CN111398396A

CN111398396A - 一种用于重金属Hg2+和Pb2+同时检测的电化学传感器制备方法

Info

Publication number: CN111398396A
Application number: CN202010444320.1A
Authority: CN
Inventors: 何保山; 刘慧�; 谢玲玲; 曹晓雨; 王晓曦; 郑学玲; 卫敏; 赵文红; 金华丽; 任文洁; 吴立根; 王涛
Original assignee: Henan University of Technology
Current assignee: Henan University of Technology
Priority date: 2020-05-22
Filing date: 2020-05-22
Publication date: 2020-07-10
Anticipated expiration: 2040-05-22
Also published as: CN111398396B

Abstract

本发明涉及了一种用于重金属Hg²⁺和Pb²⁺同时检测的电化学传感器的制备方法，包括以下步骤：以原位生长法和水热合成法制备金纳米花/功能化碳纳米复合材料，以原位生长法制备金属有机框架@双金属材料，采用共价键合方式构建核酸适配体/金纳米花/功能化碳纳米复合材料/金电极，以铂丝电极为对电极，饱和氯化银为参比电极，通过DNA‑1 3'端所带信号分子响应信号的降低和金属有机框架@双金属/DNA‑4探针链响应信号的增加分别指示样品中Hg²⁺和Pb²⁺的含量，得到了重金属Hg²⁺和Pb²⁺同时检测的电化学传感器。本发明与其它材料修饰金电极和研究手段相比，所制备的新型电化学传感器具有响应速度快，操作简单，灵敏度高、重复性好、准确度高的优点。

Description

一种用于重金属Hg2+和Pb2+同时检测的电化学传感器制备方法

技术领域

本发明涉及一种用于重金属Hg²⁺和Pb²⁺同时检测的电化学传感器制备方法，尤其涉及一种基于核酸适配体/金纳米花/功能化碳纳米复合材料/金电极的制备方法。

背景技术

人类非常依赖水源，因为水可以维系生命，是最基本的保障。世界上众多的国家水源都是相当匮乏的，虽然国家众多政策都不断的加快解决这种现状，但是仍然难以解决我国水源贫乏。最近几年我国各个行业都发展的比较迅猛，其中大批量新型工业的发展造成的大量的工业废水的排放，使得原本就短缺的水源变得更加匮乏，由于大量废水的排放，导致了水源受到了严重的污染，而重金属污染就是其中之一。常见的重金属离子有Hg²⁺，Pb²⁺，Cd²⁺，Fe³⁺等，这些重金属离子具有严重的生物毒性和不可降解性，在环境中经过食物链不断地富集，最终进入人体内。而重金属离子在人的机体内会与多种酶和蛋白质结合，使其丧失活性，也可能造成人体中大部分器官的衰竭，研究发现当人体中的重金属离子累积到一定程度后可能会引发多种疾病甚至癌症。因此，加强重金属离子检测技术，在医药、食品和环境等领域都具有十分重要的意义。迄今为止，原子吸收光谱法(AAS)，电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)和冷蒸气原子荧光光谱法(CV-AFS)是用于检测重金属离子的传统技术。尽管这些测定方法显示出极好的准确性和特异性，但它们操作复杂且需要昂贵的仪器，不方便用于现场检测。因此，发展简便、快速、经济、适用于现场检测的方法将是解决当前重金属污染问题的有效途径之一。电化学传感器检出限低，灵敏度高，操作简便，且易于微型化，方便设计成便携式仪器，是最适合用于现场快速检测的传感系统，电化学电极通常需要与功能材料联用，以提高电化学性能和检测的特异性，因此设计合成金纳米花/功能化碳纳米复合材料成为构建高效电化学生物传感器的关键，另外，为进一步提高传感器的检测性能，核酸外切酶III已被广泛用于回收放大信号并提高各种灵敏度的目标物质检测方式，但利用核酸外切酶技术仅能检测单一的重金属离子，针对多种离子的检测仍需其他技术的结合，DNAzyme是一种在具有高选择性的金属离子的金属辅助因子存在下，能表现出较高的催化活性的DNA分子，因此，结合核酸外切酶III循环放大策略和DNAzyme独特的催化活性两者的优点，可以用于重金属离子的检测。目前，利用金纳米花/功能化碳纳米复合材料作为电极修饰材料，同时通过DNA-1 3'端所带信号分子响应信号的降低指示样品中Hg²⁺的含量和金属有机框架@双金属/DNA-4探针链响应信号的增加指示样品中Pb²⁺的含量用于样本中重金属Hg²⁺和Pb²⁺同时检测的电化学生物传感器方法尚未见报道。

发明内容

发明本发明涉及一种用于重金属Hg²⁺和Pb²⁺同时检测的电化学传感器制备方法。

一种用于一种用于重金属Hg²⁺和Pb²⁺同时检测的电化学传感器制备方法，其步骤如下：

所述金纳米花/功能化碳纳米复合材料的制备：采用原位生长法和柠檬酸盐还原法制备金纳米花溶液，量取2~4 mL 0.1~0.3 mM HAuCl₄水溶液，用碱性溶液调节至pH值为4~11，加入0.01~0.04 mL 10~40 mM NH₂OH·HCl溶液，然后在20~25℃下，移取0.2~0.4 mL 0.1~0.3 mM HAuCl₄和1~5 mL 3~7%的柠檬酸钠溶液中，静止2~3 h至上述混合溶液变为淡粉色，即得金纳米花溶液，采用水热合成法处理碳纳米材料，称取5~15 mg碳纳米材料加入5~15mL的蒸馏水中，超声处理1~3 h，在8000~12000 rpm转速下离心3~6 min，将处理过的碳纳米材料在搅拌的作用下加入到50~80 μL的阳离子聚合物溶液中，上述溶液在80~100℃下与50~80 μL还原性溶液进一步反应24~36 h，最后通过抽滤收集样品功能化碳纳米材料，用物理吸附法制备复合材料，称取上述150~300 mg功能化碳纳米材料溶解于100~200 mL的蒸馏水中，加入200~400 mL上述金纳米花溶液，将上述混合液置于摇床上震荡24~36 h，干燥即得到金纳米花/功能化碳纳米复合材料。

所述金属有机框架@双金属/DNA-4探针链的制备：称取0.3~0.6 g硝酸盐溶解在10~15 mL蒸馏水中，然后与0.1~0.3 g H₃BTC混合在10~15 mL体积比为1:1~1:3的蒸馏水-乙醇溶液中。将该混合物在60℃~80℃的水浴中保持1~3 h，在8000~12000 rpm转速下离心10~15 min，将处理过的金属有机框架用蒸馏水和乙醇分别冲洗3~5次，然后在80~100℃下干燥10~16 h，最后得到金属有机框架产物。采用原位生长法制备金属有机框架@双金属材料，将0.5~1.0 mL质量百分比1~3%的贵金属A溶液和0.5~1.0 mL质量百分比1~3%的贵金属B溶液添加至1~3 mL 1~3 mg mL^-1的金属有机框架溶液中，并置于摇床上震荡处理20~40 min，然后在400~600 rpm转速下搅拌30~40 min，将2~4 mL 0.1~0.4 M的还原剂溶液滴加到上述溶液中。随后，将混合物离心纯化并用蒸馏水洗涤3~5次即得到金属有机框架@双金属，然后再分散在1~4 mL的pH为7~8的0.1~0.4 M缓冲液中，取1~3 mL上述制备好的金属有机框架@双金属溶液与200~400 μL 4~6 μM 5'端巯基修饰的DNA-4混合，并在4~8℃轻轻搅拌12~24 h，随后加入30~50 μL 质量百分比1~3%的牛血清白蛋白溶液，并继续在4~8℃轻轻搅拌30~50h，然后将上述混合溶液置于8000~12000 rpm转速下离心3~5 min，将得到的混合液用蒸馏水洗涤3~5次，最后将沉淀物分散在1~3 mL的蒸馏水中，即得到金属有机框架@双金属/DNA-4探针链；

所述核酸适配体/金纳米花/功能化碳纳米复合材料/金电极的制备：首先用氧化铝粉抛光直径为1~4 mm金电极，将抛光后的金电极依次置于乙醇和超纯水中分别超声处理5~10min，然后将金电极浸入强氧化溶液中30~60 min，用蒸馏水冲洗干燥，取2~5 μL上述金纳米花/功能化碳纳米复合材料溶液采用共价键合方式结合在金电极表面，于红外灯下干燥3~6min，在体外先将10~15 μL 4~6 μM 5'端修饰巯基3'端修饰信号分子的Hg²⁺适体链DNA-1与10~15 μL 6~9 μM的Pb²⁺对应DNAzyme的底物链DNA-2互补成DNA-HP1，依次移取5~10 μLDNA-HP1和5~10 μL 0.1~0.5 mM封闭剂滴在电极上，放置4~8℃下12~24 h，然后滴加5~10 μL 4~6 μM Hg²⁺互补链DNA-3，同时滴加不同浓度的目标物Hg²⁺和Pb²⁺，在35~40℃孵育2~3 h，加入5~10 μL 10~30 U的核酸外切酶，在35~40℃孵育1~2 h，加入5~10 μL制备好的金属有机框架@双金属/DNA-4探针链，在35~40℃孵育1~2 h，最后可得到核酸适配体/金纳米花/功能化碳纳米复合材料/金电极；

所述电化学传感器是以核酸适配体/金纳米花/功能化碳纳米复合材料/金电极为工作电极，以铂丝电极为参比电极，饱和氯化银为对电极，分别通过DNA-1 3'端所带信号分子响应信号的降低指示样品中Hg²⁺的含量和金属有机框架@双金属/DNA-4探针链响应信号的增加指示样品中Pb²⁺的含量，得到了重金属Hg²⁺和Pb²⁺同时检测的电化学传感器。

所述的碳纳米材料为多壁碳纳米管、氧化石墨烯、还原氧化石墨烯、生物质多孔碳、石墨烯中的一种或多种。

所述的碱性溶液为碳酸钠、氨水、醋酸钠、氢氧化钠中的一种或多种。

所述的阳离子聚合物为聚二甲基二烯丙基氯化铵、聚乙烯亚胺、聚脒、阳离子聚丙烯酰胺中的一种或多种。

所述的还原性溶液为抗坏血酸、水合肼、硼氢化钠、四氢锂铝中的一种或多种。

所述的金属有机框架为铜基金属有机框架、铈基金属有机框架、铁基金属有机框架中的一种或多种。

所述的双金属为金铂纳米颗粒、金钯纳米颗粒、铂钯纳米颗粒中的一种或多种。

所述的硝酸盐为硝酸铜、硝酸铈、硝酸铅中的一种或多种。

所述的贵金属溶液为氯铂酸钾、氯金酸、氯钯酸钠中的一种或多种。

所述的还原剂为硼氢化钠、亚硫酸钠、硫酸亚铁中的一种或多种。

所述的缓冲液为磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液中的一种或多种。

所述的信号分子为二茂铁、亚甲基蓝、中性红中的一种或多种。

所述的封闭剂为6-巯基己醇、牛血清白蛋白、己硫醇中的一种或多种。

所述的核酸外切酶为Recjf外切酶、EXO Ⅲ外切酶、T7 EXO外切酶中的一种或多种。

本发明涉及的传感器中，以核酸适配体/金纳米花/功能化碳纳米复合材料修饰金电极，以信号分子和金属有机框架@双金属为信号响应，同其它材料修饰金电极和研究手段用于重金属Hg²⁺和Pb²⁺同时检测的电化学传感器相比，所制备的新型电化学传感器具有响应速度快，操作简单，灵敏度高、重复性好、准确度高的优点。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行描述：

实施例1

具体步骤如下：

（1）金纳米花/功能化碳纳米复合材料的制备：采用原位生长法和柠檬酸盐还原法制备金纳米花溶液，量取2 mL 0.2 mM HAuCl₄水溶液，用碱性溶液调节至pH值为7，加入0.02 mL20 mM NH₂OH·HCl溶液，然后在25℃下，移取0.2 mL 0.2 mM HAuCl₄和3 mL 6%的柠檬酸钠溶液的溶液添加到上述混合液中，静止2.5 h至上述混合溶液变为淡粉色，即得金纳米花溶液，采用水热合成法处理碳纳米材料，称取15 mg碳纳米材料加入15 mL的蒸馏水中，超声处理2 h，在8000 rpm转速下离心6 min，将处理过的碳纳米材料在搅拌的作用下加入到75 μL的阳离子聚合物溶液中，上述溶液在90℃下与75 μL还原性溶液进一步反应24 h，最后通过抽滤收集样品功能化碳纳米材料，用物理吸附法制备复合材料，称取上述200 mg功能化碳纳米材料溶解于200 mL的蒸馏水中，加入200 mL上述金纳米花溶液，将上述混合液置于摇床上震荡36 h，干燥即得到金纳米花/功能化碳纳米复合材料；

(2)金属有机框架@双金属/DNA-4探针链的制备：称取0.4 g硝酸盐溶解在10 mL蒸馏水中，然后与0.2 g H₃BTC混合在10 mL体积比1:2蒸馏水-乙醇溶液中，将该混合物在60℃的水浴中保持1 h，在12000 rpm转速下离心10 min，将处理过的金属有机框架用蒸馏水和乙醇分别冲洗3次，然后在90℃下干燥10 h，最后得到金属有机框架产物，采用原位生长法制备金属有机框架@双金属材料，将0.8 mL质量百分比2%的贵金属A溶液和0.8 mL质量百分比2%的贵金属B溶液添加至2 mL 2 mg mL^-1的金属有机框架溶液中，并置于摇床上震荡处理30min，然后在500 rpm转速下搅拌35 min，将4 mL 0.4 M的还原剂溶液滴加到上述溶液中，随后，将混合物离心纯化并用蒸馏水洗涤3次即得到金属有机框架@双金属，然后再分散在4mL的pH为7.4的0.2 M缓冲液中，取2 mL上述制备好的金属有机框架@双金属溶液与200 μL6μM 5'端巯基修饰的DNA-4混合，并在4℃轻轻搅拌12 h，随后加入40 μL 质量百分比2%的牛血清白蛋白溶液，并继续在4℃轻轻搅拌30 h。然后将上述混合溶液置于8000 rpm转速下离心3 min，将得到的混合液用蒸馏水洗涤3次，最后将沉淀物分散在2 mL的蒸馏水中，即得到金属有机框架@双金属/DNA-4探针链；

(3)核酸适配体/金纳米花/功能化碳纳米复合材料/金电极的制备：首先用氧化铝粉抛光直径为4 mm金电极，将抛光后的金电极依次置于乙醇和超纯水中分别超声处理6 min，然后将金电极浸入强氧化溶液中30 min，用蒸馏水冲洗干燥，取2 μL上述金纳米花/功能化碳纳米复合材料溶液采用共价键合方式结合在金电极表面，于红外灯下干燥3 min，在体外先将10 μL 4 μM 5'端修饰巯基3'端修饰信号分子的Hg²⁺适体链DNA-1与10 μL 6μM的Pb²⁺对应DNAzyme的底物链DNA-2互补成DNA-HP1，依次移取5 μL DNA-HP1和6 μL 0.2 mM封闭剂滴在电极上，放置4℃下12 h，然后滴加5 μL 4 μM Hg²⁺互补链DNA-3，同时滴加不同浓度的目标物Hg²⁺和Pb²⁺，在37℃孵育2 h，接着加入5 μL 20 U的核酸外切酶，在37℃孵育1.5 h，然后加入5 μL制备好的金属有机框架@双金属/DNA-4探针链，在37℃孵育1 h，最后可得到核酸适配体/金纳米花/功能化碳纳米复合材料/金电极；

(4)电化学传感器是以核酸适配体/金纳米花/功能化碳纳米复合材料/金电极为工作电极，以铂丝电极为参比电极，饱和氯化银作为对电极，分别通过DNA-1 3'端所带信号分子响应信号的降低指示样品中Hg²⁺的含量和金属有机框架@双金属/DNA-4探针链响应信号的增加指示样品中Pb²⁺的含量，得到了重金属Hg²⁺和Pb²⁺同时检测的电化学传感器。

所制备的电化学传感器对重金属Hg²⁺和Pb²⁺的同时检测具有灵敏度高，线性范围宽（分别为0.1 pM~2 μM和0.05 pM~100 nM），检测下限低（分别为0.048 pM和0.002 pM）的特点。同时，对实际样品(如饮用水，果汁)的检测结果表明所制备的传感器具有非常好的实际应用价值。

以上实施例只是为了说明本发明，而不是对本发明的限制。在上述说明的基础上，可以对本发明作许多改进和改变。在所附权利要求书的范围内，本发明可以有不同于上述的其它实现方式，选用其它试剂材料、调整电极的孵育时间等方法均在本发明专利要求范围之内。

Claims

1.一种用于重金属Hg²⁺和Pb²⁺同时检测的电化学传感器制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）金纳米花/功能化碳纳米复合材料的制备：采用原位生长法和柠檬酸盐还原法制备金纳米花溶液，量取2~4 mL 0.1~0.3 mM HAuCl₄水溶液，用碱性溶液调节至pH值为4~11，加入0.01~0.04 mL 10~40 mM NH₂OH·HCl溶液，然后在20~25℃下，移取0.2~0.4 mL 0.1~0.3mM HAuCl₄和1~5 mL 3~7%的柠檬酸钠溶液添加到上述混合液中，静止2~3 h至上述混合溶液变为淡粉色，即得金纳米花溶液；采用水热合成法处理碳纳米材料，称取5~15 mg碳纳米材料加入5~15 mL的蒸馏水中，超声处理1~3 h，在8000~12000 rpm转速下离心3~6 min，将处理过的碳纳米材料在搅拌的作用下加入到50~80 μL的阳离子聚合物溶液中，上述溶液在80~100℃下与50~80 μL还原性溶液进一步反应24~36 h，最后通过抽滤收集样品功能化碳纳米材料；用物理吸附法制备复合材料，称取上述150~300 mg功能化碳纳米材料溶解于100~200 mL的蒸馏水中，加入200~400 mL上述金纳米花溶液，将上述混合液置于摇床上震荡24~36 h，干燥即得到金纳米花/功能化碳纳米复合材料；

（2）金属有机框架@双金属/DNA-4探针链的制备：称取0.3~0.6 g硝酸盐溶解在10~15mL蒸馏水中，然后与0.1~0.3 g H₃BTC混合在10~15 mL体积百分比为1:1~1:3的蒸馏水-乙醇溶液中，将该混合物在60℃~80℃的水浴中保持1~3 h，在8000~12000 rpm转速下离心10~15 min，将处理过的金属有机框架用蒸馏水和乙醇分别冲洗3~5次，然后在80~100℃下干燥10~16 h，最后得到金属有机框架产物；采用原位生长法制备金属有机框架@双金属材料，将0.5~1.0 mL的质量百分比1~3%贵金属A溶液和0.5~1.0 mL质量百分比1~3%的贵金属B溶液添加至1~3 mL 1~3 mg mL^-1的金属有机框架溶液中，并置于摇床上震荡处理20~40 min，然后在400~600 rpm转速下搅拌30~40 min，将2~4 mL 0.1~0.4 M的还原剂溶液滴加到上述溶液中，随后，将混合物离心纯化并用蒸馏水洗涤3~5次即得到金属有机框架@双金属，然后再分散在1~4 mL的pH为7~8的0.1~0.4 M缓冲液中，取1~3 mL上述制备好的金属有机框架@双金属溶液与200~400 μL 4~6 μM 5'端巯基修饰的DNA-4混合，并在4~8℃轻轻搅拌12~24 h，随后加入30~50 μL 1~3%的牛血清白蛋白溶液，并继续在4~8℃轻轻搅拌30~50 h，然后将上述混合溶液置于8000~12000 rpm转速下离心3~5 min，将得到的混合液用蒸馏水洗涤3~5次，最后将沉淀物分散在1~3 mL的蒸馏水中，即得到金属有机框架@双金属/DNA-4探针链;

（3）核酸适配体/金纳米花/功能化碳纳米复合材料/金电极的制备：首先用氧化铝粉抛光直径为1~4 mm金电极，将抛光后的金电极依次置于乙醇和超纯水中分别超声处理5~10min，然后将金电极浸入强氧化溶液中30~60 min，用蒸馏水冲洗干燥，取2~5 μL上述金纳米花/功能化碳纳米复合材料溶液采用共价键合方式结合在金电极表面，于红外灯下干燥3~6min，在体外先将10~15 μL 4~6 μM 5'端修饰巯基3'端修饰信号分子的Hg²⁺适体链DNA-1与10~15 μL 6~9 μM的Pb²⁺对应DNAzyme的底物链DNA-2互补成DNA-HP1，依次移取5~10 μLDNA-HP1和5~10 μL 0.1~0.5 mM封闭剂滴在电极上，放置4~8℃下12~24 h，然后滴加5~10 μL 4~6 μM Hg²⁺互补链DNA-3，同时滴加不同浓度的目标物Hg²⁺和Pb²⁺，在35~40℃孵育2~3 h，加入5~10 μL 10~30 U的核酸外切酶，在35~40℃孵育1~2 h，加入5~10 μL制备好的金属有机框架@双金属/DNA-4探针链，在35~40℃孵育1~2 h，最后可得到核酸适配体/金纳米花/功能化碳纳米复合材料/金电极；

（4）电化学传感器是以核酸适配体/金纳米花/功能化碳纳米复合材料/金电极为工作电极，以铂丝电极为对电极，饱和氯化银为参比电极，分别通过DNA-1 3'端所带信号分子响应信号的降低指示样品中Hg²⁺的含量和金属有机框架@双金属/DNA-4探针链响应信号的增加指示样品中Pb²⁺的含量，得到了重金属Hg²⁺和Pb²⁺同时检测的电化学传感器。

2.根据权利要求1所述的一种用于重金属Hg²⁺和Pb²⁺同时检测的电化学传感器制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述的碳纳米材料为多壁碳纳米管、氧化石墨烯、还原氧化石墨烯、生物质多孔碳、石墨烯中的一种或多种；所述的碱性溶液为碳酸钠、氨水、醋酸钠、氢氧化钠中的一种或多种；所述的阳离子聚合物为聚二甲基二烯丙基氯化铵、聚乙烯亚胺、聚脒、阳离子聚丙烯酰胺中的一种或多种；所述的还原性溶液为抗坏血酸、水合肼、硼氢化钠、四氢锂铝中的一种或多种。

3.根据权利要求1所述的一种用于重金属Hg²⁺和Pb²⁺同时检测的电化学传感器制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述的金属有机框架为铜基金属有机框架、铈基金属有机框架、铁基金属有机框架中的一种或多种；所述的双金属为金铂纳米颗粒、金钯纳米颗粒、铂钯纳米颗粒中的一种或多种；所述的硝酸盐为硝酸铜、硝酸铈、硝酸铅中的一种或多种；所述的贵金属A溶液为氯铂酸钾、氯金酸、氯钯酸钠中的一种或多种；所述的贵金属B溶液为氯铂酸钾、氯金酸、氯钯酸钠中的一种或多种；所述的还原剂为硼氢化钠、亚硫酸钠、硫酸亚铁中的一种或多种；所述的缓冲液为磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液中的一种或多种。

4.根据权利要求1所述的一种用于重金属Hg²⁺和Pb²⁺同时检测的电化学传感器制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述的信号分子为二茂铁、亚甲基蓝、中性红中的一种或多种；所述的封闭剂为6-巯基己醇、牛血清白蛋白、己硫醇中的一种或多种；所述的核酸外切酶为Recjf外切酶、EXO Ⅲ外切酶、T7 EXO外切酶中的一种或多种。