CN106802314B - 一种基于负载TaC和金包覆十面体银纳米粒子的石墨烯的免疫传感器的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于新型功能材料与生物传感检测技术领域，提供了一种基于负载TaC和金包覆十面体银纳米粒子的石墨烯的免疫传感器的制备方法及应用。具体是采用负载TaC和金包覆十面体银纳米粒子的石墨烯作为标记物，制备了一种检测肿瘤标志物CA199、CA25抗原的电化学免疫传感器。
Description
技术领域
本发明属于免疫分析和生物传感技术领域，提供了一种负载TaC和金包覆十面体银纳米粒子的石墨烯实现信号放大的免疫传感器的制备方法及应用。
背景技术
肿瘤标志物的灵敏检测，在临床上对于肿瘤的早期发现，肿瘤高危人群的筛选、良性和恶性肿瘤的鉴别诊断、肿瘤发展程度的判断，肿瘤的治疗效果的观察和评价及肿瘤复发和预后的预测产生极大的影响，引起人们的广泛关注。
电化学免疫传感器已经广泛用于肿瘤标志物的检测，夹心型电化学免疫传感器结合了高特异性的免疫分析技术和高灵敏的电化学分析技术，具有灵敏度高、制备简单、检测快速、成本低等优点，在临床检验、环境监测、食品安全控制、生物监测等领域都有重要的应用价值。
本发明中使用的石墨烯是褶皱的二维平面薄膜，具有大的比表面积，良好的电子传递能力和催化性能，能有效吸附固载抗体。TaC纳米片高温还原在石墨烯表面，有效地避免了石墨烯片层的堆叠，TaC具有铂族金属的电子结构以及在费米能级上的相似性，具有和贵金属类似的催化活性。此外，相对于过渡金属氧化物（TMO）和过渡金属硫化物（TMS），TaC在酸碱环境中具有更高的稳定性。十面体的银纳米粒子（Ag DeNps）相对于银纳米微球，拥有更多的催化活性位点，但银纳米粒子的稳定性相对较差，均匀包覆的金纳米粒子可以有效的提高银纳米粒子的稳定性。
发明内容
本发明提供了一种基于负载TaC和金包覆十面体银纳米粒子的石墨烯的免疫传感器的制备方法及应用，实现了对肿瘤标志物的超灵敏检测。
本发明的目的之一是提供一种基于负载TaC和金包覆十面体银纳米粒子的石墨烯的免疫传感器的制备方法。
本发明的目的之二是将所制备的基于负载TaC和金包覆十面体银纳米粒子的石墨烯的免疫传感器应用于肿瘤标志物的高灵敏、特异性检测。
本发明的技术方案，包括以下步骤。
1. 一种基于负载TaC和金包覆十面体银纳米粒子的石墨烯的免疫传感器的制备方法，步骤如下：
（1）将直径为3 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；
（2）将上述电极置于质量分数为0.8% ~ 1.0%的HAuCl4溶液中，在-0.2V下扫描30s,在电极表面形成电沉积金基底，用超纯水冲洗，晾干；
（3）继续将6 µL、10 ~ 15 µg/mL的肿瘤标志物捕获抗体滴加到电极表面，超纯水冲洗，4℃冰箱中干燥；
（4）继续将3 µL、1.0 ~ 3.0 mg/mL的牛血清白蛋白溶液滴加到电极表面，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
（5）滴加6 µL、0.0005 ~ 40 ng/mL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原溶液，超纯水冲洗电极表面，4℃冰箱中干燥；
（6）将6 µL、3 ~ 5mg/mL的负载TaC和金包覆十面体银纳米粒子的石墨烯的检测抗体孵化物溶液，滴涂于电极表面上，置于4℃冰箱中晾干，制得一种基于负载TaC和金包覆十面体银纳米粒子的石墨烯的免疫传感器。
2. 如权利要求1所述的一种基于负载TaC和金包覆十面体银纳米粒子的石墨烯的免疫传感器的制备方法，所述金包覆十面体银纳米粒子的制备，步骤如下：
（1）十面体银纳米粒子溶液的制备
取13 ~ 15 mL的超纯水加入到20 mL的烧杯中，依次缓慢加入0.05 mol/L 、0.5mL柠檬酸钠，0.05 mol/L、22.5 µL聚对苯乙烯磺酸钠，0.05 mol/L、50µL精氨酸，0.05 mol/L、0.4mL硝酸银，新配制的0.1mol/L 、0.1 ~ 0.3 mL硼氢化钠，溶液由淡黄色变为亮黄色；600rpm条件下持续搅拌45 min，加入0.2 ~ 0.4 mL、30% H2O2，继续搅拌30 min，生成的溶液置于蓝色的LED灯光下13 ~ 15 h，制得十面体银纳米粒子的溶液，置于4℃冰箱中保存，备用；
（2）金包覆十面体银纳米粒子的制备
将新配置的质量分数为0.1%、1.0 ~ 2.0 mL氯金酸水溶液缓慢加入到3.0 mL的十面体银纳米粒子的溶液中，震荡至溶液由黄色变为酒红色，制得金包覆十面体银纳米粒子的溶液；
3. 如权利要求1所述的一种基于负载TaC和金包覆十面体银纳米粒子的石墨烯的免疫传感器的制备方法，所述负载TaC和金包覆十面体银纳米粒子的石墨烯的检测抗体孵化物溶液的制备，步骤如下：
（1）负载TaC的石墨烯的制备
①石墨烯的制备
在冰水浴和搅拌条件下，将2.0 ~ 3.0g天然石墨粉缓缓地加入到45 ~ 60 mL浓硫酸中，持续搅拌15 ~ 25 min；边搅拌边依次加入10.0 ~ 15.0g KMnO4 和 5.0 ~ 7.5 gNaNO3，保持溶液温度低于20℃，搅拌10 ~ 15 min，再升温至40℃，持续搅拌30 ~ 40 min，加入50 ~ 75mL的超纯水，将溶液置于油浴锅中，95℃下加热30 ~ 40 min；将200mL的超纯水和10 ~ 15 mL、30% 的H2O2加入到上述溶液中，反应至溶液由黑褐色变为黄色，分别用1mol/ L HCl和超纯水洗涤三次；65℃真空干燥12h备用；
②负载TaC的石墨烯的制备
将上述制备的0.1 ~ 0.2 g石墨烯分散在200 mL的超纯水中，超声2 h，加入0.05~ 0.1gK2TaF7继续超声30 ~ 50 min，将混合液置于油浴锅中， 90℃下搅拌，蒸发掉大部分的水，直至变为凝胶状；将凝胶状液体置于表面皿中，在0℃下冷冻干燥12~ 16 h，得到疏松多孔海绵状固体产物，将所得固体在氩气保护、1200℃下煅烧2h，得到负载TaC的石墨烯；
（2）负载TaC和金包覆十面体银纳米粒子的石墨烯的制备
取5~ 7mg 负载TaC的石墨烯加入到3.0 mL 金包覆十面体银纳米粒子的溶液中，超声30min，形成负载TaC和金包覆十面体银纳米粒子的石墨烯溶液，离心；分别用无水乙醇及超纯水洗涤三次、30℃真空干燥24h，得到负载TaC和金包覆十面体银纳米粒子的石墨烯固体粉末；
（3）负载TaC和金包覆十面体银纳米粒子的石墨烯的检测抗体孵化物溶液的制备
将6 ~ 10 mg的负载TaC和金包覆十面体银纳米粒子的石墨烯固体粉末溶于1 mL的pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中，震荡溶解，再加入100 μL、80 ~ 120 μg/mL的肿瘤标志物检测抗体溶液和900 μL、50 mmol/L的pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液，4℃恒温振荡培养箱中振荡，孵化12 h，制得负载TaC和金包覆十面体银纳米粒子的石墨烯的检测抗体孵化物溶液，4℃下保存备用。
4.如权利要求1所述的制备方法制备的一种基于负载TaC和金包覆十面体银纳米粒子的石墨烯的免疫传感器，用于肿瘤标志物的检测，检测步骤如下：
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10 mL、50 mmol/L的pH 5.0 ~ 8.0磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
（2）用时间-电流法对分析物进行检测，输入电压为-0.4 V，取样间隔 0.1 s，运行时间400 s；
（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50 s向10 mL、50 mmol/L的pH7.4的磷酸盐缓冲溶液中注入10 μL、5 mol/L的双氧水溶液，记录电流变化。
上述所述肿瘤标志物选自下列之一：CA199、CA125。
本发明所用原材料均可在化学试剂公司或生物制药公司购买。
本发明的有益成果
（1）本发明使用了负载TaC和金包覆十面体银纳米粒子的石墨烯纳米复合材料，石墨烯有大的比表面积，可增加抗体的结合位点，石墨烯氧化得石墨烯，是亲水性物质，在水中有优越的分散性，且羧基能与抗体上的氨基有效结合，TaC纳米薄片在石墨烯片层上高温还原能有效避免石墨烯片层的堆叠，TaC具有铂族金属的电子结构以及在费米能级上的相似性，具有和贵金属类似的催化活性，能够有效地提高对H2O2的催化性能。此外，相对于过渡金属氧化物和过渡金属硫化物，TaC在酸碱环境中具有更高的稳定性。十面体的银纳米粒子相对于银纳米微球，拥有更多的催化活性位点，均匀包覆的金纳米粒子可以有效的提高银纳米粒子的稳定性。
（2）采用负载TaC和金包覆十面体银纳米粒子的石墨烯作为捕获抗体标记物，石墨烯有极高的强度和良好的导电性，具有较高的稳定性，TaC纳米薄片还原在石墨烯表面，由于TaC较高的催化活性，提高了对过氧化氢的催化作用。金包覆十面体银纳米粒子通过物理吸附作用负载在石墨烯表面，实现了电化学信号的多重放大，从而有效提高了构建的传感器的灵敏度，降低了检测限；
（3）一种基于负载TaC和金包覆十面体银纳米粒子的石墨烯的免疫传感器对肿瘤标志物CA199的检测，其线性范围0.5 pg ~ 40 ng/mL，检测限最低0.16 pg/mL，对肿瘤标志物CA125的检测，其线性范围0.5 pg ~ 35 ng/mL，检测限最低0.16 pg/mL表明一种基于负载TaC和金包覆十面体银纳米粒子的石墨烯的免疫传感器可以达到准确测定的目的。
具体实施方式
现将本发明通过具体实施方式进一步说明，但不限于此
实施例1一种基于负载TaC和金包覆十面体银纳米粒子的石墨烯的免疫传感器的制备方法，步骤如下：
（1）将直径为3 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；
（2）将上述电极置于质量分数为0.8%的HAuCl4溶液中，在-0.2V下扫描30s,在电极表面形成电沉积金基底，用超纯水冲洗，晾干；
（3）继续将6 µL、10 µg/mL的肿瘤标志物捕获抗体滴加到电极表面，超纯水冲洗，4℃冰箱中干燥；
（4）继续将3 µL、1.0 mg/mL的牛血清白蛋白溶液滴加到电极表面，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
（5）滴加6 µL、0.0005 ~ 40 ng/mL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原溶液，超纯水冲洗电极表面，4℃冰箱中干燥；
（6）将6 µL、3 mg/mL的负载TaC和金包覆十面体银纳米粒子的石墨烯的检测抗体孵化物溶液，滴涂于电极表面上，置于4℃冰箱中晾干，制得一种基于负载TaC和金包覆十面体银纳米粒子的石墨烯的免疫传感器。
实施例2一种基于负载TaC和金包覆十面体银纳米粒子的石墨烯的免疫传感器的制备方法，步骤如下：
（1）将直径为3 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；
（2）将上述电极置于质量分数为0.9%的HAuCl4溶液中，在-0.2V下扫描30s,在电极表面形成电沉积金基底，用超纯水冲洗，晾干；
（3）继续将6 µL、12 µg/mL的肿瘤标志物捕获抗体滴加到电极表面，超纯水冲洗，4℃冰箱中干燥；
（4）继续将3 µL、2.0 mg/mL的牛血清白蛋白溶液滴加到电极表面，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
（5）滴加6 µL、0.0005 ~ 40 ng/mL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原溶液，超纯水冲洗电极表面，4℃冰箱中干燥；
（6）将6 µL、4 mg/mL的负载TaC和金包覆十面体银纳米粒子的石墨烯的检测抗体孵化物溶液，滴涂于电极表面上，置于4℃冰箱中晾干，制得一种基于负载TaC和金包覆十面体银纳米粒子的石墨烯的免疫传感器。
实施例3一种基于负载TaC和金包覆十面体银纳米粒子的石墨烯的免疫传感器的制备方法，步骤如下：
（1）将直径为3 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；
（2）将上述电极置于质量分数为1.0%的HAuCl4溶液中，在-0.2V下扫描30s,在电极表面形成电沉积金基底，用超纯水冲洗，晾干；
（3）继续将6 µL、15 µg/mL的肿瘤标志物捕获抗体滴加到电极表面，超纯水冲洗，4℃冰箱中干燥；
（4）继续将3 µL、3.0 mg/mL的牛血清白蛋白溶液滴加到电极表面，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
（5）滴加6 µL、0.0005 ~ 40 ng/mL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原溶液，超纯水冲洗电极表面，4℃冰箱中干燥；
（6）将6 µL、5 mg/mL的负载TaC和金包覆十面体银纳米粒子的石墨烯的检测抗体孵化物溶液，滴涂于电极表面上，置于4℃冰箱中晾干，制得一种基于负载TaC和金包覆十面体银纳米粒子的石墨烯的免疫传感器。
实施例4所述金包覆十面体银纳米粒子的制备，步骤如下：
（1）十面体银纳米粒子溶液的制备
取13 mL的超纯水加入到20 mL的烧杯中，依次缓慢加入0.05 mol/L 、0.5 mL柠檬酸钠，0.05 mol/L、22.5 µL聚对苯乙烯磺酸钠，0.05 mol/L、50µL精氨酸，0.05 mol/L、0.4mL硝酸银，新配制的0.1mol/L 、0.1 mL硼氢化钠，溶液由淡黄色变为亮黄色；600rpm条件下持续搅拌45 min，加入0.2 mL、30% H2O2，继续搅拌30 min，生成的溶液置于蓝色的LED灯光下13 h，制得十面体银纳米粒子的溶液，置于4℃冰箱中保存，备用；
（2）金包覆十面体银纳米粒子的制备
将新配置的质量分数为0.1%、1.0 mL氯金酸水溶液缓慢加入到3.0 mL的十面体银纳米粒子的溶液中，震荡至溶液由黄色变为酒红色，制得金包覆十面体银纳米粒子的溶液。
实施例5所述金包覆十面体银纳米粒子的制备，步骤如下：
（1）十面体银纳米粒子溶液的制备
取14 mL的超纯水加入到20 mL的烧杯中，依次缓慢加入0.05 mol/L 、0.5 mL柠檬酸钠，0.05 mol/L、22.5 µL聚对苯乙烯磺酸钠，0.05 mol/L、50µL精氨酸，0.05 mol/L、0.4mL硝酸银，新配制的0.1mol/L 、0.2 mL硼氢化钠，溶液由淡黄色变为亮黄色；600rpm条件下持续搅拌45 min，加入0.3 mL、30% H2O2，继续搅拌30 min，生成的溶液置于蓝色的LED灯光下14 h，制得十面体银纳米粒子的溶液，置于4℃冰箱中保存，备用；
（2）金包覆十面体银纳米粒子的制备
将新配置的质量分数为0.1%、1.5 mL氯金酸水溶液缓慢加入到3.0 mL的十面体银纳米粒子的溶液中，震荡至溶液由黄色变为酒红色，制得金包覆十面体银纳米粒子的溶液。
实施例6所述金包覆十面体银纳米粒子的制备，步骤如下：
（1）十面体银纳米粒子溶液的制备
取15 mL的超纯水加入到20 mL的烧杯中，依次缓慢加入0.05 mol/L 、0.5 mL柠檬酸钠，0.05 mol/L、22.5 µL聚对苯乙烯磺酸钠，0.05 mol/L、50µL精氨酸，0.05 mol/L、0.4mL硝酸银，新配制的0.1mol/L 、0.3 mL硼氢化钠，溶液由淡黄色变为亮黄色；600rpm条件下持续搅拌45 min，加入0.4 mL、30% H2O2，继续搅拌30 min，生成的溶液置于蓝色的LED灯光下15 h，制得十面体银纳米粒子的溶液，置于4℃冰箱中保存，备用；
（2）金包覆十面体银纳米粒子的制备
将新配置的质量分数为0.1%、2.0 mL氯金酸水溶液缓慢加入到3.0 mL的十面体银纳米粒子的溶液中，震荡至溶液由黄色变为酒红色，制得金包覆十面体银纳米粒子的溶液。
实施例7所述负载TaC和金包覆十面体银纳米粒子的石墨烯的检测抗体孵化物溶液的制备，步骤如下：
（1）负载TaC的石墨烯的制备
①石墨烯的制备
在冰水浴和搅拌条件下，将2.0 g天然石墨粉缓缓地加入到45 mL浓硫酸中，持续搅拌15 min；边搅拌边依次加入10.0 g KMnO4 和 5.0 g NaNO3，保持溶液温度低于20℃，搅拌10 min，再升温至40℃，持续搅拌30 min，加入50 mL的超纯水，将溶液置于油浴锅中，95℃下加热30 min；将200mL的超纯水和10 mL、30% 的H2O2加入到上述溶液中，反应至溶液由黑褐色变为黄色，分别用1 mol/ L HCl和超纯水洗涤三次；65℃真空干燥12 h备用；
②负载TaC的石墨烯的制备
将上述制备的0.1 g石墨烯分散在200 mL的超纯水中，超声2 h，加入0.05g K2TaF7继续超声30 min，将混合液置于油浴锅中， 90℃下搅拌，蒸发掉大部分的水，直至变为凝胶状；将凝胶状液体置于表面皿中，在0℃下冷冻干燥12 h，得到疏松多孔海绵状固体产物，将所得固体在氩气保护、1200℃下煅烧2 h，得到负载TaC的石墨烯；
（2）负载TaC和金包覆十面体银纳米粒子的石墨烯的制备
取5 mg 负载TaC的石墨烯加入到3.0 mL 金包覆十面体银纳米粒子的溶液中，超声30 min，形成负载TaC和金包覆十面体银纳米粒子的石墨烯溶液，离心；分别用无水乙醇及超纯水洗涤三次、30℃真空干燥24 h，得到负载TaC和金包覆十面体银纳米粒子的石墨烯固体粉末；
（3）负载TaC和金包覆十面体银纳米粒子的石墨烯的检测抗体孵化物溶液的制备
将6 mg的负载TaC和金包覆十面体银纳米粒子的石墨烯固体粉末溶于1 mL的pH7.4的磷酸盐缓冲溶液中，震荡溶解，再加入100 μL、80 μg/mL的肿瘤标志物检测抗体溶液和900 μL、50 mmol/L的pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液，4℃恒温振荡培养箱中振荡，孵化12 h，制得负载TaC和金包覆十面体银纳米粒子的石墨烯的检测抗体孵化物溶液，4℃下保存备用。
实施例8所述负载TaC和金包覆十面体银纳米粒子的石墨烯的检测抗体孵化物溶液的制备，步骤如下：
（1）负载TaC的石墨烯的制备
①石墨烯的制备
在冰水浴和搅拌条件下，将2.5 g天然石墨粉缓缓地加入到55 mL浓硫酸中，持续搅拌20 min；边搅拌边依次加入12.5 g KMnO4 和 6.0 g NaNO3，保持溶液温度低于20℃，搅拌13 min，再升温至40℃，持续搅拌35 min，加入65 mL的超纯水，将溶液置于油浴锅中，95℃下加热35 min；将200mL的超纯水和12.5 mL、30% 的H2O2加入到上述溶液中，反应至溶液由黑褐色变为黄色，分别用1 mol/ L HCl和超纯水洗涤三次；65℃真空干燥12h备用；
②负载TaC的石墨烯的制备
将上述制备的0.15 g石墨烯分散在200 mL的超纯水中，超声2 h，加入0.075 gK2TaF7继续超声40 min，将混合液置于油浴锅中， 90℃下搅拌，蒸发掉大部分的水，直至变为凝胶状；将凝胶状液体置于表面皿中，在0℃下冷冻干燥14 h，得到疏松多孔海绵状固体产物，将所得固体在氩气保护、1200℃下煅烧2 h，得到负载TaC的石墨烯；
（2）负载TaC和金包覆十面体银纳米粒子的石墨烯的制备
取6 mg 负载TaC的石墨烯加入到3.0 mL 金包覆十面体银纳米粒子的溶液中，超声30 min，形成负载TaC和金包覆十面体银纳米粒子的石墨烯溶液，离心；分别用无水乙醇及超纯水洗涤三次、30℃真空干燥24 h，得到负载TaC和金包覆十面体银纳米粒子的石墨烯固体粉末；
（3）负载TaC和金包覆十面体银纳米粒子的石墨烯的检测抗体孵化物溶液的制备
将8 mg的负载TaC和金包覆十面体银纳米粒子的石墨烯固体粉末溶于1 mL的pH7.4的磷酸盐缓冲溶液中，震荡溶解，再加入100 μL、100 μg/mL的肿瘤标志物检测抗体溶液和900 μL、50 mmol/L的pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液，4℃恒温振荡培养箱中振荡，孵化12 h，制得负载TaC和金包覆十面体银纳米粒子的石墨烯的检测抗体孵化物溶液，4℃下保存备用。
实施例9所述负载TaC和金包覆十面体银纳米粒子的石墨烯的检测抗体孵化物溶液的制备，步骤如下：
（1）负载TaC的石墨烯的制备
①石墨烯的制备
在冰水浴和搅拌条件下，将3.0 g天然石墨粉缓缓地加入到60 mL浓硫酸中，持续搅拌25 min；边搅拌边依次加入15.0g KMnO4 和 7.5 g NaNO3，保持溶液温度低于20℃，搅拌15 min，再升温至40℃，持续搅拌40 min，加入75mL的超纯水，将溶液置于油浴锅中，95℃下加热40 min；将200mL的超纯水和15 mL、30% 的H2O2加入到上述溶液中，反应至溶液由黑褐色变为黄色，分别用1 mol/ L HCl和超纯水洗涤三次；65℃真空干燥12 h备用；
②负载TaC的石墨烯的制备
将上述制备的0.2 g石墨烯分散在200 mL的超纯水中，超声2 h，加入0.1 g K2TaF7继续超声50 min，将混合液置于油浴锅中， 90℃下搅拌，蒸发掉大部分的水，直至变为凝胶状；将凝胶状液体置于表面皿中，在0℃下冷冻干燥16 h，得到疏松多孔海绵状固体产物，将所得固体在氩气保护、1200℃下煅烧2 h，得到负载TaC的石墨烯；
（2）负载TaC和金包覆十面体银纳米粒子的石墨烯的制备
取7 mg 负载TaC的石墨烯加入到3.0 mL 金包覆十面体银纳米粒子的溶液中，超声30min，形成负载TaC和金包覆十面体银纳米粒子的石墨烯溶液，离心；分别用无水乙醇及超纯水洗涤三次、30℃真空干燥24h，得到负载TaC和金包覆十面体银纳米粒子的石墨烯固体粉末；
（3）负载TaC和金包覆十面体银纳米粒子的石墨烯的检测抗体孵化物溶液的制备
将10 mg的负载TaC和金包覆十面体银纳米粒子的石墨烯固体粉末溶于1 mL的pH7.4的磷酸盐缓冲溶液中，震荡溶解，再加入100 μL、120 μg/mL的肿瘤标志物检测抗体溶液和900 μL、50 mmol/L的pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液，4℃恒温振荡培养箱中振荡，孵化12 h，制得负载TaC和金包覆十面体银纳米粒子的石墨烯的检测抗体孵化物溶液，4℃下保存备用。
实施例10 肿瘤标志物CA199的检测
1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10 mL、50 mmol/L的pH 5.0 ~ 8.0磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
（2）用时间-电流法对分析物进行检测，输入电压为-0.4 V，取样间隔 0.1 s，运行时间400 s；
（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50 s向10 mL、50 mmol/L的pH7.4的磷酸盐缓冲溶液中注入10 μL、5 mol/L的双氧水溶液，记录电流变化；
（4）根据所得电流与CA199浓度之间的线性关系，绘制工作曲线，测得线性范围为0.5pg ~ 40 ng/mL，检测限最低0.16 pg/mL。
实施例11肿瘤标志物CA125的检测
按照实施例10的方法对样品中CA125进行检测，其线性范围为0.5 pg ~ 35 ng/mL，检测限为0.16 pg/mL。
Claims (4)
1.一种基于负载碳化钽和金包覆十面体银纳米粒子的石墨烯的免疫传感器的制备方法，其特征在于，步骤如下：
（1）将直径为3 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；
（2）将上述电极置于质量分数为0.8% ~ 1.0%的HAuCl4溶液中，在-0.2V下扫描30s,在电极表面形成电沉积金基底，用超纯水冲洗，晾干；
（3）继续将6 µL、10 ~ 15 µg/mL的肿瘤标志物捕获抗体滴加到电极表面，超纯水冲洗，4℃冰箱中干燥；
（4）继续将3 µL、1.0 ~ 3.0 mg/mL的牛血清白蛋白溶液滴加到电极表面，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
（5）滴加6 µL、0.0005 ~ 40 ng/mL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原溶液，超纯水冲洗电极表面，4℃冰箱中干燥；
（6）将6 µL、3 ~ 5mg/mL的负载碳化钽和金包覆十面体银纳米粒子的石墨烯的检测抗体孵化物溶液，滴涂于电极表面上，置于4℃冰箱中晾干，制得一种基于负载碳化钽和金包覆十面体银纳米粒子的石墨烯的免疫传感器；
所述负载碳化钽和金包覆十面体银纳米粒子的石墨烯的检测抗体孵化物溶液的制备，步骤如下：
（1）负载碳化钽的石墨烯的制备
①石墨烯的制备
在冰水浴和搅拌条件下，将2.0 ~ 3.0g天然石墨粉缓缓地加入到45 ~ 60 mL浓硫酸中，持续搅拌15 ~ 25 min；边搅拌边依次加入10.0 ~ 15.0 g KMnO4 和 5.0 ~ 7.5 gNaNO3，保持溶液温度低于20℃，搅拌10 ~ 15 min，再升温至40℃，持续搅拌30 ~ 40 min，加入50 ~ 75 mL的超纯水，将溶液置于油浴锅中，95℃下加热30 ~ 40 min；将200mL的超纯水和10 ~ 15 mL、30% 的H2O2加入到上述溶液中，反应至溶液由黑褐色变为黄色，分别用1mol/ L HCl和超纯水洗涤三次；65℃真空干燥12 h备用；
②负载碳化钽的石墨烯的制备
将上述制备的0.1 ~ 0.2 g石墨烯分散在200 mL的超纯水中，超声2 h，加入0.05 ~0.1 g K2TaF7继续超声30 ~ 50 min，将混合液置于油浴锅中， 90℃下搅拌，蒸发掉大部分的水，直至变为凝胶状；将凝胶状液体置于表面皿中，在0℃下冷冻干燥12~ 16 h，得到疏松多孔海绵状固体产物，将所得固体在氩气保护、1200℃下煅烧2h，得到负载碳化钽的石墨烯；
（2）负载碳化钽和金包覆十面体银纳米粒子的石墨烯的制备
取5~ 7 mg 负载碳化钽的石墨烯加入到3.0 mL 金包覆十面体银纳米粒子的溶液中，超声30 min，形成负载碳化钽和金包覆十面体银纳米粒子的石墨烯溶液，离心；分别用无水乙醇及超纯水洗涤三次、30℃真空干燥24 h，得到负载碳化钽和金包覆十面体银纳米粒子的石墨烯固体粉末；
（3）负载碳化钽和金包覆十面体银纳米粒子的石墨烯的检测抗体孵化物溶液的制备
将6 ~ 10 mg的负载碳化钽和金包覆十面体银纳米粒子的石墨烯固体粉末溶于1 mL的pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中，震荡溶解，再加入100 μL、80 ~ 120 μg/mL的肿瘤标志物检测抗体溶液和900 μL、50 mmol/L的pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液，4℃恒温振荡培养箱中振荡，孵化12 h，制得负载碳化钽和金包覆十面体银纳米粒子的石墨烯的检测抗体孵化物溶液，4℃下保存备用。
2.如权利要求1所述的一种基于负载碳化钽和金包覆十面体银纳米粒子的石墨烯的免疫传感器的制备方法，所述金包覆十面体银纳米粒子的制备，步骤如下：
（1）十面体银纳米粒子溶液的制备
取13 ~ 15 mL的超纯水加入到20 mL的烧杯中，依次缓慢加入0.05 mol/L 、0.5 mL柠檬酸钠，0.05 mol/L、22.5 µL聚对苯乙烯磺酸钠，0.05 mol/L、50µL精氨酸，0.05 mol/L、0.4mL硝酸银，新配制的0.1mol/L 、0.1 ~ 0.3 mL硼氢化钠，溶液由淡黄色变为亮黄色；600rpm条件下持续搅拌45 min，加入0.2 ~ 0.4 mL、30% H2O2，继续搅拌30 min，生成的溶液置于蓝色的LED灯光下13 ~ 15 h，制得十面体银纳米粒子的溶液，置于4℃冰箱中保存，备用；
（2）金包覆十面体银纳米粒子的制备
将新配置的质量分数为0.1%、1.0 ~ 2.0 mL氯金酸水溶液缓慢加入到3.0 mL的十面体银纳米粒子的溶液中，震荡至溶液由黄色变为酒红色，制得金包覆十面体银纳米粒子的溶液。
3.如权利要求1-2任意一项所述的一种基于负载碳化钽和金包覆十面体银纳米粒子的石墨烯的免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述肿瘤标志物选自下列之一： CA199、CA125。
4.如权利要求1所述的制备方法制备的一种基于负载碳化钽和金包覆十面体银纳米粒子的石墨烯的免疫传感器，用于肿瘤标志物的检测，检测步骤如下：
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10 mL、50 mmol/L的pH 5.0 ~ 8.0磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
（2）用时间-电流法对分析物进行检测，输入电压为-0.4 V，取样间隔 0.1 s，运行时间400 s；
（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50 s向10 mL、50 mmol/L的pH7.4的磷酸盐缓冲溶液中注入10 μL、5 mol/L的双氧水溶液，记录电流变化。
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