CN106501336B - 一种光电化学传感器及其制备与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种光电化学传感器及其制备与应用，制备方法包括：(S1)对ITO导电玻璃进行预处理；(S2)往ITO上滴加TiO₂纳米颗粒制备ITO/TiO₂电极；(S3)将电极浸没在碳量子点溶液中10h得到ITO/TiO₂/CQDs电极；(S4)往电极上滴加壳聚糖得到ITO/TiO₂/CQDs/CS电极；(S5)往电极上滴加戊二醛溶液；(S6)滴加凝血酶适配体滴，在4℃湿润的条件下反应10～15h，淋洗吹干后；继续在电极上滴加牛血清白蛋白，再淋洗吹干。制得的光电化学传感器可用于检测凝血酶。本发明利用碳量子点较宽的可见光吸收范围、良好的发光性质和高效的电子注入能力，作为二氧化钛的光敏剂，使得该复合结构在可见光下有良好的光电流响应。得到的传感器具有操作简单、成本低、绿色环保、高灵敏度及选择性好。

Description

一种光电化学传感器及其制备与应用

技术领域

本发明属于新型功能材料、生物传感技术新领域，涉及一种基于碳量子点及二氧化钛复合材料的光电化学传感器的制备，及其应用于人血清、药品及化妆品中凝血酶的检测。

背景技术

光电化学过程指的是光敏材料在光照作用下所发生的经由电子激发及电荷转移的光电转换过程。电化学生物传感器作为一种独立的集成检测装置，已经对生化、医疗领域产生了日益重要的影响。随着纳米技术和材料化学的快速发展，在光电化学过程与电化学生物传感器的结合的基础上发展出了新一代光电化学(PEC)生物传感，从而为探索各类生物学相互作用提供了一种新的灵敏检测方法。本质上，和其它已经建立的分析技术如电致化学发光(ECL)一样，PEC分析也是一种基于传统电化学的分析技术。因此，该方法继承了后者的诸多优点，如价格低廉，设备简单，灵敏度高。但是，两者之间也存在了很大的差异，PEC传感技术具有一些在传统电化学平台上难以实现的优点。在光电化学检测中，光被用作激发信号来激发光电化学物质，而电信号则作为检测信号，该过程与ECL正好相反。由于采用了两种不同形式的激发和检测信号，该技术背景信号较低，故具有很高的灵敏度。实际上，在使用相同设计进行同一物质检测时，基于PEC的方法也比基于电化学的方法呈现出更好的检测性能(如更低的检测限)。

目前，应用在光电化学传感的材料主要包括一些半导体材料，包括：TiO₂、BiOI、QDs(quantum dots)、g-C₃N₄、WO₃和ZnO。然而ZnO不够稳定，TiO₂禁带宽度为3.2eV使其仅在<387.5nm波长的紫外光下有较高光电活性，这些都限制了他们在光电化学传感器上的应用。为了提高TiO₂对可见光的利用，许多研究将TiO₂与有机染料、半导体量子点例如CdS、CdSe、CdTe结合拓展其对光的吸收范围。许多研究表明，将半导体量子点(CdS、CdSe、CdTe)修饰在TiO₂基底电极上，能提高电极在可见光下的光电活性，并应用于光电化学传感。但光腐蚀和有毒重金属限制了这类半导体量子点(CdS、CdSe、CdTe)在光电化学传感的应用。

近年来，碳量子点的出现引起了广泛的关注。碳量子点具有诸多优良的性质。碳量子点的发光具有尺寸和波长依赖性，并且发光具有高的稳定性，无光漂白，克服了有机染料发光不稳定，易光漂白的缺点。碳量子点容易制备，制备使用的原材料廉价、广泛。此外，与传统量子点CdTe、CdS、InAs、CdSe相比，碳量子点低毒，具有好的生物兼容性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种光电化学传感器及其制备与应用以解决传统的光电化学传感具有光腐蚀和有毒重金属生物相容性差，不适合凝血酶的检测等问题。

为了解决上述问题，本发明提供一种光电化学传感器的制备方法，包括以下步骤：

(S1)先对ITO导电玻璃进行预处理；

(S2)将TiO₂纳米颗粒制备成0.5～2mg/mL TiO₂悬浮液后滴加在预处理过的ITO导电玻璃的导电面上，105℃的烘箱中5～10min快速烘干后置于450℃马弗炉中20～40min，冷却至室温后得到稳定的ITO/TiO₂电极；

(S3)将ITO/TiO₂电极浸没在0.5～5mg/mL的碳量子点溶液中10h，超纯水淋洗后用氮气吹干，得到ITO/TiO₂/CQDs电极；

(S4)滴加0.03～0.05wt％壳聚糖溶液滴到ITO/TiO₂/CQDs电极上反应30～60min，50～60℃真空干燥箱中烘干，再用氢氧化钠溶液和超纯水淋洗后用氮气吹干，即得到ITO/TiO₂/CQDs/CS电极；

(S5)再滴加3～8％戊二醛溶液滴在ITO/TiO₂/CQDs/CS电极上反应30～60min，用超纯水淋洗后氮气吹干；

(S6)将3～10μmol/L的凝血酶适配体滴在步骤(S5)得到的电极上，在4℃湿润的条件下反应10～15h，紧接着用PBS缓冲溶液淋洗后氮气吹干；继续在电极上滴加0.5～2％牛血清白蛋白，再用缓冲溶液淋洗、氮气吹干。

滴加二氧化钛的浓度过高，导致成膜过厚，影响电子传递；浓度过低，成膜太薄，提供的比表面积过小，不利于碳量子点的组装。碳量子点的浓度越高，电极上修饰的碳量子点越多，光电流响应强度越大。浓度高到一定程度后，光电流响应强度无太大变化；浓度过低将导致电极的光电流响应强度过低，影响传感器的灵敏度。在戊二醛的交联作用下壳聚糖上的-NH₂和凝血酶适配体末端的-COOH结合。牛血清的蛋白是反应掉多余的结合位点。

进一步的，所述碳量子点溶液和所述TiO₂纳米颗粒的质量比为1～2.5；所述戊二醛、壳聚糖和凝血酶适配体的摩尔比为1：1：1；所述凝血酶适配体序列为：5’-COOH-C₆-TTTTTTGGTTGGTGTGGTTGG-3’。

进一步的，所述碳量子点溶液的制备主要包括以下步骤：

(S11)取柠檬酸和乙二胺溶解在超纯水中，剧烈搅拌10-15min；

(S12)将步骤(S11)所得混合溶液转移至聚四氟乙烯内衬不锈钢高压反应釜中，将反应釜放置在150～220℃的烘箱中放置3～6h；取出不锈钢高压反应釜，放置在室温中自然冷却；

(S13)将得到黑棕色的溶液移入透析袋中透析2～3天；

(S14)将步骤(S13)得到的透析液用旋转蒸发仪进行浓缩，将浓缩液放置在50～60℃的真空干燥箱中48h；最后对干燥后得到棕黑色的固体进行研磨；

(S15)将步骤(S14)得到的棕黑色粉末溶解在超纯水中。得到的碳量子点溶液粒径分布在1～4nm之间。

进一步的，所述二氧化钛纳米颗粒的制备主要包括以下步骤：

(S21)取钛酸四丁酯溶液加入到无水乙醇中混合搅拌均匀，在高速磁力搅拌下逐滴加入超纯水，滴加完毕后继续搅拌1～2h；

(S22)将溶液转移至聚四氟乙烯内衬的不锈钢反应釜中，将不锈钢反应釜放置在180～220℃的烘箱中反应8～12h；

(S23)将得到的白色沉淀物用乙醇和超纯水洗涤多次，然后置于50～60℃的真空干燥箱中12～24h，最后将得到的白色固体研磨成粉。

进一步的，所述ITO导电玻璃的预处理为：将ITO导电玻璃依次用丙酮、1mol/L氢氧化钠(溶剂为50％乙醇溶液)、超纯水中超声15～30min，最后将ITO导电玻璃在氮气下吹。

进一步的，所述透析袋的分子截留量为1000。

进一步的，所述ITO导电玻璃的大小为3.0×1.0cm²，方阻小于6Ω。

一种上述制备方法得到的光电化学传感器。

一种光电化学传感器的应用，用于检测凝血酶。

进一步的，凝血酶的检测主要包括以下步骤：

(S31)在所制备的光电化学传感器电极表面滴加8μL 1～1000pmol/L的凝血酶，在室温下反应1h，PBS缓冲溶液淋洗、氮气吹干；

(S32)使用电化学工作站以三电极体系进行测试，Ag/AgCl为参比电极，铂丝电极为对电极，所制备的光电化学传感器电极为工作电极，在pH 7.0～7.8的含0.005～0.1mol/L抗坏血酸的PBS缓冲溶液中进行测试；

(S33)使用时间-电流法对制备的光电化学传感器电极进行光电流响应测试，绘制工作曲线。测试条件为设置电压0V，运行时间70s，每隔10s给予光照，每次持续10s。使用光源为350W或者500W氙灯光源+420nm滤光片。测试使用的电解池为四面透光的石英电解池。

本发明提出一种利用碳量子点为光敏剂结合二氧化钛纳米材料构建高灵敏度、高选择性检测凝血酶的光电化学适配体传感器。通过浸没自主装的方法成功制备出在可见光下有在较强的光电响应的ITO/TiO₂/CQDs电极。由于二氧化钛纳米颗粒大比表面积，为碳量子点提供了良好的复合平台，使得碳量子点成功修饰在ITO/TiO₂电极上，极大的提高了电极的光电流响应。不仅如此，还成功使凝血酶适配体上的羧基和ITO/TiO₂/CQDs电极上壳聚糖分子上的氨基通过戊二醛的交联作用将凝血酶适配体修饰到电极上。当凝血酶在电极上培育后，与电极的上凝血酶适配体特异性结合，使得电极的光电流响应显著下降。

与现有技术相比，本发明利用碳量子点较宽的可见光吸收范围、良好的发光性质和高效的电子注入能力，作为二氧化钛的光敏剂，使得该复合结构在可见光下有良好的光电流响应。得到的传感器具有操作简单、成本低、绿色环保、选择性好、电流响应更快速、更稳定、对凝血酶实现了高灵敏度检测，所测试得到的线性范围为1pmol/L～250pmol/L，检测限为0.83pmol/L。相比同类光电传感器，该发明制备的光电化学传感器光。

附图说明

图1为本发明的光电化学传感器的制备过程示意图；

图2为实施例1中碳量子点的高分辨透射电镜图；

图3为实施例1中ITO/TiO₂的扫描电镜图；

图4为实施例1中构建的不同电极界面的光电化学传感器在0.1mol/L pH 7.4PBS缓冲溶液含0.01mol/L抗坏血酸，偏电位0V及420nm波长光源下的光电流响应图；

图5为实施例1中构建的不同电极界面的光电化学传感器在0.1mol/L pH 7.4PBS缓冲溶液中含5mmol/L[Fe(CN)₆]^3-/^4-和0.1mol/L的氯化钾、开路电压0.23V下电化学阻抗谱图；

图6为实施例1中构建的光电化学传感器对不同浓度凝血酶的光电流响应图；

图7为干扰物质对实施例1中构建的光电化学传感器检测凝血酶的影响。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。

实施例1

一种光电化学传感器的制备方法，如图1所示，主要包括以下步骤：

(1)碳量子点的合成

取0.735g柠檬酸和235μL乙二胺溶解在7mL的超纯水中，剧烈搅拌10min。接着将混合溶液转移至13mL的聚四氟乙烯内衬不锈钢高压反应釜中，将反应釜放置在200℃的烘箱中放置5h。5h后取出不锈钢高压反应釜，放置在室温中自然冷却。然后将得到黑棕色的溶液移入分子截留量(MWCO)为1000的透析袋中透析2-3天。对得到的透析液用旋转蒸发仪进行浓缩，接着将得到的浓缩液放置在60℃的真空干燥箱中48h，最后对得到棕黑色的固体进行研磨，得到碳量子点粉末。将碳量子点粉末溶解在超纯水中即可得到碳量子点溶液。碳量子点溶液的形貌如图2中高分辨透射电镜图所示，粒径分布在1～4nm之间。

(2)二氧化钛纳米颗粒的合成

取7mL钛酸四丁酯溶液加入到30mL无水乙醇中混合搅拌均匀，在高速磁力搅拌下逐滴加入10mL超纯水。滴加完毕后，继续搅拌2h。接着将溶液转移至100mL聚四氟乙烯内衬的不锈钢反应釜中，将不锈钢反应釜放置在200℃的烘箱中反应10h。最后，将得到的白色沉淀物用乙醇和超纯水个洗涤3次，然后置于60℃的真空干燥箱中烘干。最后将得到的白色固体研磨成粉，即纳米二氧化钛颗粒。二氧化钛纳米颗粒在ITO电极上的形貌如图3所示。从图3中可以看出二氧化钛纳米颗粒在ITO电极上分布良好，为碳量子点的修饰提供良好的平台。

(3)ITO/TiO₂/CQDs电极的制备

ITO导电玻璃前处理：将购买的ITO导电玻璃(3.0×1.0cm²)依次在丙酮、1mol/L氢氧化钠(溶剂为50％乙醇溶液)、超纯水中超声15min，接着将ITO导电玻璃在氮气下吹干待用。取4mg二氧化钛纳米颗粒溶解在4mL的超纯水中，超声震荡1h。取8μL均匀悬浮液滴在处理过的ITO导电玻璃的导电面上，将ITO导电玻璃放入在105℃的烘箱中快速烘干。然后，将ITO导电玻璃置于450℃马弗炉中30min，冷却至室温后得到稳定的ITO/TiO₂电极。最后，将ITO/TiO₂电极浸没在1mg/mL的碳量子点溶液中10h，超纯水淋洗后用氮气吹干得到ITO/TiO₂/CQDs电极。

(4)生物传感器的构建

将30mg壳聚糖粉末溶解在100mL 1％冰醋酸溶液中制得0.03wt％的壳聚糖溶液。取8μL 0.03wt％的壳聚糖溶液滴到ITO/TiO₂/CQDs电极上，在50℃的真空干燥箱中烘干。接着，用0.1mol/L的氢氧化钠溶液和超纯水淋洗2次后用氮气吹干，即得到ITO/TiO₂/CQDs/CS电极。取8μL 5％戊二醛溶液滴在ITO/TiO₂/CQDs/CS电极上反应30分钟后将电极用超纯水淋洗多次以除去多余未反应的戊二醛分子。然后，将8μL 5μmol/L的凝血酶适配体滴在上述得到的电极上，在4℃湿润的条件下反应12小时，紧接着用10mmol/L pH 7.4PBS缓冲溶液淋洗、氮气吹干。在电极上滴加10μL 2％牛血清白蛋白以反应掉未结合的位点，10mmol/L pH7.4PBS缓冲溶液淋洗、氮气吹干，待用。图4为不同电极界面的光电化学传感器在0.1mol/LpH 7.4PBS缓冲溶液含0.01mol/L抗坏血酸，偏电位0V及420nm波长光源下的光电流响应图，其中a为ITO电极，b为ITO/TiO₂电极，c为ITO/TiO₂/CQDs电极，d为ITO/TiO₂/CQDs/CS，e为ITO/TiO₂/CQDs/CS/TBA，f为ITO/TiO₂/CQDs/CS/TBA/BSA，g为ITO/TiO₂/CQDs/CS/TBA/BSA/TB。图5为不同电极界面的光电化学传感器在0.1mol/L pH 7.4PBS缓冲溶液中含5mmol/L[Fe(CN)₆]^3-/^4-和0.1mol/L的氯化钾、开路电压0.23V下电化学阻抗谱图；其中a为ITO电极，b为ITO/TiO₂电极，c为ITO/TiO₂/CQDs电极，d为ITO/TiO₂/CQDs/CS，e为ITO/TiO₂/CQDs/CS/TBA，f为ITO/TiO₂/CQDs/CS/TBA/BSA，g为ITO/TiO₂/CQDs/CS/TBA/BSA/TB。从图4和图5中可以看出电极的每一步都修饰成功。

(5)凝血酶的检测

将8μL的不同浓度凝血酶溶液滴加到上述制备好的电极表面，室温下反应1小时，用10mmol/L pH 7.4PBS缓冲溶液淋洗、氮气吹干，待测。光电化学测试以含10mmol/L抗坏血酸0.1mol/L pH 7.4PBS缓冲液作为电解质溶液并在使用通氮除氧10分钟。取10mL上述电解液加入到定制的石英电解池中，以Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对电极，在420nm波长下，每隔10s中给予光照，进行I-T曲线测试光电流响应。其中(选取电位：0V，光源距工作电极距离21.5cm)

由图6所示的线性曲线可知，光电化学适配体传感器所产生的光电流的大小与凝血酶浓度的对数在1.0-250pmol/L范围内呈现较好的线性关系。其线性方程I＝4.7451-1.0884lgC(pmol/L)，线性相关系数0.9934。该方法检测凝血酶的检测限为0.83pmol/L(S/N＝3)。该结果表明该方法可以在较宽的浓度范围内对凝血酶进行快速、灵敏的定量分析。

(6)干扰实验

光电化学适配体传感器的选择性通过测定该传感体系对葡萄糖、胰蛋白酶、糜蛋白酶进行光电流响应进行评价。如图7所示，当葡萄糖、胰蛋白酶、糜蛋白酶在光电化学适配体传感器电极上培育后，其光电流响应与未培育前的光电化学适配体传感器电极的光电流响应强度相差无几。该结果表明葡萄糖、胰蛋白酶、糜蛋白酶对凝血酶的检测基本没有影响，所制备的光电化学适配体传感器对凝血酶的检测具有良好的选择性。

(7)回收率测试

为了更好的说明本实验构建的光电化学适配体传感器在实际血清样本中检测中的时效性，首先用10mM PBS(pH 7.4)的缓冲溶液将血清样品稀释20倍，然后添加不同浓度的凝血酶到血清样本中，测定回收率的检测结果如表1所示。

表1凝血酶在血清样品中的回收率测试

实施例2

(1)碳量子点的合成

取0.735g柠檬酸和235μL乙二胺溶解在8mL的超纯水中，剧烈搅拌10min。接着将混合溶液转移至13mL的聚四氟乙烯内衬不锈钢高压反应釜中，将反应釜放置在220℃的烘箱中放置3h。3h后取出不锈钢高压反应釜，放置在室温中自然冷却。然后将得到黑棕色的溶液移入分子截留量(MWCO)为1000的透析袋中透析2-3天。对得到的透析液用旋转蒸发仪进行浓缩，接着将得到的浓缩液放置在60℃的真空干燥箱中48h，最后对得到棕黑色的固体进行研磨，得到碳量子点粉末。

(2)二氧化钛纳米颗粒的合成

取9mL钛酸四丁酯溶液加入到40mL无水乙醇中混合搅拌均匀，在高速磁力搅拌下逐滴加入10mL超纯水。滴加完毕后，继续搅拌1.5h。接着将溶液转移至100mL聚四氟乙烯内衬的不锈钢反应釜中，将不锈钢反应釜放置在220℃的烘箱中反应8h。最后，将得到的白色沉淀物用乙醇和超纯水个洗涤3次，然后置于50℃的真空干燥箱中烘干。最后将得到的白色固体研磨成粉，即纳米二氧化钛颗粒。

(3)ITO/TiO₂/CQDs电极的制备

ITO导电玻璃前处理：将购买的ITO导电玻璃(3.0×1.0cm²)依次在丙酮、1:1(v:v)乙醇/超纯水(含1mol/L氢氧化钠)、超纯水中超声20min，接着将ITO导电玻璃在氮气下吹干待用。取6mg二氧化钛纳米颗粒溶解在4mL的超纯水中，超声震荡1h。取8μL均匀悬浮液滴在处理过的ITO导电玻璃的导电面上，将ITO导电玻璃放入在105℃的烘箱中快速烘干。然后，将ITO导电玻璃置于450℃马弗炉中40min，冷却至室温后得到稳定的ITO/TiO₂电极。最后，将ITO/TiO₂电极浸没在5mg/mL的碳量子点溶液中10h，超纯水淋洗后用氮气吹干得到ITO/TiO₂/CQDs电极。

(4)生物传感器的构建

将50mg壳聚糖粉末溶解在100mL 1％冰醋酸溶液中制得0.05wt％的壳聚糖溶液。取8μL 0.05wt％的壳聚糖溶液滴到ITO/TiO₂/CQDs电极上，在50℃的真空干燥箱中烘干。接着，用0.1mol/L的氢氧化钠溶液和超纯水淋洗2次后用氮气吹干，即得到ITO/TiO₂/CQDs/CS电极。取8μL 8％戊二醛溶液滴在ITO/TiO₂/CQDs/CS电极上反应40min后将电极用超纯水淋洗多次以除去多余未反应的戊二醛分子。然后，将8μL 8μmol/L的凝血酶适配体滴在上诉得到的电极上，在4℃湿润的条件下反应10小时，紧接着用10mmol/L pH 7.4PBS缓冲溶液淋洗、氮气吹干。在电极上滴加10μL 2％牛血清白蛋白以反应掉未结合的位点，10mmol/L pH7.4PBS缓冲溶液淋洗、氮气吹干，待用。

(5)凝血酶的检测

将8μL的不同浓度凝血酶溶液滴加到上述制备好的电极表面，室温下反应1h，用10mmol/L pH 7.4PBS缓冲溶液淋洗、氮气吹干，待测。光电化学测试以含10mmol/L抗坏血酸0.1mol/L pH 7.4PBS缓冲液作为电解质溶液并在使用通氮除氧10min。取10mL上述电解液加入到定制的石英电解池中，以Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对电极，在420nm波长下，每隔10s中给予光照，进行I-T曲线测试光电流响应。其中(选取电位：0V，光源距工作电极距离21.5cm)。

对实施例2也做了与实施例1相同的检测，结果都与实施例1相似。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种光电化学传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(S1)先对ITO导电玻璃进行预处理；

(S2)将TiO₂纳米颗粒制备成0.5～2mg/mL TiO₂悬浮液后滴加在预处理过的ITO导电玻璃的导电面上，快速烘干后置于450℃马弗炉中20～40min，冷却至室温后得到稳定的ITO/TiO₂电极；

(S3)将ITO/TiO₂电极浸没在0.5～5mg/mL的碳量子点溶液中10h，超纯水淋洗后用氮气吹干，得到ITO/TiO₂/CQDs电极；

(S4)滴加壳聚糖溶液滴到ITO/TiO₂/CQDs电极上反应30～60min，50～60℃真空干燥箱中烘干，再用氢氧化钠溶液和超纯水淋洗后用氮气吹干，即得到ITO/TiO₂/CQDs/CS电极；

(S5)再滴加戊二醛溶液滴在ITO/TiO₂/CQDs/CS电极上反应30～60min，用超纯水淋洗后氮气吹干；

(S6)将3～10μmol/L的凝血酶适配体滴在步骤(S5)得到的电极上，在4℃湿润的条件下反应10～15h，紧接着用PBS缓冲溶液淋洗后氮气吹干；继续在电极上滴加牛血清白蛋白，再用缓冲溶液淋洗、氮气吹干。

2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述碳量子点溶液和所述TiO₂纳米颗粒的质量比为1～2.5，所述戊二醛、壳聚糖和凝血酶适配体的摩尔比为1：1：1；所述凝血酶适配体序列为：5’-COOH-C₆-TTTTTTGGTTGGTGTGGTTGG-3’。

3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述碳量子点溶液的制备主要包括以下步骤：

(S11)取柠檬酸和乙二胺溶解在超纯水中，剧烈搅拌10-15min；

(S12)将步骤(S11)所得混合溶液转移至聚四氟乙烯内衬不锈钢高压反应釜中，将反应釜放置在150～220℃的烘箱中放置3～6h；取出不锈钢高压反应釜，放置在室温中自然冷却；

(S13)将得到黑棕色的溶液移入透析袋中透析2～3天；

(S14)将步骤(S13)得到的透析液用旋转蒸发仪进行浓缩，将浓缩液放置在50～60℃的真空干燥箱中48h；最后对干燥后得到棕黑色的固体进行研磨；

(S15)将步骤(S14)得到的棕黑色粉末溶解在超纯水中。

4.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述二氧化钛纳米颗粒的制备主要包括以下步骤：

(S21)取钛酸四丁酯溶液加入到无水乙醇中混合搅拌均匀，在高速磁力搅拌下逐滴加入超纯水，滴加完毕后继续搅拌1～2h；

(S22)将溶液转移至聚四氟乙烯内衬的不锈钢反应釜中，将不锈钢反应釜放置在180～220℃的烘箱中反应8～12h；

(S23)将得到的白色沉淀物用乙醇和超纯水洗涤多次，然后置于50～60℃的真空干燥箱中12～24h，最后将得到的白色固体研磨成粉。

5.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述ITO导电玻璃的预处理为：将ITO导电玻璃依次在丙酮、1mol/L氢氧化钠、超纯水中超声15～30min，最后将ITO导电玻璃在氮气下吹。

6.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，所述透析袋的分子截留量为1000。

7.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述ITO导电玻璃的大小为3.0×1.0cm²，方阻小于6Ω。

8.一种根据权利要求1-7任一项所述制备方法得到的光电化学传感器。

9.根据权利要求8所述光电化学传感器的应用，其特征在于，用于检测凝血酶。

10.根据权利要求9所述应用，其特征在于，凝血酶的检测主要包括以下步骤：

(S31)在所制备的光电化学传感器表面滴加8μL 1～1000pmol/L的凝血酶，在室温下反应1h，PBS缓冲溶液淋洗、氮气吹干；

(S32)使用电化学工作站以三电极体系进行测试，Ag/AgCl为参比电极，铂丝电极为对电极，所制备的光电化学传感器为工作电极，在pH 7.0～7.8的含0.005～0.1mol/L抗坏血酸的PBS缓冲溶液中进行测试；

(S33)使用时间-电流法对制备的光电化学传感器进行光电流响应测试，绘制工作曲线。