CN109406602B - 一种基于海胆状空心银铂钯三金属纳米粒子的免疫传感器的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于新型纳米材料、免疫分析和生物传感技术领域，提供了一种基于海胆状空心银铂钯三金属纳米粒子的免疫传感器的制备方法及应用，以及由该方法构建的电化学免疫传感器在检测癌胚抗原中的应用，具有检测范围宽、检测下限低、灵敏度高、操作简单、检测速度快等优点，并且具有良好的重现性、稳定性和选择性，构建此电化学免疫传感器的研究对癌胚抗原的检测具有十分重要的意义。
Description
技术领域
本发明属于新型纳米材料、免疫分析和生物传感技术领域，提供了一种基于海胆状空心银铂钯三金属纳米粒子的免疫传感器的制备方法及应用，以及由该方法构建的电化学免疫传感器在检测癌胚抗原中的应用，属于新型功能纳米材料、免疫分析以及生物传感检测技术领域。
背景技术
癌胚抗原是常见的一种肿瘤标志物，存在于胃肠道、呼吸道、泌尿道、乳腺、卵巢等。作为最常见的肿瘤标识物，在癌细胞与癌细胞及其基质胶原之间进行粘附反应，在肿瘤的发展和各种癌症复发的情况下起着非常大的作用及意义。正常人血清中癌胚抗原浓度小于2.5 µg/mL，但吸烟、妊娠期和心血管疾病、糖尿病、非特异性结肠炎等疾病中，15％到53％的病人血清癌胚抗原含量也会升高。所以血清中癌胚抗原的浓度可以作为良性与恶性肿瘤的诊断根据。
电化学免疫传感器是一种将电化学分析方法与免疫学技术相结合而发展起来的具有快速、灵敏、选择性高、成本低廉、操作简便等特点的生物传感器，是基于抗原与抗体特异性反应前后引起电流、电容、电位、电导、交流阻抗等电化学信号的变化来实现对它们对应浓度的测定。
本发明利用层层自组装技术，以多碳纳米管/壳聚糖为基底，以海胆状空心银铂钯三金属纳米粒子作为癌胚抗原检测抗体的标记物，制备了一种基于海胆状空心银铂钯三金属的免疫传感器，实现了对癌胚抗原的定量检测，具有检测范围宽、检测下限低、灵敏度高、操作简单、检测速度快等优点，并且具有良好的重现性、稳定性和选择性，构建此电化学免疫传感器的研究对癌胚抗原的检测具有十分重要的意义。
发明内容
本发明提供了一种基于海胆状空心银铂钯三金属纳米粒子的免疫传感器，所述电化学免疫传感器包括：工作电极、对电极和参比电极，所述工作电极为玻碳电极，其表面依次修饰多碳纳米管/壳聚糖、癌胚抗原捕获抗体、牛血清蛋白、癌胚抗原、海胆状空心银铂钯三金属纳米粒子标记的癌胚抗原检测抗体，所述对电极为铂丝电极，所述参比电极为饱和甘汞电极。
本发明的目的是提供一种海胆状金银钯三金属功能性纳米材料，构建了一种快速超灵敏的夹心型电化学免疫传感器。
本发明的技术方案如下：
1. 一种基于海胆状空心银铂钯三金属纳米粒子的免疫传感器的制备方法，其特征包括以下几个步骤：
（1）将直径为3.0 ~ 5.0 mm的玻碳电极用氧化铝抛光粉抛光成镜面，在无水乙醇中超声清洗干净；
（2）取6.0 µL、0.5 ~ 4.0 mg/mL的多壁碳纳米管/壳聚糖分散液滴加到电极表面，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，晾干；
（3）继续将6.0 µL、5.0 ~ 15.0 µg/mL的癌胚抗原捕获抗体滴加到电极表面，4 ℃冰箱中干燥；
（4）继续将3.0 µL、1.0 ~ 2.0 wt%的BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，pH = 6.98磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
（5）滴加6.0 µL、0.000001 ~ 1 ng/mL的一系列不同浓度的癌胚抗原溶液，pH =6.98磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
（6）将6.0 µL、3.0 ~ 8.0 mg/mL的空心银铂钯三金属纳米粒子标记的癌胚抗原检测抗体检测分散液滴涂于电极表面，静置于4 ℃冰箱中30 ~ 40 min，用pH = 6.98的磷酸盐缓冲液冲洗，置于4 ℃冰箱中晾干，制得一种检测癌胚抗原的电流型免疫传感器的工作电极。
一种基于海胆状空心银铂钯三金属纳米粒子的免疫传感器的制备方法，所述多壁碳纳米管的制备，步骤如下：
（1）制备羧基化多壁碳纳米管分散液
将0.5 g多壁碳纳米管置于500 mL锥形瓶中，加入200 mL体积比为3:1的浓硫酸和浓硝酸混合酸，随后在60 ℃超声反应2 h形成均匀的黑色溶液，高速离心（6000 rpm，5min）洗涤溶液至中性，然后将产物置于100 ℃真空烘箱中干燥8 h，得到羧基化碳纳米管分散液。
一种基于海胆状空心银铂钯三金属纳米粒子的免疫传感器的制备方法，所述壳聚糖纳米粒子及多壁碳纳米管/壳聚糖分散液的制备，步骤如下：
（1）制备壳聚糖纳米粒子
在室温下，取75 mg壳聚糖粉末溶于2%的乙酸，磁力搅拌器10 min，以5 mL/min的速率加入到20%的硫酸钠溶液中，超声震荡1 h，离心（3000 r/min）四次，用超纯水洗涤后得到壳聚糖纳米粒子；
（2）制备多壁碳纳米管/壳聚糖分散液
取30 ~ 50.0 mg羧基化碳纳米管溶解于50 mL去离子水中，将50.0 mg壳聚糖纳米粒子溶解于乙酸溶液（50 mL，1%）中，超声处理30 min后加入到羧基化碳纳米管溶液中，磁力搅拌4 h，然后，多壁碳纳米管/壳聚糖用超纯水离心分离，用1%的乙酸溶液洗去未反应的壳聚糖，得到多壁碳纳米管/壳聚糖分散液用铝箔包裹避光保存，并储存在4 ℃的冰箱中。
一种基于海胆状空心银铂钯三金属纳米粒子的免疫传感器的制备方法，所述海胆状空心银铂钯三金属纳米粒子标记的癌胚抗原检测抗体分散液的制备，步骤如下：
（1）制备银纳米立方体分散液
将10 mL的乙二醇加入50 mL烧杯中，在140 ℃磁力搅拌下加热1 h，接着将盐酸溶液（2.1 mL，3.016 mM）快速注入乙二醇中持续加热10 min，然后，将硝酸银溶液（6 mL，94mM）和聚乙烯吡咯烷酮（6 mL，147 mM）混合以0.6 mL/min的速率加入到反应混合物中，在140 ℃的温度下持续加热搅拌36 h，用超纯水离心洗涤除去过量的聚乙烯吡咯烷酮，所得到的沉淀重新分散于20 mL超纯水，得到银纳米立方体分散液用铝箔包裹并储存在4 ℃的冰箱中；
（2）制备海胆状空心银铂钯三金属纳米分散液
首先将盐酸溶液（0.5 mL，10 mM）与四氯钯酸钾（0.25 mL，5 mM）、氯铂酸（0.25mL，5 mM）混合2 h，接着向制备好的银立方体纳米分散液中加入聚乙烯吡咯烷酮（0.5 mL，100 mM），将混合液置于油浴锅中加热5 min，再以2 mL/min的速率注入含有盐酸、四氯钯酸钾和氯铂酸的溶液中，所得溶液反应1 h，用饱和的氯化钠以及硝酸铁溶液（10 mL，50 mM）离心洗涤，收集黑色沉淀物，将其分散在1.0 mL超纯水中进一步使用；
（3）制备海胆状空心银铂钯三金属纳米粒子标记的癌胚抗原检测抗体分散液
取3.0 ~ 8.0 mL海胆状空心银铂钯纳米分散液分散到1.0 mL、pH = 6.98的磷酸盐缓冲液中，加入1.0 ~ 2.0 mL、10.0 ~ 20.0 µg/mL的癌胚抗体抗体检测分散液，置于4℃恒温振荡培养箱中振荡孵化8 ~ 12 h后，在1500 rpm转速下离心0.5 ~ 2.0 min，得到下层沉淀，加入1.0 mL、pH = 6.98的磷酸盐缓冲溶液离心洗涤1次，将下层沉淀重新分散于1.0 mL、pH = 6.98的磷酸盐缓冲溶液中，得到海胆状空心银铂钯纳米粒子标记的癌胚抗原检测抗体分散液，置于4 ℃下保存。
一种基于海胆状空心银铂钯三金属纳米粒子的免疫传感器的制备方法，用于癌胚抗原的检测，检测步骤如下：
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10 mL的pH值为6.98的磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
（2）用时间-电流法对分析物进行检测，输入电压为-0.4 V，取样间隔0.1 s，运行时间400 s；
（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50 s向的磷酸盐缓冲溶液中注入10 µL、5 mol/L的双氧水溶液，记录电流变化。
本发明的有益成果
（1）本发明利用多壁碳纳米管/壳聚糖作为基底，多壁碳纳米管具有较大的比表面积，能够负载更多的壳聚糖，同时，壳聚糖是一种天然可再生碱性多糖，含有大量的氨基和羟基等活性基团，具有良好的生物可降解性和生物相容性以及抗菌、止血和促进伤口愈合等功能。不同长度壳聚糖纳米粒子修饰的碳纳米管互相缠绕，为电化学反应提供了较好的反应场所，增大了电极表面积。
（2）本发明首次将具有特殊形貌的海胆状空心银铂钯三金属作为癌胚抗原的检测抗体标记物用于免疫传感器的构建，海胆状空心银铂钯三金属纳米粒子具有的独特结构，拥有大量的催化活性位点，能够增加电子的转移速率，从而有效放大电信号，对H2O2的还原表现出了优异的催化性能，提高免疫传感器的灵敏度，降低免疫传感器的检测下限。
（3）本发明的电化学免疫传感器实现了对癌胚抗原精确定量检测的目的，其线性检测范围是0.000001 ~ 1 ng/mL，最低检测下限为0.314 fg/mL。
（4）本发明的方法构建的电化学免疫传感器，操作简单、检测迅速，可用于实际样品的快速检测。
具体实施方式
现将本发明通过具体实施方式进一步说明，但不限于此
实施例1.（1）将直径为3.0 mm的玻碳电极用氧化铝抛光粉抛光成镜面，在无水乙醇中超声清洗干净；
（2）取6.0 µL、0.5 mg/mL的多壁碳纳米管/壳聚糖分散液滴加到电极表面，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，晾干；
（3）继续将6.0 µL、5.0 µg/mL的癌胚抗原捕获抗体滴加到电极表面，4 ℃冰箱中干燥；
（4）继续将3.0 µL、1.0 wt%的BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，pH = 6.98磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
（5）滴加6.0 µL、0.000001 ~ 1 ng/mL的一系列不同浓度的癌胚抗原溶液，pH =6.98磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
（6）将6.0 µL、3.0 mg/mL的空心银铂钯三金属纳米粒子标记的癌胚抗原检测抗体检测分散液滴涂于电极表面，静置于4 ℃冰箱中30 ~ 40 min，用pH = 6.98的磷酸盐缓冲液冲洗，置于4 ℃冰箱中晾干，制得一种检测癌胚抗原的电流型免疫传感器的工作电极。
实施例2.（1）将直径为4.0 mm的玻碳电极用氧化铝抛光粉抛光成镜面，在无水乙醇中超声清洗干净；
（2）取6.0 µL、2.0 mg/mL的多壁碳纳米管/壳聚糖分散液滴加到电极表面，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，晾干；
（3）继续将6.0 µL、10.0 µg/mL的癌胚抗原捕获抗体滴加到电极表面，4 ℃冰箱中干燥；
（4）继续将3.0 µL、1.5 wt%的BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，pH = 6.98磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
（5）滴加6.0 µL、0.000001 ~ 1 ng/mL的一系列不同浓度的癌胚抗原溶液，pH =6.98磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
（6）将6.0 µL、5.0 mg/mL的空心银铂钯三金属纳米粒子标记的癌胚抗原检测抗体检测分散液滴涂于电极表面，静置于4 ℃冰箱中30 ~ 40 min，用pH = 6.98的磷酸盐缓冲液冲洗，置于4 ℃冰箱中晾干，制得一种检测癌胚抗原的电流型免疫传感器的工作电极。
实施例3.（1）将直径为5.0 mm的玻碳电极用氧化铝抛光粉抛光成镜面，在无水乙醇中超声清洗干净；
（2）取6.0 µL、4.0 mg/mL的多壁碳纳米管/壳聚糖分散液滴加到电极表面，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，晾干；
（3）继续将6.0 µL、15.0 µg/mL的癌胚抗原捕获抗体滴加到电极表面，4 ℃冰箱中干燥；
（4）继续将3.0 µL、2.0 wt%的BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，pH = 6.98磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
（5）滴加6.0 µL、0.000001 ~ 1 ng/mL的一系列不同浓度的癌胚抗原溶液，pH =6.98磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
（6）将6.0 µL、8.0 mg/mL的空心银铂钯三金属纳米粒子标记的癌胚抗原检测抗体检测分散液滴涂于电极表面，静置于4 ℃冰箱中30 ~ 40 min，用pH = 6.98的磷酸盐缓冲液冲洗，置于4 ℃冰箱中晾干，制得一种检测癌胚抗原的电流型免疫传感器的工作电极。
实施例4. 一种基于海胆状空心银铂钯三金属纳米粒子的免疫传感器的制备方法中所述，壳聚糖纳米粒子及多壁碳纳米管/壳聚糖分散液的制备包括以下步骤：
（1）制备壳聚糖纳米粒子
在室温下，取75 mg壳聚糖粉末溶于2%的乙酸，磁力搅拌器10 min，以5 mL/min的速率加入到20%的硫酸钠溶液中，超声震荡1 h，离心（3000 r/min）四次，用超纯水洗涤后得到壳聚糖纳米粒子；
（2）制备多壁碳纳米管/壳聚糖分散液
取30.0 mg羧基化碳纳米管溶解于50 mL去离子水中，将50.0 mg壳聚糖纳米粒子溶解于乙酸溶液（50 mL，1%）中，超声处理30 min后加入到羧基化碳纳米管溶液中，磁力搅拌4 h，然后，多壁碳纳米管/壳聚糖用超纯水离心分离，用1%的乙酸溶液洗去未反应的壳聚糖，得到多壁碳纳米管/壳聚糖分散液用铝箔包裹避光保存，并储存在4 ℃的冰箱中。
实施例5. 一种基于海胆状空心银铂钯三金属纳米粒子的免疫传感器的制备方法中所述，壳聚糖纳米粒子及多壁碳纳米管/壳聚糖分散液的制备包括以下步骤：
（1）制备壳聚糖纳米粒子
在室温下，取75 mg壳聚糖粉末溶于2%的乙酸，磁力搅拌器10 min，以5 mL/min的速率加入到20%的硫酸钠溶液中，超声震荡1 h，离心（3000 r/min）四次，用超纯水洗涤后得到壳聚糖纳米粒子；
（2）制备多壁碳纳米管/壳聚糖分散液
取40.0 mg羧基化碳纳米管溶解于50 mL去离子水中，将50.0 mg壳聚糖纳米粒子溶解于乙酸溶液（50 mL，1%）中，超声处理30 min后加入到羧基化碳纳米管溶液中，磁力搅拌4 h，然后，多壁碳纳米管/壳聚糖用超纯水离心分离，用1%的乙酸溶液洗去未反应的壳聚糖，得到多壁碳纳米管/壳聚糖分散液用铝箔包裹避光保存，并储存在4 ℃的冰箱中。
实施例6. 一种基于海胆状空心银铂钯三金属纳米粒子的免疫传感器的制备方法中所述，壳聚糖纳米粒子及多壁碳纳米管/壳聚糖分散液的制备包括以下步骤：
（1）制备壳聚糖纳米粒子
在室温下，取75 mg壳聚糖粉末溶于2%的乙酸，磁力搅拌器10 min，以5 mL/min的速率加入到20%的硫酸钠溶液中，超声震荡1 h，离心（3000 r/min）四次，用超纯水洗涤后得到壳聚糖纳米粒子；
（2）制备多壁碳纳米管/壳聚糖分散液
取50.0 mg羧基化碳纳米管溶解于50 mL去离子水中，将50.0 mg壳聚糖纳米粒子溶解于乙酸溶液（50 mL，1%）中，超声处理30 min后加入到羧基化碳纳米管溶液中，磁力搅拌4 h，然后，多壁碳纳米管/壳聚糖用超纯水离心分离，用1%的乙酸溶液洗去未反应的壳聚糖，得到多壁碳纳米管/壳聚糖分散液用铝箔包裹避光保存，并储存在4 ℃的冰箱中。
实施例7. 一种基于海胆状空心银铂钯三金属纳米粒子的免疫传感器的制备方法中所述，所述海胆状空心银铂钯三金属纳米粒子标记的癌胚抗原检测抗体分散液的制备包括以下步骤：
（1）制备银纳米立方体分散液
将10 mL的乙二醇加入50 mL烧杯中，在140 ℃磁力搅拌下加热1 h，接着将盐酸溶液（2.1 mL，3.016 mM）快速注入乙二醇中持续加热10 min，然后，将硝酸银溶液（6 mL，94mM）和聚乙烯吡咯烷酮（6 mL，147 mM）混合以0.6 mL/min的速率加入到反应混合物中，在140 ℃的温度下持续加热搅拌36 h，用超纯水离心洗涤将过量的聚乙烯吡咯烷酮除去，所得到的沉淀重新分散于20 mL超纯水，得到银纳米立方体分散液用铝箔包裹并储存在4 ℃的冰箱中；
（2）制备海胆状空心银铂钯三金属纳米分散液
首先将盐酸溶液（0.5 mL，10 mM）与四氯钯酸钾（0.25 mL，5 mM）、氯铂酸（0.25mL，5 mM）混合2 h，接着向制备好的银立方体纳米分散液中加入聚乙烯吡咯烷酮（0.5 mL，100 mM），将混合液置于油浴锅中加热5 min，再以2 mL/min的速率注入含有盐酸、四氯钯酸钾和氯铂酸的溶液中，所得溶液反应1 h，用饱和的氯化钠以及硝酸铁溶液（10 mL，50 mM）离心洗涤，收集黑色沉淀物，将其分散在1.0 mL超纯水中进一步使用；
（3）制备海胆状空心银铂钯三金属纳米粒子标记的癌胚抗原检测抗体分散液
取4.0 mL海胆状空心银铂钯纳米分散液分散到1.0 mL、pH = 6.98的磷酸盐缓冲液中，加入1.5 mL、15 µg/mL的癌胚抗原检测抗体分散液，置于4 ℃恒温振荡培养箱中振荡孵化12 h后，在1500 rpm转速下离心2.0 min，得到下层沉淀，加入1.0 mL、pH = 6.98的磷酸盐缓冲溶液离心洗涤1次，将下层沉淀重新分散于1.0 mL、pH = 6.98的磷酸盐缓冲溶液中，得到海胆状空心银铂钯纳米粒子标记的癌胚抗原检测抗体分散液，放置于4 ℃下保存。
实施例8. 一种基于海胆状空心银铂钯三金属纳米粒子的免疫传感器的制备方法中所述，所述海胆状空心银铂钯三金属纳米粒子标记的癌胚抗原检测抗体分散液的制备包括以下步骤：
（1）制备银纳米立方体分散液
将10 mL的乙二醇加入50 mL烧杯中，在140 ℃磁力搅拌下加热1 h，接着将盐酸溶液（2.1 mL，3.016 mM）快速注入乙二醇中持续加热10 min，然后，将硝酸银溶液（6 mL，94mM）和聚乙烯吡咯烷酮（6 mL，147 mM）混合以0.6 mL/min的速率加入到反应混合物中，在140 ℃的温度下持续加热搅拌36 h，用超纯水离心洗涤将过量的聚乙烯吡咯烷酮除去，所得到的沉淀重新分散于20 mL超纯水，得到银纳米立方体分散液用铝箔包裹并储存在4 ℃的冰箱中；
（2）制备海胆状空心银铂钯三金属纳米分散液
首先将盐酸溶液（0.5 mL，10 mM）与四氯钯酸钾（0.25 mL，5 mM）、氯铂酸（0.25mL，5 mM）混合2 h，接着向制备好的银立方体纳米分散液中加入聚乙烯吡咯烷酮（0.5 mL，100 mM），将混合液置于油浴锅中加热5 min，再以2 mL/min的速率注入含有盐酸、四氯钯酸钾和氯铂酸的溶液中，所得溶液反应1 h，用饱和的氯化钠以及硝酸铁溶液（10 mL，50 mM）离心洗涤，收集黑色沉淀物，将其分散在1.0 mL超纯水中进一步使用；
（3）制备海胆状空心银铂钯三金属纳米粒子标记的癌胚抗原检测抗体分散液
取5.0 mL海胆状空心银铂钯纳米分散液分散到1.0 mL、pH = 6.98的磷酸盐缓冲液中，加入1.5 mL、15 µg/mL的癌胚抗原检测抗体分散液，置于4 ℃恒温振荡培养箱中振荡孵化12 h后，在1500 rpm转速下离心2.0 min，得到下层沉淀，加入1.0 mL、pH = 6.98的磷酸盐缓冲溶液离心洗涤1次，将下层沉淀重新分散于1.0 mL、pH = 6.98的磷酸盐缓冲溶液中，得到海胆状空心银铂钯纳米粒子标记的癌胚抗原检测抗体分散液，放置于4 ℃下保存。
实施例9. 一种基于海胆状空心银铂钯三金属纳米粒子的免疫传感器的制备方法中所述，所述海胆状空心银铂钯三金属纳米粒子标记的癌胚抗原检测抗体分散液的制备包括以下步骤：
（1）制备银纳米立方体分散液
将10 mL的乙二醇加入50 mL烧杯中，在140 ℃磁力搅拌下加热1 h，接着将盐酸溶液（2.1 mL，3.016 mM）快速注入乙二醇中持续加热10 min，然后，将硝酸银溶液（6 mL，94mM）和聚乙烯吡咯烷酮（6 mL，147 mM）混合以0.6 mL/min的速率加入到反应混合物中，在140 ℃的温度下持续加热搅拌36 h，用超纯水离心洗涤将过量的聚乙烯吡咯烷酮除去，所得到的沉淀重新分散于20 mL超纯水，得到银纳米立方体分散液用铝箔包裹并储存在4 ℃的冰箱中；
（2）制备海胆状空心银铂钯三金属纳米分散液
首先将盐酸溶液（0.5 mL，10 mM）与四氯钯酸钾（0.25 mL，5 mM）、氯铂酸（0.25mL，5 mM）混合2 h，接着向制备好的银立方体纳米分散液中加入聚乙烯吡咯烷酮（0.5 mL，100 mM），将混合液置于油浴锅中加热5 min，再以2 mL/min的速率注入含有盐酸、四氯钯酸钾和氯铂酸的溶液中，所得溶液反应1 h，用饱和的氯化钠以及硝酸铁溶液（10 mL，50 mM）离心洗涤，收集黑色沉淀物，将其分散在1.0 mL超纯水中进一步使用；
（3）制备海胆状空心银铂钯三金属纳米粒子标记的癌胚抗原检测抗体分散液
取6.0 mL海胆状空心银铂钯纳米分散液分散到1.0 mL、pH = 6.98的磷酸盐缓冲液中，加入1.5 mL、15 µg/mL的癌胚抗原检测抗体分散液，置于4 ℃恒温振荡培养箱中振荡孵化12 h后，在1500 rpm转速下离心2.0 min，得到下层沉淀，加入1.0 mL、pH = 6.98的磷酸盐缓冲溶液离心洗涤1次，将下层沉淀重新分散于1.0 mL、pH = 6.98的磷酸盐缓冲溶液中，得到海胆状空心银铂钯纳米粒子标记的癌胚抗原检测抗体分散液，放置于4 ℃下保存。
实施例10. 所构建的免疫传感器，用于癌胚抗原的检测，检测步骤如下：
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10 mL的pH值为6.98的磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
（2）用时间-电流法对分析物进行检测，输入电压为-0.4 V，取样间隔0.1 s，运行时间400 s；
（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50 s向的磷酸盐缓冲溶液中注入10 µL、5 mol/L的双氧水溶液，记录电流变化；
（4）根据所得电流强度与癌胚抗原浓度之间的线性关系，绘制工作曲线，其线性检测范围是0.000001 ~ 1 ng/mL，最低检测下限为0.314 fg/mL。
Claims (1)
1.一种基于海胆状空心银铂钯三金属纳米粒子的免疫传感器的制备方法，其特征在于，步骤如下：
（1）一种基于海胆状空心银铂钯三金属纳米粒子的免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下几个步骤：
所述多壁碳纳米管/壳聚糖分散液的制备，步骤如下：
将0.5 g多壁碳纳米管置于500 mL锥形瓶中，加入200 mL体积比为3:1的浓硫酸和浓硝酸混合酸，随后在60 ℃超声反应2 h形成均匀的黑色溶液，6000 rpm高速离心5 min洗涤溶液至中性，然后将产物置于100 ℃真空烘箱中干燥8 h，得到羧基化碳纳米管分散液；
在室温下，取75 mg壳聚糖粉末溶于2%的乙酸，磁力搅拌器搅拌10 min，以5 mL/min的速率加入到20%的硫酸钠溶液中，超声震荡1 h，3000 r/min离心四次，用超纯水洗涤后得到壳聚糖纳米粒子；
取30 ~ 50.0 mg羧基化碳纳米管溶解于50 mL去离子水中，将50.0 mg壳聚糖纳米粒子溶解于50 mL、1%乙酸溶液中，超声处理30 min后加入到羧基化碳纳米管溶液中，磁力搅拌4h，然后，多壁碳纳米管/壳聚糖用超纯水离心分离，用1%的乙酸溶液洗去未反应的壳聚糖，得到多壁碳纳米管/壳聚糖分散液用铝箔包裹避光保存，并储存在4 ℃的冰箱中；
所述海胆状空心银铂钯三金属纳米粒子标记的癌胚抗原检测抗体分散液的制备，步骤如下：
将10 mL的乙二醇加入50 mL烧杯中，在140 ℃磁力搅拌下加热1 h，接着将2.1 mL、3.016 mM盐酸溶液快速注入乙二醇中持续加热10 min，然后，将6 mL、94 mM硝酸银溶液和6mL、147 mM聚乙烯吡咯烷酮混合以0.6 mL/min的速率加入到反应混合物中，在140 ℃的温度下持续加热搅拌36 h，用超纯水离心洗涤除去过量的聚乙烯吡咯烷酮，所得到的沉淀重新分散于20 mL超纯水，得到银纳米立方体分散液用铝箔包裹并储存在4 ℃的冰箱中；
首先将0.5 mL、10 mM盐酸溶液与0.25 mL、5 mM四氯钯酸钾，0.25 mL、5 mM氯铂酸混合2 h，接着向制备好的银纳米立方体分散液中加入0.5 mL、100 mM聚乙烯吡咯烷酮，将混合液置于油浴锅中加热5 min，再以2 mL/min的速率注入含有盐酸、四氯钯酸钾和氯铂酸的溶液中，所得溶液反应1 h，用饱和的氯化钠以及10 mL、50 mM硝酸铁溶液离心洗涤，收集黑色沉淀物，将其分散在1.0 mL超纯水中进一步使用；
取3.0 ~ 8.0 mL海胆状空心银铂钯纳米分散液分散到1.0 mL、pH = 6.98的磷酸盐缓冲液中，加入1.0 ~ 2.0 mL、10.0 ~ 20.0 µg/mL的癌胚抗原检测抗体分散液，置于4 ℃恒温振荡培养箱中振荡孵化8 ~ 12 h后，在1500 rpm转速下离心0.5 ~ 2.0 min，得到下层沉淀，加入1.0 mL、pH = 6.98的磷酸盐缓冲溶液离心洗涤1次，将下层沉淀重新分散于1.0mL、pH = 6.98的磷酸盐缓冲溶液中，得到海胆状空心银铂钯纳米粒子标记的癌胚抗原检测抗体分散液，置于4 ℃下保存；
（2）一种基于海胆状空心银铂钯三金属纳米粒子的免疫传感器，用于癌胚抗原的检测，检测步骤如下：
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