CN109738496B - 一种用于检测单核细胞趋化蛋白-1新型电化学生物传感器制备方法 - Google Patents
一种用于检测单核细胞趋化蛋白-1新型电化学生物传感器制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109738496B CN109738496B CN201910060618.XA CN201910060618A CN109738496B CN 109738496 B CN109738496 B CN 109738496B CN 201910060618 A CN201910060618 A CN 201910060618A CN 109738496 B CN109738496 B CN 109738496B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- electrode
- solution
- ultrapure water
- monocyte chemotactic
- chemotactic protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 101710155857 C-C motif chemokine 2 Proteins 0.000 title claims abstract description 37
- 102000000018 Chemokine CCL2 Human genes 0.000 title claims abstract description 37
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 11
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims abstract description 23
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims abstract description 19
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 16
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 15
- 239000002131 composite material Substances 0.000 claims abstract description 15
- 229910021389 graphene Inorganic materials 0.000 claims abstract description 15
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims abstract description 12
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims abstract description 11
- KJTLSVCANCCWHF-UHFFFAOYSA-N Ruthenium Chemical compound [Ru] KJTLSVCANCCWHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 229910052707 ruthenium Inorganic materials 0.000 claims abstract description 8
- JRTYPQGPARWINR-UHFFFAOYSA-N palladium platinum Chemical compound [Pd].[Pt] JRTYPQGPARWINR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M thionine Chemical compound [Cl-].C1=CC(N)=CC2=[S+]C3=CC(N)=CC=C3N=C21 ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 3
- FAGUFWYHJQFNRV-UHFFFAOYSA-N tetraethylenepentamine Chemical compound NCCNCCNCCNCCN FAGUFWYHJQFNRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract 3
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 claims description 25
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 claims description 25
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 22
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 14
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 13
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 9
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 9
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 8
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 6
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 6
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 claims description 3
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 238000005498 polishing Methods 0.000 claims description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 3
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 claims description 3
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 claims description 3
- 229910019891 RuCl3 Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 2
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 2
- 229920001992 poloxamer 407 Polymers 0.000 claims description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 claims 2
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 claims 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 claims 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 claims 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 claims 1
- 230000003399 chemotactic effect Effects 0.000 claims 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims 1
- 239000002114 nanocomposite Substances 0.000 abstract description 10
- 125000001894 2,4,6-trinitrophenyl group Chemical group [H]C1=C(C(*)=C(C([H])=C1[N+]([O-])=O)[N+]([O-])=O)[N+]([O-])=O 0.000 abstract description 6
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 abstract description 5
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 abstract description 4
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 abstract description 2
- 239000012620 biological material Substances 0.000 abstract description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 abstract description 2
- 230000027756 respiratory electron transport chain Effects 0.000 abstract description 2
- 229910003771 Gold(I) chloride Inorganic materials 0.000 abstract 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 abstract 1
- 230000000274 adsorptive effect Effects 0.000 abstract 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 abstract 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- FDWREHZXQUYJFJ-UHFFFAOYSA-M gold monochloride Chemical compound [Cl-].[Au+] FDWREHZXQUYJFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 abstract 1
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 abstract 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 description 3
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Substances [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 229910004042 HAuCl4 Inorganic materials 0.000 description 2
- KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N Palladium Chemical compound [Pd] KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003143 atherosclerotic effect Effects 0.000 description 2
- 238000005034 decoration Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 2
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 2
- 206010002388 Angina unstable Diseases 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 229910021126 PdPt Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000007814 Unstable Angina Diseases 0.000 description 1
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000003575 carbonaceous material Substances 0.000 description 1
- 230000007211 cardiovascular event Effects 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000008358 core component Substances 0.000 description 1
- 229910052593 corundum Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000000835 electrochemical detection Methods 0.000 description 1
- 229910021397 glassy carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003365 immunocytochemistry Methods 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 201000004332 intermediate coronary syndrome Diseases 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 238000002715 modification method Methods 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 239000011943 nanocatalyst Substances 0.000 description 1
- 229910052763 palladium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000012207 quantitative assay Methods 0.000 description 1
- 230000002468 redox effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 208000037803 restenosis Diseases 0.000 description 1
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 229910001845 yogo sapphire Inorganic materials 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本发明成功开发了基于新型还原性氧化石墨烯四乙烯五胺‑硫堇‑金纳米粒子(rGO‑TEPA‑Thi‑Au)复合材料和钌钯铂三金属纳米粒子(RuPdPt TNPs)的特异性超敏夹心电化学免疫传感器，用于检测人血清中的单核细胞趋化蛋白‑1(MCP‑1)。还原性氧化石墨烯四乙烯五胺(rGO‑TEPA)含有大量氨基并显着加速电子转移，硫堇(Thi)分子增加了对带负电荷的AuCl4 ‑离子的吸附能力，纳米复合材料中的金纳米颗粒(AuNPs)可以提供用于固定生物材料的活性位点。此外，RuPdPt TNPs对H2O2的还原具有优异的催化性能，并且Pt‑NH2可有效捕获抗体。本发明的优点在于线性范围宽。灵敏度高，特异性强，检测迅速，以及良好的可重复使用性，并且该发明可用于测量人血清中MCP‑1含量，有在临床检测中有着巨大潜力。
Description
技术领域：
本发明涉及一种在临床上定量检测单核细胞趋化蛋白-1的电化学免疫传感器的制备方法及应用，尤其是基于还原性氧化石墨烯四乙烯五胺-硫堇-金纳米粒子复合材料及三金属钌钯铂纳米复合材料作为信号探针制备的生物传感器，用于检测单核细胞趋化蛋白-1，属于电化学检测领域。
背景技术：
心血管疾病是发达国家最常见的死亡原因而其中动脉粥样硬化又是心血管疾病的主要原因。单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)是半胱氨酸-半胱氨酸家族的成员，也称为半胱氨酸-半胱氨酸趋化因子配体2，其与心血管疾病的发病机理密切相关。人血清中MCP-1水平升高可导致一些动脉粥样硬化疾病的产生，如不稳定性心绞痛，心肌梗塞和支架内再狭窄等。因此，测定血清中的MCP-1对于动脉粥样硬化疾病的诊断和预测具有重要意义。
传统确定MCP-1浓度的方法包括有酶联免疫吸附测定(ELISA)，免疫组织化学，蛋白质印迹和免疫细胞化学。尽管这些方法比较有效，但它们仍然存在着价格昂贵，耗时且操作复杂的缺点。因此，迫切需要一种用于敏感检测MCP-1的替代方法。MCP-1定量分析的替代方案是电化学免疫传感器，其具有优于传统检测方法的许多优点，包括操作简单，检测快速和检测成本低。然而，电化学免疫传感器仍存在缺点：电流信号太小不满足所需的灵敏度，而更高的灵敏度允许我们用更少的生物样品获得准确的结果。因此，我们倾向于建立夹心免疫传感器以提高检测灵敏度，信号放大策略是我们新的电化学免疫传感器要解决的关键问题。
纳米复合材料由于其潜在的生物测定应用而在过去几十年中被大量研究。一种新型材料，还原性氧化石墨烯-四亚乙基五胺(rGO-TEPA)，不仅具有rGO的整体性能，而且与其他碳材料相比具有许多优点，例如显著的溶解性和较大的表面积。最重要的是，rGO-TEPA含有大量氨基，可以很容易地与金属或生物材料结合形成多功能纳米复合材料。为了将抗体固定在基于rGO-TEPA的电活性纳米复合材料上，我们直接一步通过硫堇(Thi)和rGO-TEPA的协同作用与HAuCl4结合，在室温下合成rGO-TEPA-Thi-Au纳米复合材料。其中带正电荷的Thi分子增加了带负电荷的AuCl4 -离子的吸附能力，吸附在纳米复合材料上的Thi分子仍然保持其电活性氧化还原性质。此外，纳米复合材料中的AuNPs可以提供活性位点以固定生物分子以制备免疫传感器。最后，该纳米复合材料可以容易地在玻碳电极(GCE)上形成具有优异导电性的稳定膜。用这种纳米复合材料改性的电极具有更好的导电性，从而实现初步的信号放大。
新信号材料的开发是电化学免疫传感器信号放大的核心组成部分。最近，三金属纳米催化材料比单金属和双金属对应材料引起了更多的关注。与双金属和单金属催化材料相比，三金属纳米材料具有更好的性能，如化学稳定性，高表面积和快速电子转移。这些特性是由于复合材料的几何和电子效应的结合而产生的。这两种效应同时存在并对三金属催化剂中的催化活性产生协同效应，这对于电分析应用是重要的。这里，我们首次合成的钌钯铂三金属纳米粒子(RuPdPt TNPs)是用于检测MCP-1的理想信号放大标记。主要原因如下：首先，RuPdPt TNPs具有表面积大，粒径均匀，导电性好的特点。其次，在该课题的研究中，与传统纳米材料如Pt纳米粒子和PdPt双金属纳米粒子相比，RuPdPt TNPs具有很强的催化活性。最后，该材料能够通过Pt-NH2键大量固定生物分子。总之，通过RuPdPt TNP催化H2O2可以极大地放大信号。
该项目建立了一个简单、快速的检测方法实现了对MCP-1的特异、超灵敏检测。为心血管疾病患者早期检测和风险预测提供依据。
发明内容：
1.本发明的目的是用于检测核细胞趋化蛋白-1的电化学免疫传感器的制备方法与应用，为临床上心血管疾病患者早期检测和风险预测提供依据，其特征包括以下步骤：
(1)还原性氧化石墨烯四乙烯五胺-硫堇-金纳米粒子(rGO-TEPA-Thi-Au)复合材料的制备和信号探针的制备；
(2)建立电化学免疫传感器，检测单核细胞趋化蛋白-1，绘制标准曲线。
2.本发明所述还原性氧化石墨烯四乙烯五胺-硫堇-金纳米粒子(rGO-TEPA-Thi-Au)复合材料的制备和信号探针的制备过程具体包括以下步骤，其特征包括以下步骤：
(1)rGO-TEPA-Thi-Au复合材料的制备：
首先将3mL rGO-TEPA溶液(1mg mL-1)超声处理至少30分钟。然后，将3mL Thi(0.5mM)和25μL 1％HAuCl4溶液加入到上述rGO-TEPA溶液中并在室温中剧烈搅拌12小时。随后在9000rpm下离心15分钟收集所得物并用超纯水离心洗涤三次。将离心收集的产物溶入到1mL超纯水中并在4℃冰箱储存。
(2)钌钯铂三金属纳米粒子(RuPdPt TNPs)的制备：
将含有17.5mM K2PtCl4，2.5mM Na2PdCl4，1.25mM RuCl3和20mg Pluronic F-127的分散在2mL的水溶液中，然后在搅拌的条件下快速加入2mL 0.1M AA。将混合溶液后在室温下搅拌120分钟后用超纯水离心清洗循环三次。将离心收集的产物冷冻干燥后在4℃冰箱储存。
(3)信号探针的制备：
将单核趋化蛋白-1第二抗体溶解于PBS(pH＝7.4，10mL)中，得到单核趋化蛋白-1第二抗体原液(10μg mL-1)。取50μL单核趋化蛋白-1第二抗体原液溶液加入到RuPdPt TNP(4.0mg mL-1，1.0mL)中，溶解并在4℃下振荡12小时。接下来，将100μL BSA(0.25％，w/v)加入上述溶液中以封闭活性位点。随后，将所得溶液离心，彻底洗涤以除去未结合的抗体，再分散于1mL超纯水中得到信号探针，然后在4℃下储存以供进一步使用。
3.根据权利要求1所述的建立电化学免疫传感器，检测单核细胞趋化蛋白-1，绘制标准曲线，其特征在于包括以下步骤：
(1)分别用0.3和0.05μm的Al2O3粉末将电极抛光成镜面，然后分别按超纯水、无水乙醇、超纯水的顺序超声电极各5min，室温干燥备用；
(2)将10μL电极修饰材料还原性氧化石墨烯四乙烯五胺-硫堇-金纳米粒子(rGO-TEPA-Thi-Au)复合材料滴加在电极表面，在室温条件下干燥。
(3)将10μL的单核趋化蛋白-1第一抗体溶液(10μg mL-1)结合到干燥的电极表面(37℃，2.5h)
(4)用超纯水将孵育后的电极冲洗干净后滴加10μL，0.25％的BSA溶液37℃下孵育30min。
(5)用超纯水将电极冲洗干净后将不同浓度的单核趋化蛋白-1抗原滴加在电极上并置于37℃孵育2h。
(6)在干燥后的电极上滴加10μL信号探针混合液置于37℃孵育1h。
(7)将孵育后的电极用超纯水冲洗干净后置于室温条件干燥。
(8)将电极置于5mL，0.1M PBS(0.1M Na2HPO4，0.1M KH2PO4，0.1M KCl)中进行表征，每隔20s加入20μL，2.4mM H2O2，测量其计时电流变化电流值。
(9)根据所得电流变化值与单核趋化蛋白-1抗原浓度呈线性关系，绘制工作曲线。
与现有技术相比，本发明的一种定量检测MCP-1的电化学免疫传感器的制备方法与应用，其突出的特点是：
(1)将基于还原性氧化石墨烯四乙烯五胺-硫堇-金纳米粒子复合材料作为电极修饰材料，将基于钌钯铂三金属纳米粒子作为信号探针，不仅有效的提高了材料的催化性能，而且提高了生物分子的固载量，进而提高了电化学免疫传感器的灵敏度和检测范围；
(2)本方法制备的电化学免疫传感器可为临床早期诊断心血管疾病患者提供依据，并且也可以用于预测心血管事件发生的风险。另外，此方法简便，快速，便于实现商品化，从而推进精准医学的发展。
(3)使用完全相同的纳米材料和修饰方法，可以在电极表面固载不同的抗体，从而实现对多种生物分子的同时检测，为疾病的诊断提供更加全面的依据。
附图说明：
图1为本发明的电化学免疫传感器的构建示意图。
图2为本发明的还原性氧化石墨烯四乙烯五胺-硫堇-金纳米粒子复合材料的电镜图和钌钯铂三金属纳米粒子电镜图，XPS图和EDS图。
图3为本发明的电化学免疫传感器在检测MCP-1时得到的计时电流变化电流与浓度的线性关系，以及传感器的特异性和稳定性。
具体实施方式：
下面结合具体实施例对本发明进行进一步阐述，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1
步骤1.首先将3mL rGO-TEPA溶液(1mg mL-1)超声处理至少30分钟。然后，将3mLThi(0.5mM)和25μL 1％HAuCl4溶液加入到上述rGO-TEPA溶液中并在室温中剧烈搅拌12小时。随后在9000rpm下离心15分钟收集所得物并用超纯水离心洗涤三次。将离心收集的产物溶入到1mL超纯水中并在4℃冰箱储存。
步骤2.分别用0.3和0.05μm的Al2O3粉末将电极抛光成镜面，然后分别按超纯水、无水乙醇、超纯水的顺序超声电极各5min，室温干燥备用；
步骤3.将10μL电极修饰材料还原性氧化石墨烯四乙烯五胺-硫堇-金纳米粒子(rGO-TEPA-Thi-Au)复合材料滴加在电极表面，在室温条件下干燥。
步骤4.将10μL的单核趋化蛋白-1第一抗体溶液(10μg mL-1)结合到干燥的电极表面(37℃，2.5h)
步骤5.用超纯水将孵育后的电极冲洗干净后滴加10μL，0.25％的BSA溶液37℃下孵育30min。
步骤6.用超纯水将电极冲洗干净后将不同浓度的单核趋化蛋白-1抗原滴加在电极上并置于37℃孵育2h。
步骤7.在干燥后的电极上滴加10μL信号探针混合液置于37℃孵育1h。
步骤8.将孵育后的电极用超纯水冲洗干净后置于室温条件干燥。
步骤9.将电极置于5mL，0.1M PBS(0.1M Na2HPO4，0.1M KH2PO4，0.1M KCl)中进行表征，每隔50s加入20μL，1.4mM H2O2，测量其计时电流变化电流值；
步骤10.根据所得电流变化值与单核趋化蛋白-1抗原浓度呈线性关系，绘制工作曲线；测定结果表明MCP-1浓度在20fg mL-1-1000pg mL-1范围内成线性关系，线性相关系数为0.99673，检测限为8.9fg mL-1。
步骤11.将本发明上述传感器于4℃保存，间断检测传感器电流响应，储存21天后电流响应仍为初始电流的85.2％，表示传感器具有良好的稳定性；
步骤12.本发明取同一批次制备的免疫传感器5支，在相同条件下对20pg mL-1的MCP-1分别进行测定，每一支电极测定3次，传感器重现性良好。
步骤13.将本发明上述传感器在血液中其他生物分子存在的条件下检测MCP-1，结果其他生物分子的存在不影响MCP-1电流的改变，说明传感器的特异性好，可以很好区分目标检测物。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提条件下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (2)
1.一种基于还原性氧化石墨烯四乙烯五胺-硫堇-金纳米粒子复合材料和钌钯铂三金属纳米粒子信号探针所构建的新型电化学生物传感器的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)还原性氧化石墨烯四乙烯五胺-硫堇-金纳米粒子复合材料的制备：
首先将3mL 1mg mL-1的还原性氧化石墨烯四乙烯五胺溶液超声处理至少30分钟；然后，将3mL 0.5mM的硫堇和25μL 1％HAuCl4溶液加入到上述还原性氧化石墨烯四乙烯五胺溶液中并在室温中剧烈搅拌12小时；随后在9000rpm下离心15分钟收集所得物并用超纯水离心洗涤三次；将离心收集的产物溶入到1mL超纯水中并在4℃冰箱储存；
(2)钌钯铂三金属纳米粒子信号探针的制备：
将17.5mM K2PtCl4，2.5mM Na2PdCl4，1.25mM RuCl3和20mg Pluronic F-127分散在2mL的水溶液中，然后在搅拌的条件下快速加入2mL 0.1M抗坏血酸；将溶液混合后，在室温下搅拌120分钟后用超纯水离心清洗循环三次，将离心收集的钌钯铂三金属纳米粒子冷冻干燥后在4℃冰箱储存；然后，将单核趋化蛋白-1第二抗体溶解于pH＝7.4,10mL的PBS中，得到10μg mL-1的单核趋化蛋白-1第二抗体原液；取50μL单核趋化蛋白-1第二抗体原液溶液加入到4.0mg mL-1,1.0mL的钌钯铂三金属纳米粒子溶液中，溶解并在4℃下振荡12小时；接下来，将100μL 0.25wt％BSA加入上述溶液中以封闭活性位点，随后，将所得溶液离心，彻底洗涤以除去未结合的抗体，再分散于1mL超纯水中得到信号探针，然后在4℃下储存以供进一步使用；
(3)采用上述复合材料和信号探针构筑所述的电化学生物传感器。
2.根据权利要求1所述的制备方法得到的电化学生物传感器，用于单核细胞趋化蛋白-1的检测，其特征在于所述检测步骤如下：
(1)分别用0.3和0.05μm的Al2O3粉末将电极抛光成镜面，然后分别按超纯水、无水乙醇、超纯水的顺序超声电极各5min，室温干燥备用；
(2)将10μL电极修饰材料还原性氧化石墨烯四乙烯五胺-硫堇-金纳米粒子复合材料滴加在电极表面，在室温条件下干燥；
(3)在37℃下，将10μL 10μg mL-1的单核趋化蛋白-1第一抗体溶液结合到干燥的电极表面，结合时间为2.5h；
(4)用超纯水将孵育后的电极冲洗干净后滴加10μL，0.25％的BSA溶液37℃下孵育30min；
(5)用超纯水将电极冲洗干净后将不同浓度的单核趋化蛋白-1抗原滴加在电极上并置于37℃孵育2h；
(6)在干燥后的电极上滴加10μL信号探针混合液置于37℃孵育1h；
(7)将孵育后的电极用超纯水冲洗干净后置于室温条件干燥；
(8)将电极置于5mL,用0.1M Na2HPO4,0.1M KH2PO4,0.1M KCl配置而成的0.1M PBS中进行表征,每隔20s加入20μL，2.4mM H2O2，测量其计时电流变化电流值；
(9)根据所得电流变化值与单核趋化蛋白-1抗原浓度呈线性关系，绘制工作曲线。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910060618.XA CN109738496B (zh) | 2019-01-22 | 2019-01-22 | 一种用于检测单核细胞趋化蛋白-1新型电化学生物传感器制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910060618.XA CN109738496B (zh) | 2019-01-22 | 2019-01-22 | 一种用于检测单核细胞趋化蛋白-1新型电化学生物传感器制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN109738496A CN109738496A (zh) | 2019-05-10 |
| CN109738496B true CN109738496B (zh) | 2021-06-08 |
Family
ID=66365721
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910060618.XA Expired - Fee Related CN109738496B (zh) | 2019-01-22 | 2019-01-22 | 一种用于检测单核细胞趋化蛋白-1新型电化学生物传感器制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN109738496B (zh) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110308286B (zh) * | 2019-07-24 | 2022-08-30 | 福建师范大学 | 一种基于光热释放信号增强型甲状腺球蛋白电致化学发光免疫传感器 |
| CN111398392B (zh) * | 2020-05-18 | 2022-04-26 | 河南工业大学 | 一种基于金属离子依赖性dna酶用于检测邻苯二甲酸二丁酯的电化学免疫传感器制备方法 |
| CN111751432A (zh) * | 2020-06-09 | 2020-10-09 | 山东理工大学 | 一种基于PdCuPt的电化学免疫传感器的制备 |
| CN112748166B (zh) * | 2021-01-28 | 2022-06-17 | 河南工业大学 | 一种用于硝基呋喃类代谢物残留检测的免疫型电化学传感器制备方法 |
| CN112964765B (zh) * | 2021-02-05 | 2022-12-27 | 重庆医科大学 | 一种用于检测cea的电化学免疫传感器及其制备与应用 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103908963A (zh) * | 2013-01-04 | 2014-07-09 | 吉林师范大学 | 高催化活性化学还原的石墨烯-金铂钯复合物的制备方法 |
| CN107505466A (zh) * | 2017-10-20 | 2017-12-22 | 山东理工大学 | 一种检测乙型肝炎表面抗原的电流型免疫传感器的制备方法及应用 |
| CN107621493A (zh) * | 2017-09-06 | 2018-01-23 | 重庆医科大学 | 一种用于重金属铅污染物检测的电化学传感器制备方法 |
| CN107677716A (zh) * | 2017-09-26 | 2018-02-09 | 山东理工大学 | 一种基于AuPdCu/N‑GQDs@PS的免疫传感器的制备方法及应用 |
| CN108693231A (zh) * | 2018-05-25 | 2018-10-23 | 江南大学 | 一种检测癌胚抗原的电化学生物传感器及其制备方法 |
-
2019
- 2019-01-22 CN CN201910060618.XA patent/CN109738496B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103908963A (zh) * | 2013-01-04 | 2014-07-09 | 吉林师范大学 | 高催化活性化学还原的石墨烯-金铂钯复合物的制备方法 |
| CN107621493A (zh) * | 2017-09-06 | 2018-01-23 | 重庆医科大学 | 一种用于重金属铅污染物检测的电化学传感器制备方法 |
| CN107677716A (zh) * | 2017-09-26 | 2018-02-09 | 山东理工大学 | 一种基于AuPdCu/N‑GQDs@PS的免疫传感器的制备方法及应用 |
| CN107505466A (zh) * | 2017-10-20 | 2017-12-22 | 山东理工大学 | 一种检测乙型肝炎表面抗原的电流型免疫传感器的制备方法及应用 |
| CN108693231A (zh) * | 2018-05-25 | 2018-10-23 | 江南大学 | 一种检测癌胚抗原的电化学生物传感器及其制备方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| A highly sensitive label-free electrochemical immunosensor based on AuNPs-PtNPs-MOFs for nuclear matrix protein 22 analysis in urine sample;Shuang Zhao等;《Journal of Electroanalytical Chemistry》;20181226;第834卷;第33-42页 * |
| One-stepsynthesisofgrapheneoxide–thionine–Aunanocomposites and itsapplicationforelectrochemicalimmunosensing;Jingman Han等;《Biosensors andBioelectronics》;20130322;第47卷;第243-247页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN109738496A (zh) | 2019-05-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN109738496B (zh) | 一种用于检测单核细胞趋化蛋白-1新型电化学生物传感器制备方法 | |
| CN109738495B (zh) | 基于铈金属有机框架@金纳米复合物和金铂钌纳米复合材料的三金属信号放大适配体传感器用于凝血酶敏感蛋白-1检测 | |
| Li et al. | Dual-aptamer-based voltammetric biosensor for the Mycobacterium tuberculosis antigen MPT64 by using a gold electrode modified with a peroxidase loaded composite consisting of gold nanoparticles and a Zr (IV)/terephthalate metal-organic framework | |
| CN108802133B (zh) | 一种检测胃癌肿瘤标志物夹心型免疫传感器的制备方法及应用 | |
| JP4768202B2 (ja) | コロイド金属マーカーを使用する電気化学的イムノアッセイ | |
| Qu et al. | A novel electrochemical immunosensor based on colabeled silica nanoparticles for determination of total prostate specific antigen in human serum | |
| Liu et al. | Electrochemical immunosensor for salbutamol detection based on CS-Fe3O4-PAMAM-GNPs nanocomposites and HRP-MWCNTs-Ab bioconjugates for signal amplification | |
| Guo et al. | MCM-41 mesoporous material modified carbon paste electrode for the determination of cardiac troponin I by anodic stripping voltammetry | |
| Ji et al. | Ultrasensitive sandwich-type electrochemical immunosensor based on a novel signal amplification strategy using highly loaded palladium nanoparticles/carbon decorated magnetic microspheres as signal labels | |
| CN106596942B (zh) | 一种夹心型乙型肝炎病毒标志物免疫传感器的构建方法及应用 | |
| Wang et al. | Ultrasensitive amperometric detection of the tumor biomarker cytokeratin antigen using a hydrogel composite consisting of phytic acid, Pb (II) ions and gold nanoparticles | |
| Mao et al. | A sensitive sandwich-type immunosensor for the detection of MCP-1 based on a rGO-TEPA-Thi-Au nanocomposite and novel RuPdPt trimetallic nanoalloy particles | |
| Liu et al. | A novel strategy of procalcitonin detection based on multi-nanomaterials of single-walled carbon nanohorns–hollow Pt nanospheres/PAMAM as signal tags | |
| Kuntamung et al. | A label-free immunosensor for the detection of a new lung cancer biomarker, GM2 activator protein, using a phosphomolybdic acid/polyethyleneimine coated gold nanoparticle composite | |
| Shi et al. | Glypican-3 electrochemical aptasensor based on reduced graphene oxide‐chitosan‐ferrocene deposition of platinum–palladium bimetallic nanoparticles | |
| Huang et al. | Detection of interferon-gamma for latent tuberculosis diagnosis using an immunosensor based on CdS quantum dots coupled to magnetic beads as labels | |
| Liu et al. | A renewable electrochemical magnetic immunosensor based on gold nanoparticle labels | |
| Li et al. | Ultrasensitive electrochemical immunosensor based on the signal amplification strategy of the competitive reaction of Zn 2+ and ATP ions to construct a “signal on” mode GOx-HRP enzyme cascade reaction | |
| Yang et al. | Nitrogen-doped graphene-chitosan matrix based efficient chemiluminescent immunosensor for detection of chicken interleukin-4 | |
| Yang et al. | A novel photoelectrochemical sensor for the detection of α-fetoprotein based on a mesoporous TiO 2–CdS QD composite film | |
| Zhang et al. | Triple amplification ratiometric electrochemical aptasensor for CA125 based on H-Gr/SH-β-CD@ PdPtNFs | |
| Xiao et al. | Electrochemiluminescence immunosensor using poly (l-histidine)-protected glucose dehydrogenase on Pt/Au bimetallic nanoparticles to generate an in situ co-reactant | |
| CN106770530B (zh) | 一种鳞状细胞癌标志物夹心型免疫传感器的制备方法及应用 | |
| Yuan et al. | A Reagentless Amperometric Immunosensor for Alpha‐Fetoprotein Based on Gold Nanoparticles/TiO2 Colloids/Prussian Blue Modified Platinum Electrode | |
| Sun | Sensitive electrochemical immunoassay with signal enhancement based on nanogold-encapsulated poly (amidoamine) dendrimer-stimulated hydrogen evolution reaction |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20210608 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |