CN107621493A - 一种用于重金属铅污染物检测的电化学传感器制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及重金属铅污染物检测的电化学传感器的制备方法及应用，属于电化学检测技术领域。其特征在于：首先合成得到Fe‑MOFs纳米材料，然后将钯铂双金属纳米粒子还原在Fe‑MOFs纳米材料上，再使发夹状DNA信号探针与该复合材料混合，制得生物信号探针；然后通过rGO‑TEPA，亲和素，层层自组装用于“8‑17”DNAzyme的固定，从而制备了重金属铅离子检测的电化学传感器，该传感器成功的用于环境中铅污染物的检测。本发明的优点在于灵敏度高，特异性强，检测迅速，方便。本发明为铅污染检测技术的研发提供实验依据，为环境中铅污染的监测提供新思路和新技术平台。
Description
技术领域：
本发明涉及一种在环境中定量检测重金属铅离子的电化学传感器的制备方法及应用，尤其是基于金属有机框架及双金属钯铂纳米复合材料作为信号探针制备的生物传感器，并利用“8-17”DNAzyme特异催化功能用于检测重金属铅污染物，属于电化学检测领域。
背景技术：
随着国民经济增长，伴随生态环境受到严重破坏的情况越来越引发政府部门的高度重视。特别是重金属污染仍然是一个全球性问题，对居民公共健康危害日益显现。其中铅是一种具有蓄积性和多亲和性的重金属元素，对生命体特别是儿童造成的危害极大。体内过量铅蓄积可造成人体免疫系统、血液系统、神经系统以及生殖系统严重损伤，甚至具有致癌性。重金属铅污染已列为全球环境检测计划(GEMS)中食品污染物监测必测项目。我国也已将铅污染纳入国家环境保护重点防控的内容之一，所以研究发展重金属铅污染物的检测方法，特别是提高对铅的痕量检测具有重要的意义。
目前铅污染物的检测方法主要有原子吸收分光光度法、原子荧光光谱法、电感耦合等离子体发射光谱法等。然而这些方法需要昂贵的设备和材料，并且所检测样品必须经过复杂的前处理来消除其他的干扰物，除此之外，须由技术人员在专门的实验室进行分析。因此寻求快速简便且具有高灵敏度的铅污染物的检测方法是非常必要的。
近年来电化学技术由于其灵敏度高、稳定性好、操作简便、成本低、在复杂环境中能进行在线监测等特点，广泛应用于环境监测、生命科学、药物研究等各个方面。这种方法为铅污染物的检测提供了新的研究思路。本项目旨在构建一种高灵敏度且简便易行的电化学传感器实现对铅污染物的特异性检测，推动铅污染物检测新技术的创新性发展。
功能性核酸是指除了作为遗传信息的载体等传统生物功能之外，具有催化活性、基因表达的调控、以及特异的结合等功能的核酸类分子。长期以来，一直认为酶是由蛋白质组成，直到1978年和1994年分别发现具有催化功能的RNA和DNA，分别称为核酶(Ribozyme)和脱氧核酶(DNAzyme)，其中DNAzyme性质稳定，易于合成和修饰、价格便宜、对环境影响小等优点被广泛应用于分析化学、生物医学等领域。目前发现的大部分DNAzyme都以金属离子为辅酶，且其活性具有金属离子特异性。“8-17”DNAzyme正是在铅离子存在的情况下，具有很高的特异性水解RNA底物磷酸二酯键催化活性，可以将与其配对的序列(含RNA碱基)水解成小片段，且水解能力与铅离子浓度成正比。基于“8-17”DNAzyme这一特殊性，我们将设计与其配对的底物链(含RNA碱基)，体外构建发卡状二聚体，将其固载在电极上，当有铅离子存在时与其配对的底物链上的RNA磷酸二酯键被降解，传感器体系发生电信号的改变，即可用于检测试样中铅离子浓度的变化趋势。利用这个特异性反应原理作为传感器构建的理论基础，就可设计出一种具有高特异性的电化学传感器。
在电化学分析技术中，为了提高检测的灵敏度，降低检测限，来满足对痕量物质的快速定量检测，优异的电信号放大材料的设计合成，是必不可缺少的关键一环。金属有机框架材料具有三维的孔结构，一般以金属离子为连接点，有机配体位支撑构成空间3D延伸，系沸石和碳纳米管之外的又一类重要的新型多孔材料，在催化，储能和分离中都有广泛应用。金属有机框架材料虽然有比表面积大、多孔性等优点但是催化功能并不完美，所以本项目拟合成铁MOFs结合具有优异催化功能的双金属钯铂构成新纳米复合材料，首次将其应用于电化学传感器中，成为信号二次放大的基础物质。较单纯纳米铂、纳米钯，双金属钯铂纳米材料的优势在于能保留各组分的功能特性，并可能通过与捕获探针相互作用产生协同效应，促进电子转移。并且铂纳米粒子，能促进钯的总体催化活性，选择性和稳定性。因此，本项目利用金属有机框架材料与双金属钯铂形成纳米复合材料后，充分结合两者的优点，产生有效的电信号放大，进一步提高传感器检测的灵敏度，降低检测限。
基于上述的思考，本项目旨在构建一个多元、协同的纳米传感界面，通过亲疏水性和电荷密度的调控防止杂质的吸附和背景干扰，并引入功能性核酸“8-17”DNAzyme，以实现对铅污染物的高特异性识别和检测。在信号探针的制备上，将金属有机框架材料与双金属钯铂结合，形成纳米复合材料，再与标记了巯基的探针反应，最后用牛血清白蛋白(BSA)来封闭非特异性结合位点，就获得了具有电化学活性的信号探针。在传感界面的构建上，首先设计合成还原性氧化氧化石墨烯-纳米金(rGO-TEPA-Au)纳米复合材料，将它作为固载基质修饰到玻碳电极上。之后引入亲和素-生物素系统，利用一个亲和素可以同时结合四个生物素的特点实现灵敏度的进一步提高。在此，通过金氨键的作用固载亲和素，再利用亲和素-生物素的特异性结合连接标记了生物素的底物链(substrate strand)，然后通过杂交反应与催化链配对(“8-17”DNAzyme)，加入不同浓度的铅离子后，引发了“8-17”DNAzyme的催化活性，底物链被切割成两部分，并游离出“8-17”DNAzyme。最后通过杂交链式反应使信号探针与切割后仍连接在传感器界面上的序列结合，最终实现对环境污染物铅离子的高灵敏检测。
本项目建立了一种新型分析方法检测铅离子，为铅污染检测技术的研发提供实验依据，为环境中铅污染的监测提供新思路和新技术平台。
发明内容：
1.本发明的目的是用于检测重金属铅离子的电化学生物传感器的制备方法与应用，为铅污染检测技术的研发提供实验依据，为环境中铅污染的监测提供新思路和新技术平台。其特征包括以下步骤：
(1)铁的金属有机框架(Fe-MOFs)-双金属钯铂(PdPt NPs)-hairpin DNA检测探针的制备；
(2)建立电化学生物传感器，测定重金属铅离子，绘制标准曲线。
2.本发明所述铁的金属有机框架(Fe-MOFs)-双金属钯铂(PdPt NPs)-hairpinDNA复合物的制备过程具体包括以下步骤，其特征包括以下步骤：
(1)Fe-MOFs纳米材料的制备：
首先，将0.692mM 2-氨基对苯二甲酸和0.692mM FeCl3·6H2O分散进15mL的DMF溶液中。得到的混合溶液在油浴中加热至120℃，在加热15分钟后，加入3.45mM醋酸，持续加热4小时后得到Fe-MOFs混合溶液，经过离心清洗后，真空干燥得到固体状Fe-MOFs复合材料。
(2)Fe-MOFs-PdPt NPs纳米复合材料的制备：
首先将1mg的Fe-MOFs加入1mL的超纯水中，超声5分钟，之后加入0.5mL 1％H2PtCL6和0.5mL 1％Na2PdCl4，继续超声15分钟。然后在所得到的溶液中逐滴滴入2mL0.1M NaBH4水溶液，在400rpm下搅拌30min，即得到Fe-MOFs/PdPt NPs混合溶液，离心三次并用超纯水清洗后，溶入1mL超纯水备用。
(3)Fe-MOFs-PdPt NPs-hairpin DNA复合物的制备：
首先将标记了巯基的Complementary DNA形成茎环，增加实验的特异性，将2μMComplementary DNA在95℃加热5分钟，然后冷却至室温至少保持2小时，得到形成茎环的单链DNA(hairpin DNA)。随后将200μL 2μm hairpin DNA加入已制备好的Fe-MOFs/PdPt NPs混合溶液中在4℃轻微搅拌，过夜。然后加入牛血清白蛋白封闭非特异性结合位点，得到Fe-MOFs/PdPtNPs-HP-BSA混合物，经过离心三次，并用超纯水清洗后，溶入到1mL的杂交缓冲溶液中，储存在4℃等待使用。
3.根据权利要求1所述的建立电化学生物传感器，测定重金属铅离子，绘制标准曲线，其特征在于包括以下步骤：
(1)分别用0.3和0.05μm的Al2O3粉末将电极抛光成镜面，然后分别按超纯水、无水乙醇、超纯水的顺序超声电极各5min，室温干燥备用；
(2)将10μL电极修饰材料还原性氧化石墨烯四乙烯五胺-金纳米粒子(rGO-TEPA-Au)滴加在电极表面，室温干燥。
(3)将10μL，100μg mL-1亲和素结合在干燥后的电极表面(4℃，12h)。
(4)用超纯水将电极冲洗干净后滴加10μL，1μM生物素标记的底物链(substratestrand)溶液，4℃孵育45min。
(5)用超纯水将孵育后的电极冲洗干净后滴加10μL，1％的BSA溶液室温孵育30min。
(6)将上述BSA封闭后的电极冲洗干净后滴加10μL，1μM的催化链(catalyticstrand)溶液，37℃孵育2h。
(7)将不同浓度的目标Pb2+滴加在电极上并置于37℃孵育40min。
(8)在干燥后的电极上滴加10μL检测探针混合液置于37℃孵育2h。
(9)将孵育后的电极用清洗缓冲液冲洗干净后置于氮气中干燥。
(10)将电极置于5mL，0.1M PBS(0.1M Na2HPO4，0.1M KH2PO4，0.1M KCl)中进行表征，每隔50s加入20μL，1.8mM H2O2，测量其计时电流变化电流值。
(11)根据所得电流变化值与重金属铅离子浓度呈线性关系，绘制工作曲线。
与现有技术相比，本发明的一种定量检测重金属铅离子的电化学生物传感器的制备方法与应用，其突出的特点是：
(1)将基于Fe-MOFs-PdPt NPs的纳米复合材料作为信号探针引入到电化学DNA生物传感器的制备中，不仅有效的提高了材料的催化性能，而且提高了生物分子的固载量，进而提高了电化学生物传感器的灵敏度和生物相容性；
(2)通过利用“8-17”DNAzyme的特异催化功能，不仅作为构建电化学生物传感器的基础，并且确保了重金属铅离子检测的特异性；
(3)本方法制备的电化学生物传感器可为重金属铅离子提供新的定量检测方法，旨在为铅污染检测技术的研发提供实验依据，为环境中铅污染的监测提供新思路和新技术平台。
(4)使用完全相同的纳米材料和修饰方法，利用“8-17”DNAzyme的特异催化功能，只需通过改变DNAzyme二聚体的类型即可实现多种金属离子检测的特异性，高灵敏检测，另外，此方法简便，快速，便于实现商品化，从而推进重金属污染物检测的发展。
附图说明：
图1为本发明的电化学生物传感器的构建示意图。
图2为本发明的信号探针不同合成步骤的扫描电镜图，EDS图和XPS图。
图3为本发明的电化学生物传感器在检测重金属铅离子时得到的计时电流变化电流与浓度的线性关系，以及传感器的特异性。
具体实施方式：
下面结合具体实施例对本发明进行进一步阐述，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1
步骤1.将2mg的还原性氧化石墨烯rGO-TEPA加入1mL的超纯水中，在超声仪中超声1小时，之后移入5mL的烧杯中，与1.45mL 0.8M的AA水溶液、0.5mL 2.0M的PVP水溶液、1mL2％的HAuCl4混合，加热到90℃，剧烈搅拌3小时，得到还原性氧化石墨烯-金纳米粒子(rGO-TEPA-Au)混合溶液；
步骤2.分别用0.3和0.05μm的Al2O3粉末将电极抛光成镜面，然后分别按超纯水、无水乙醇、超纯水的顺序超声电极各5min，室温干燥备用；
步骤3.将10μL，电极修饰材料还原性氧化石墨烯四乙烯五胺-金纳米粒子(rGO-TEPA-Au)滴加在电极表面，室温干燥；
步骤4.用超纯水将电极冲洗干净后滴加10μL，100μg mL-1亲和素溶液并置于4℃孵育12h；
步骤5.用超纯水将孵育后的电极冲洗干净后滴加10μL，1μM生物素标记的底物链(substrate strand)溶液，4℃孵育12h；
步骤6.用超纯水将孵育后的电极冲洗干净后滴加10μL，1％的BSA溶液室温孵育30min；
步骤7.将上述BSA封闭后的电极用超纯水冲洗干净后滴加10μL，1μM的催化链(catalytic strand)溶液，37℃孵育2h。
步骤8.将不同浓度的目标pb2+滴加在电极上并置于37℃孵育40min；
步骤9.在干燥后的电极上滴加10μL检测探针混合液置于37℃孵育2h；
步骤10.将孵育后的电极用清洗缓冲液冲洗干净后置于氮气中干燥；
步骤11.将电极置于5mL，0.1M PBS(0.1M Na2HPO4，0.1M KH2PO4，0.1M KCl)中进行表征，每隔50s加入20μL，1.8M H2O2，测量其计时电流变化电流值；
步骤12.根据所得电流变化值与重金属铅离子浓度呈线性关系，绘制工作曲线；测定结果表明铅离子浓度在5pM-1000nM范围内成线性关系，线性相关系数为0.9993，检测限为0.2pM。
步骤13.将本发明上述传感器于4℃保存，间断检测传感器电流响应，储存28天后电流响应仍为初始电流的86.0％，表示传感器具有良好的稳定性；
步骤14.本发明取同一批次制备的生物传感器5支，在相同条件下对1000nM的铅离子浓度分别进行测定，每一支电极测定3次，结果响应电流的相对标准偏差少于3.27％，说明传感器差异小，传感器重现性良好。
步骤15.将本发明上述传感器用于检测目标铅离子，干扰离子，结果干扰离子电流响应相对于目标铅离子显得微不足道，说明传感器的特异性好，可以很好区分目标检测物。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提条件下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (3)
1.一种用于重金属铅污染物检测的电化学传感器制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)铁的金属有机框架(Fe-MOFs)-双金属钯铂(PdPt NPs)-hairpin DNA检测探针的制备；
(2)建立电化学生物传感器，测定重金属铅离子，绘制标准曲线。
2.根据权利要求1所述Fe-MOFs-PdPt NPs-hairpin DNA复合物的制备过程，其特征包括以下步骤：
(1)Fe-MOFs纳米材料的制备：
首先，将0.692mM 2-氨基对苯二甲酸和0.692mM FeCl3·6H2O分散进15mL的DMF溶液中。得到的混合溶液在油浴中加热至120℃，在加热15分钟后，加入3.45mM醋酸，持续加热4小时后得到Fe-MOFs混合溶液，经过离心清洗后，真空干燥得到固体状Fe-MOFs复合材料。
(2)Fe-MOFs-PdPt NPs纳米复合材料的制备：
首先将1mg的Fe-MOFs加入1mL的超纯水中，超声5分钟，之后加入0.5mL 1％H2PtCL6和0.5mL 1％Na2PdCl4，继续超声15分钟。然后在所得到的溶液中逐滴滴入2mL0.1M NaBH4水溶液，在400rpm下搅拌30min，即得到Fe-MOFs/PdPtNPs混合溶液，离心三次并用超纯水清洗后，溶入1mL超纯水备用。
(3)Fe-MOFs-PdPt NPs-hairpin DNA复合物的制备：
首先将标记了巯基的Complementary DNA形成茎环，增加实验的特异性，将2μMComplementary DNA在95℃加热5分钟，然后冷却至室温至少保持2小时，得到形成茎环的单链DNA(hairpin DNA)。随后将200μL 2μm hairpin DNA加入已制备好的Fe-MOFs/PdPt NPs混合溶液中在4℃轻微搅拌，过夜。然后加入牛血清白蛋白封闭非特异性结合位点，得到Fe-MOFs/PdPt NPs-HP-BSA混合物，经过离心三次，并用超纯水清洗后，溶入到1mL的杂交缓冲溶液中，储存在4℃等待使用。
3.根据权利要求1所述的建立电化学生物传感器，测定重金属铅离子，绘制标准曲线，其特征在于包括以下步骤：
(1)分别用0.3和0.05μm的Al2O3粉末将电极抛光成镜面，然后分别按超纯水、无水乙醇、超纯水的顺序超声电极各5min，室温干燥备用；
(2)将10μL电极修饰材料还原性氧化石墨烯四乙烯五胺-金纳米粒子(rGO-TEPA-Au)滴加在电极表面，室温干燥。
(3)将10μL，100μg mL-1亲和素结合在干燥后的电极表面(4℃，12h)。
(4)用超纯水将电极冲洗干净后滴加10μL，1μM生物素标记的底物链(substratestrand)溶液，4℃孵育45min。
(5)用超纯水将孵育后的电极冲洗干净后滴加10μL，1％的BSA溶液室温孵育30min。
(6)将上述BSA封闭后的电极冲洗干净后滴加10μL，1μM的催化链(catalytic strand)溶液，37℃孵育2h。
(7)将不同浓度的目标Pb2+滴加在电极上并置于37℃孵育40min。
(8)在干燥后的电极上滴加10μL检测探针混合液置于37℃孵育2h。
(9)将孵育后的电极用清洗缓冲液冲洗干净后置于氮气中干燥。
(10)将电极置于5mL，0.1M PBS(0.1M Na2HPO4，0.1M KH2PO4，0.1M KCl)中进行表征，每隔50s加入20μL，1.8M H2O2，测量其计时电流变化电流值。
(11)根据所得电流变化值与重金属铅离子浓度呈线性关系，绘制工作曲线。
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