2）在三维树枝状二氧化钛纳米棒表面固定Cd2+作为光电阳极，将制备好的光电阳极保存在4℃备用；
（3）在导电玻璃表面电聚合普鲁士蓝作为电致变色材料构成光电阴极；
（4）将制备的光电阳极插入不同浓度的S2-标准溶液中反应一段时间；
（5）将S2-标准溶液处理的光电阳极与电聚合普鲁士蓝的光电阴极通过导线连接，插入电子供体的溶液中，在500W氙灯照射下引发反应，照射一段时间，通过测定光电阴极电聚合普鲁士蓝的紫外吸收，构建标准曲线；
（6）将制备的光电阳极插入一定数量的癌细胞溶液中，加入刺激试剂，引发细胞释放H2S，反应一段时间，冲洗，将处理过的光电阳极与电聚合普鲁士蓝的光电阴极通过导线连接，在500W氙灯照射下引发反应，照射一段时间，通过测定光电阴极电聚合普鲁士蓝的紫外吸收，即可得到每个细胞释放H2S的浓度。
2.根据权利要求1所述一种可视化光致电生物传感器检测细胞中H2S的构建方法，所用的导电玻璃为氟掺杂氧化锡导电玻璃（FTO），电子供体为抗坏血酸（AA），癌细胞为乳腺癌细胞，刺激试剂为血管内皮生长因子（VEGF）。
3.根据权利要求1所述一种可视化光致电生物传感器检测细胞中H2S的构建方法，其特征是：制备三维树枝状二氧化钛纳米棒的方法为，首先将FTO分别置于丙酮、乙醇和二次水中各自超声10 min清洗，6 M HCl溶液搅拌10 min，随后加入0.8 mL钛酸四丁酯继续搅拌30min，将上述混合溶液转入50 mL高压釜，将4片FTO放入高压釜中，导电面朝下，将高压釜拧紧，放入150 ℃烘箱中反应4 h，反应完毕，取出FTO用二次水冲洗，即得到二氧化钛纳米棒；随后将0.5 mL HCl加入40 mL二次水中搅拌10 min，然后加入0.5 mL三氯化钛溶液继续搅拌10 min，将上述制备的含有二氧化钛纳米棒FTO置于上述溶液中，导电面向下，用保鲜膜封口，置入80 ℃烘箱中反应40 min，反应完毕取出用二次水冲洗，置于450 ℃马弗炉中煅烧1 h，升温速率5 ℃/min，即可得到三维树枝状二氧化钛纳米棒。
4.根据权利要求1所述一种可视化光致电生物传感器检测细胞中H2S的构建方法，其特征是：制备光电阳极的方法为，将上述制备的三维树枝状二氧化钛纳米棒浸入50 mM CdSO4溶液中30 min，反应完毕二次水冲洗即可得到需要的光电阳极。
5.根据权利要求1所述一种可视化光致电生物传感器检测细胞中H2S的构建方法，其特征是：光电阴极的制备方法为，将FTO浸入体积比1:1的乙醇：浓度为1 M的氢氧化钠混合溶液，随后用二次水冲洗，氮气干燥，将FTO插入0.1 M KCl、0.1 M HCl、2.5 mM K3[Fe(CN)6]和2.5 mM FeCl3混合溶液中，采用恒电位沉积法沉积600 s，沉积电位为0.4 V，反应完毕二次水冲洗，即可得到光电阴极材料。
6.根据权利要求1所述一种可视化光致电生物传感器检测细胞中H2S的构建方法，其特征是：标准曲线的绘制方法为，首先配置一系列浓度S2-的标准溶液,将制备的光电阳极插入配置的一系列S2-标准溶液中反应30 s，随后用二次水冲洗，将处理后的光电阳极与光电阴极通过导线连接，置入0.1 M AA溶液中，利用500 W氙灯照射光电阳极引发反应，照射时间为10 s，反应完毕，断开光电阴阳极连接，冲洗光电阴极，测定光电阴极的紫外吸收，制备工作曲线。
7.根据权利要求1所述一种可视化光致电生物传感器检测细胞中H2S的构建方法，其特征是：测定每个乳腺癌细胞中H2S浓度的方法为，将制备得到的光电阳极置于含有数量一定的MCF-7细胞培养液中，加入35 ng/mL VEGF，反应5 min，取出处理的光电阳极用二次水冲洗，将处理后的光电阳极与光电阴极通过导线连接，放入含有0.1 M的AA溶液中，利用500 W氙灯照射光电阳极引发反应，照射时间为10 s，反应完毕，断开光电阴阳极连接，冲洗光电阴极，测定光电阴极的紫外吸收，即可得到每个细胞释放的H2S的浓度。
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