CN110006968A - 基于快速扫描循环伏安技术检测汞离子的电化学生物传感器的制备方法及其应用 - Google Patents

基于快速扫描循环伏安技术检测汞离子的电化学生物传感器的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了基于快速扫描循环伏安技术检测汞离子的电化学生物传感器的制备方法及其应用，特点是包括以下步骤：（1）将Probe DNA1、Probe DNA2和TCEP加入rGO‑NH2@AuNPs&Fc分散液中制得功能化还原氧化石墨烯复合生物纳米材料分散液；（2）取含Hg2+的溶液加入到功能化还原氧化石墨烯复合生物纳米材料分散液中，混合均匀后滴加在固载有Probe DNA3金电极上，在37℃恒温恒湿条件下孵育0.5～1 h后，用PBS缓冲液清洗电极，即得到基于快速扫描循环伏安技术检测汞离子的电化学生物传感器，可用于快速扫描循环伏安技术检测汞离子中，优点是高灵敏度、高选择性以及操作简单快速。

Description

基于快速扫描循环伏安技术检测汞离子的电化学生物传感器 的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及重金属离子检测技术领域，尤其是涉及一种基于快速扫描循环伏安技术检测汞离子的电化学生物传感器的制备方法及其应用。
背景技术
汞是一种常见的重金属元素，是人体非必需元素，广泛存在于各类环境介质如空气、水和土壤中，通过迁移和转化，进入食物链和生物圈中。汞可以在生物体内积累，破坏人体内脏及中枢神经系统机能，长时间暴露在高汞环境中甚至导致脑损伤和死亡。二价汞离子（Hg2+）是汞在自然界中最常见和最稳定的存在形式之一，也是最危险的形式之一。
目前，汞离子的检测方法主要有光谱、色谱、电化学、比色方法等等。光谱和色谱方法灵敏度和准确度高，但仪器昂贵，操作繁琐，分析成本高；传统电化学方法灵敏度尚可，但选择性欠佳，导致准确度有限、前处理步骤复杂；比色等快速检测方法的灵敏度欠缺，难以检测超低浓度的汞离子。因此，设计新颖的汞离子检测方法，实现对汞离子的灵敏、准确、简单、快速、价廉的检测，对于理论研究、实际应用均有重要意义。
还原氧化石墨烯（rGO）是一种性能优异的新型碳材料，具有较高的比表面积、良好的电子传输性能和生物相容性，基于rGO制备的功能化还原氧化石墨烯复合生物纳米材料，可负载大量的电化学信号标记物、有效延展电极表面的亥姆霍兹面，显著增强电化学信号，提高检测灵敏度，是构建电化学生物传感器的理想基材。
纳米金（AuNPs）具有较大的比表面积、高反应活性和良好的生物相容性，容易与生物活性物质如DNA、蛋白质等通过Au-S键或Au-NH2键结合，将生物大分子固定到纳米金材料表面，为电化学生物传感器构建提供便利。
近年来，为提高Hg2+检测方法的选择性，Hg2+和胸腺嘧啶（T）之间的选择性错配结构被应用于开发检测Hg2+的传感器，包括电化学传感器、比色传感器、荧光传感器和电化学发光传感器等。但是，由于制备步骤通常比较复杂、实际操作各有差异、方法学因素、试剂用量等多种原因，上述传感器在实际检测Hg2+时，存在结果稳定性差、检测灵敏度低、无法实现对痕量Hg2+的准确测定等问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种高灵敏度、高选择性以及操作简单快速的基于快速扫描循环伏安技术检测汞离子的电化学生物传感器的制备方法及其应用。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种基于快速扫描循环伏安技术检测汞离子的电化学生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
（1）功能化还原氧化石墨烯复合生物纳米材料的制备
a. 氨基化还原氧化石墨烯（rGO-NH2）的预处理
取2～20 mg氨基化还原氧化石墨烯加入到10～100 mL的无水乙醇中，超声分散5～10h，制备成浓度为0.02～2 mg/mL的rGO-NH2乙醇分散液；
b. AuNPs溶液合成
将50～100 mL去离子水和1～10 mL 0.01～0.1 moL/L HAuCl4·4H2O 溶液加入到烧杯中，然后磁力搅拌下，加热至沸腾，在沸腾状态下，迅速加入0.1～10 mL 的0.01～0.1moL/L柠檬酸三钠水溶液，继续煮沸，沸腾状态下继续加热搅拌10～60 min（可见溶液很快发生颜色变化（黑-蓝-深红）），即得AuNPs溶液；
c. rGO-NH2@AuNPs材料合成
取1～10 mL浓度为0.02～2 mg/mL的rGO-NH2乙醇分散液，加入到10～50 mL AuNPs溶液中，室温搅拌6～24 h，3000～6000 rpm条件下离心清洗三次，保留沉淀，除去没有连接上的AuNPs和其他杂质，将沉淀加入无水乙醇，获得0.02～2 mg/mL的rGO-NH2@AuNPs溶液；
d. 0.01～0.1 moL/L氨基二茂铁溶液制备
取0.004～0.04 g氨基二茂铁固体溶于0.2～2 mL无水乙醇中，超声10～50 min，使氨基二茂铁完全溶于无水乙醇，即得0.01～0.1 moL/L氨基二茂铁溶液；
e. rGO-NH2@AuNPs&Fc分散液制备
取10～50 mL 0.02～2 mg/mL的rGO-NH2@AuNPs溶液于烧杯中，向溶液中加入1～10 mL5～25wt% 戊二醛溶液，在室温下磁力搅拌反应1～3 h，3000～6000 rpm条件下无水乙醇离心清洗三次，取下层沉淀分散于10～50 mL无水乙醇中，向其中加入0.1～1 mL 0.01～0.1moL/L氨基二茂铁溶液，室温条件下磁力搅拌反应3～6 h，3000～6000 rpm条件下去离子水离心清洗三次，取下层沉淀分散于去离子水中，制备成浓度为0.02～2 mg/mL的rGO-NH2@AuNPs&Fc分散液；
f. 功能化还原氧化石墨烯复合生物纳米材料制备
取10～50 μL含1～10 μmol/L Probe DNA1、1～10 μmol/L Probe DNA2和1～10 mmol/L三（2-羧乙基）膦（TCEP）的pH = 7～8的0.01～0.1 mol/L的PBS缓冲液，加入10～50 μL浓度为0.02～2 mg/mL的rGO-NH2@AuNPs&Fc分散液，在4 ℃孵育6～12 h，离心清洗三次，分散于10～50 μL的去离子水中，即得功能化还原氧化石墨烯复合生物纳米材料分散液；
（2）固载有Probe DNA3金电极的制备
a.将直径为2 mm的金电极依次用1 µm、0.3 µm、0.05 µm的Al2O3抛光成镜面，然后依次用由浓硝酸和水按体积比为1：1混合而成的硝酸溶液、无水乙醇、水超声洗涤1～5 min，水冲洗干净后，氮气吹干备用；
b.取5～10 µL含Probe DNA3和三（2-羧乙基）膦（TCEP）的PBS缓冲溶液，滴在金电极表面，在37℃恒温恒湿条件下静置20～40 min，使Probe DNA3结合到电极表面；所述的含Probe DNA3和三（2-羧乙基）膦的PBS缓冲溶液中Probe DNA3的浓度为1～10 µmol/L以及三（2-羧乙基）膦的浓度为1～10 mmol/L，溶剂为pH = 7～8的0.01～0.1 mol/L的PBS缓冲液；
c.将步骤（2）b所得的Probe DNA3修饰电极用pH = 7～8的0.01～0.1 mol/L的PBS缓冲液淋洗，去除未与金电极结合的Probe DNA3；
d.取5～10 μL 1～5 mmol/L的3-巯基-1-丙醇（MCH）滴加到步骤（2）c处理后的电极表面，在37℃恒温恒湿条件下静置0.5～1 h，封闭电极上非活性位点，即得固载有Probe DNA3金电极；
（3）Hg2+电化学生物传感器的构建
取3～5 μL含Hg2+的溶液加入到3～5 μL功能化还原氧化石墨烯复合生物纳米材料分散液中，混合均匀；取5 μL上述混合溶液滴加在固载有Probe DNA3金电极上，在37℃恒温恒湿条件下孵育0.5～1 h后，用pH = 7～8的0.01～0.1 mol/L的PBS缓冲液清洗电极，即制备得到基于快速扫描循环伏安技术检测汞离子的电化学生物传感器。
所述的Probe DNA1结构式为：5´-TTCTTGTATAGCATCTGCA-(CH2)3-SH-3´；所述的Probe DNA2结构式为：5´-TGCAGATGCT-3´；所述的Probe DNA3结构式为：5´-TTACTAGTT-(CH2)3-SH-3´。
利用上述基于快速扫描循环伏安技术检测汞离子的电化学生物传感器用于汞离子检测的方法，包括以下步骤：
以制备得到的捕获Hg2+后结合有功能化还原氧化石墨烯复合生物纳米材料的金电极为工作电极，铂电极为辅助电极，Ag/AgCl为参比电极，置入0.1～1 mol/L 高氯酸钠（NaClO4）溶液，采用快速扫描循环伏安法（FSCV），初始电位为−0.5～0 V，终止电位为0.3～0.8 V，电位扫描速度为100～600 V/s；测定不同浓度Hg2+条件下对应的氧化峰值电流，建立Hg2+浓度与峰电流的定量关系，根据该定量关系测定未知样品中Hg2+的浓度。
本发明检测Hg2+的工作原理如下：
Probe-DNA1（5´-TTCTTGTATAGCATCTGCA-(CH2)3-SH-3´）为3´端修饰巯基（SH）的DNA单链，在AuNPs表面可以进行自组装修饰，使Probe-DNA1链固定在含纳米金的功能化还原氧化石墨烯复合生物纳米材料上。
Probe-DNA2（5´-TGCAGATGCT-3´）与Probe-DNA1的3´端10个碱基互补配对，形成双螺旋结构，作为固定Probe-DNA1的短链，使Probe-DNA1在功能化还原氧化石墨烯复合生物纳米材料上更稳定，避免倒伏。
Probe-DNA3（5´-TTACTAGTT-(CH2)3-SH-3´）为3´端修饰巯基（SH）的DNA单链，其碱基序列通过T-Hg2+-T选择性错配与Probe-DNA1的5´端9个碱基互补配对，实现对Hg2+的选择性捕获；基于Au-S键合作用，在金（Au）电极表面可以进行自组装修饰，从而固定在金电极表面。
功能化还原氧化石墨烯复合生物纳米材料的构造为：在氨基化还原氧化石墨烯上，同时结合了纳米金和电化学信号标记物二茂铁（Fc），再通过Au-S键在纳米金上组装Probe-DNA1/Probe-DNA2。由于氨基化还原氧化石墨烯比表面积大，可以结合大量的电化学信号标记物二茂铁（Fc），这就实现了电化学信号的一级放大；氨基化还原氧化石墨烯本身具有良好的电子传输性能，可以有效地拓展电极的亥姆霍兹面，电化学信号标记物二茂铁（Fc）又具有极快的电子传递动力学行为，可以采用FSCV法进行快速扫描检测，使得输出电流强度大幅度增强，这就实现了电化学信号的二级放大。
在Hg2+存在时，金电极表面Probe-DNA3和功能化还原氧化石墨烯复合生物纳米材料上的Probe-DNA1/Probe-DNA2，通过Probe-DNA3和Probe-DNA1链上胸腺嘧啶（T）与Hg2+强的亲和作用力（T-Hg2+-T错配），实现对Hg2+的捕获。于是，功能化还原氧化石墨烯复合生物纳米材料可以被结合到金电极表面。启动电化学反应，功能化还原氧化石墨烯复合生物纳米材料上面的电化学信号标记物二茂铁（Fc）即发生氧化还原反应，产生电信号。显然，汞离子浓度越高，结合的功能化还原氧化石墨烯复合生物纳米材料的数量越多，电信号越强；汞离子浓度越低，结合的功能化还原氧化石墨烯复合生物纳米材料的数量越少，电信号越弱，这就实现了汞离子的定量检测。
与低扫描速率的经典伏安法相比，快速扫描循环伏安法（FSCV）采用很高的扫描速率，可以大幅度增强输出的电化学信号强度、提高检测灵敏度，其电化学原理在于：在Hg2+存在时，功能化还原氧化石墨烯复合生物纳米材料被定量捕获到电极表面，组装固载在该材料上面的电化学信号分子二茂铁（Fc）的量也因之而确定了。在一个扫描电位窗口内，所有二茂铁（Fc）分子发生氧化还原时得失总电子数即总电量Q也就确定了。如果扫描速度越大，则扫描整个电位窗口所需要的时间t就越小，根据Q=it，电化学信号电流i就越大，因此检测灵敏度得以提高。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
（1）高灵敏度，可检测10-7～10-13 mol/L浓度级别的汞离子。
（2）高选择性，只对汞离子有特异性识别。
（3）制备简单、操作方便、检测速度快、成本低廉。
综上所述，本发明基于快速扫描循环伏安技术检测汞离子的电化学生物传感器的制备方法及其应用，其提出的电化学生物传感器，制备与检测步骤简单快速，采用T-Hg2+-T选择性错配结构解决特异性识别Hg2+问题；采用功能化还原氧化石墨烯复合生物纳米材料大幅度提高电化学信号标记物数量，采用快速扫描循环伏安法（FSCV）大幅度提高电流输出强度，实现电化学信号的二级放大，显著提高检测灵敏度；实现了对Hg2+的高选择性、高灵敏度、快速简单的准确检测，具有灵敏度高、特异性强、选择性高、可靠性高、检测时间短、易于操作、成本低廉等优点，可以实现对超低浓度汞离子的准确检测，具有良好的市场前景。
附图说明
图1为本发明电化学生物传感器的检测原理图；
图2为a.裸金电极、b.裸金电极/Probe DNA3、c.裸金电极/Probe DNA3/Hg2+/功能化还原氧化石墨烯复合生物纳米材料的阻抗图；
图3为在Hg2+浓度为10-8 mol/L时，经典伏安法（扫描速度0.01 V/s）和FSCV方法（400V/s）的氧化峰值电流强度比较图；
图4为FSCV检测不同Hg2+浓度下的氧化峰电流值关系图；
图5为Hg2+浓度对数与氧化峰电流值线性关系图；
图6为本传感器分别对浓度为10-5 mol/L的Mg2+、Cd2+、Ba2+、Pb2+、Mn2+和10-10 mol/L的Hg2+溶液进行FSCV检测的氧化峰值强度关系图。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
具体实施例一
实施例1
一种基于快速扫描循环伏安技术检测汞离子的电化学生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
（1）功能化还原氧化石墨烯复合生物纳米材料的制备
a. 氨基化还原氧化石墨烯（rGO-NH2）的预处理
取10 mg氨基化还原氧化石墨烯加入到10 mL的无水乙醇中，超声分散7 h，制备成浓度为1 mg/mL的rGO-NH2乙醇分散液；
b. AuNPs溶液合成
将70mL去离子水和5 mL 0.05 moL/L HAuCl4·4H2O 溶液加入到烧杯中，然后磁力搅拌下，加热至沸腾，在沸腾状态下，迅速加入5 mL 的0.05 moL/L柠檬酸三钠水溶液，继续煮沸，沸腾状态下继续加热搅拌40 min（可见溶液很快发生颜色变化（黑-蓝-深红）），即得AuNPs溶液；
c. rGO-NH2@AuNPs材料合成
取5mL浓度为1 mg/mL的rGO-NH2乙醇分散液，加入到20 mL AuNPs溶液中，室温搅拌15h，3000～6000 rpm条件下离心清洗三次，将沉淀加入无水乙醇，获得0.25 mg/mL的rGO-NH2@AuNPs溶液；
d. 0.05 moL/L氨基二茂铁溶液制备
取0.0201 g氨基二茂铁固体溶于2 mL无水乙醇中，超声30 min，使氨基二茂铁完全溶于无水乙醇，即得0.05 moL/L氨基二茂铁溶液；
e. rGO-NH2@AuNPs&Fc分散液制备
取30 mL 1 mg/mL的rGO-NH2@AuNPs溶液于烧杯中，向溶液中加入7 mL 15wt% 戊二醛溶液，在室温下磁力搅拌反应1～3 h，3000～6000 rpm条件下无水乙醇离心清洗三次，取下层沉淀分散于30 mL无水乙醇中，向其中加入0.5 mL 0.05 moL/L氨基二茂铁溶液，室温条件下磁力搅拌反应3～6 h，3000～6000 rpm条件下去离子水离心清洗三次，取下层沉淀分散于去离子水中，制备成浓度为1 mg/mL的rGO-NH2@AuNPs&Fc分散液；
f. 功能化还原氧化石墨烯复合生物纳米材料制备
取30 μL含7 μmol/L Probe DNA1、7μmol/L Probe DNA2和7 mmol/L三（2-羧乙基）膦（TCEP）的pH = 7～8的0.05 mol/L的PBS缓冲液，加入30 μL浓度为1 mg/mL的rGO-NH2@AuNPs&Fc分散液，在4 ℃孵育6～12 h，离心清洗三次，分散于30 μL的去离子水中，即得功能化还原氧化石墨烯复合生物纳米材料分散液；
（2）固载有Probe DNA3金电极的制备
a.将直径为2 mm的金电极依次用1 µm、0.3 µm、0.05 µm的Al2O3抛光成镜面，然后依次用由浓硝酸和水按体积比为1：1混合而成的硝酸溶液、无水乙醇、水超声洗涤1～5 min，水冲洗干净后，氮气吹干备用；
b.取7 µL含Probe DNA3和三（2-羧乙基）膦（TCEP）的PBS缓冲溶液，滴在金电极表面，在37℃恒温恒湿条件下静置20～40 min，使Probe DNA3结合到电极表面；所述的含ProbeDNA3和三（2-羧乙基）膦的PBS缓冲溶液中Probe DNA3的浓度为1～10 µmol/L以及三（2-羧乙基）膦的浓度为1～10 mmol/L，溶剂为pH = 7～8的0.01～0.1 mol/L的PBS缓冲液；
c.将步骤（2）b所得的Probe DNA3修饰电极用pH = 7～8的0.01～0.1 mol/L的PBS缓冲液淋洗，去除未与金电极结合的Probe DNA3；
d.取7 μL 3 mmol/L的3-巯基-1-丙醇（MCH）滴加到步骤（2）c处理后的电极表面，在37℃恒温恒湿条件下静置0.5～1 h，封闭电极上非活性位点，即得固载有Probe DNA3金电极；
（3）Hg2+电化学生物传感器的构建
取4 μL含Hg2+的溶液加入到4 μL功能化还原氧化石墨烯复合生物纳米材料分散液中，混合均匀；取5 μL上述混合溶液滴加在固载有Probe DNA3金电极上，在37℃恒温恒湿条件下孵育0.5～1 h后，用pH = 7～8的0.01～0.1 mol/L的PBS缓冲液清洗电极，即制备得到基于快速扫描循环伏安技术检测汞离子的电化学生物传感器。
上述Probe DNA1的结构式为：5´-TTCTTGTATAGCATCTGCA-(CH2)3-SH-3´
Probe DNA2的结构式为：5´-TGCAGATGCT-3´
Probe DNA3的结构式为：5´-TTACTAGTT-(CH2)3-SH-3´。
由图2 a.裸金电极、b.裸金电极/Probe DNA3、c.裸金电极/Probe DNA3/Hg2+/功能化还原氧化石墨烯复合生物纳米材料的阻抗图可知，相比于空白的裸金电极（曲线a），当电极表面修饰上Probe DNA3后（曲线b），电极表面的电子转移电阻（R et，也就是半圆的直径）增大，因为Probe DNA3不具有导电性，从而阻碍了电极表面的电子传递过程。然而，当电极表面修饰上Probe DNA3/Hg2+/功能化还原氧化石墨烯复合生物纳米材料时（曲线c），R et明显减小，这是因为功能化还原氧化石墨烯纳米材料具有优异的导电性，能加速电极表面的电子传递过程。根据上述R et的变化情况表明电化学生物传感器被成功地组装。
实施例2
同上述实施例1，其区别在于：
步骤（1）功能化还原氧化石墨烯复合生物纳米材料的制备中：
a. 氨基化还原氧化石墨烯（rGO-NH2）的预处理
取2 mg氨基化还原氧化石墨烯加入到100 mL的无水乙醇中，超声分散5～10 h，制备成浓度为0.02 mg/mL的rGO-NH2乙醇分散液；
b. AuNPs溶液合成
将50 mL去离子水和1 mL 0.1 moL/L HAuCl4·4H2O 溶液加入到烧杯中，然后磁力搅拌下，加热至沸腾，在沸腾状态下，迅速加入0.1 mL 的0.1 moL/L柠檬酸三钠水溶液，继续煮沸，沸腾状态下继续加热搅拌10～60 min，即得AuNPs溶液；
c. rGO-NH2@AuNPs材料合成
取1 mL浓度为0.02 mg/mL的rGO-NH2乙醇分散液，加入到10 mL AuNPs溶液中，室温搅拌6 h，3000～6000 rpm条件下离心清洗三次，保留沉淀，除去没有连接上的AuNPs和其他杂质，将沉淀加入无水乙醇，获得0.02 mg/mL的rGO-NH2@AuNPs溶液；
d. 将氨基二茂铁固体溶于无水乙醇中制成0.01moL/L氨基二茂铁溶液；
e. rGO-NH2@AuNPs&Fc分散液制备
取10mL 0.02 mg/mL的rGO-NH2@AuNPs溶液于烧杯中，向溶液中加入7 mL 15wt% 戊二醛溶液，在室温下磁力搅拌反应1～3 h，3000～6000 rpm条件下无水乙醇离心清洗三次，取下层沉淀分散于30 mL无水乙醇中，向其中加入0.5 mL 0.01 moL/L氨基二茂铁溶液，室温条件下磁力搅拌反应3～6 h，3000～6000 rpm条件下去离子水离心清洗三次，取下层沉淀分散于去离子水中，制备成浓度为0.02mg/mL的rGO-NH2@AuNPs&Fc分散液；
f. 功能化还原氧化石墨烯复合生物纳米材料制备
取10 μL含1 μmol/L Probe DNA1、1μmol/L Probe DNA2和1 mmol/L三（2-羧乙基）膦（TCEP）的pH = 7～8的0.01～0.1 mol/L的PBS缓冲液，加入10 μL浓度为2 mg/mL的rGO-NH2@AuNPs&Fc分散液，在4 ℃孵育6～12 h，离心清洗三次，分散于10 μL的去离子水中，即得功能化还原氧化石墨烯复合生物纳米材料分散液；
步骤（2）固载有Probe DNA3金电极的制备中：
a.将直径为2 mm的金电极依次用1 µm、0.3 µm、0.05 µm的Al2O3抛光成镜面，然后依次用由浓硝酸和水按体积比为1：1混合而成的硝酸溶液、无水乙醇、水超声洗涤1～5 min，水冲洗干净后，氮气吹干备用；
b.取5 µL含Probe DNA3和三（2-羧乙基）膦（TCEP）的PBS缓冲溶液，滴在金电极表面，在37℃恒温恒湿条件下静置20～40 min，使Probe DNA3结合到电极表面；
c.将步骤（2）b所得的Probe DNA3修饰电极用pH = 7～8的0.01～0.1 mol/L的PBS缓冲液淋洗，去除未与金电极结合的Probe DNA3；
d.取5 μL 5 mmol/L的3-巯基-1-丙醇（MCH）滴加到步骤（2）c处理后的电极表面，在37℃恒温恒湿条件下静置0.5～1 h，封闭电极上非活性位点，即得固载有Probe DNA3金电极；
步骤（3）Hg2+电化学生物传感器的构建中：
取3μL含Hg2+的溶液加入到3 μL功能化还原氧化石墨烯复合生物纳米材料分散液中，混合均匀；取5 μL上述混合溶液滴加在固载有Probe DNA3金电极上，在37℃恒温恒湿条件下孵育0.5～1 h后，用pH = 7～8的0.01～0.1 mol/L的PBS缓冲液清洗电极，即制备得到基于快速扫描循环伏安技术检测汞离子的电化学生物传感器。
实施例3
同上述实施例1，其区别在于：
步骤（1）功能化还原氧化石墨烯复合生物纳米材料的制备中：
a. 氨基化还原氧化石墨烯（rGO-NH2）的预处理
取20 mg氨基化还原氧化石墨烯加入到10 mL的无水乙醇中，超声分散5～10 h，制备成浓度为2 mg/mL的rGO-NH2乙醇分散液；
b. AuNPs溶液合成
将100 mL去离子水和10 mL 0.01 moL/L HAuCl4·4H2O 溶液加入到烧杯中，然后磁力搅拌下，加热至沸腾，在沸腾状态下，迅速加入10 mL 的0.01 moL/L柠檬酸三钠水溶液，继续煮沸，沸腾状态下继续加热搅拌60 min，即得AuNPs溶液；
c. rGO-NH2@AuNPs材料合成
取10 mL浓度为2 mg/mL的rGO-NH2乙醇分散液，加入到50 mL AuNPs溶液中，室温搅拌24 h，3000～6000 rpm条件下离心清洗三次，保留沉淀，除去没有连接上的AuNPs和其他杂质，将沉淀加入无水乙醇，获得2 mg/mL的rGO-NH2@AuNPs溶液；
d. 将氨基二茂铁固体溶于无水乙醇中制成0. 1moL/L氨基二茂铁溶液；
e. rGO-NH2@AuNPs&Fc分散液制备
取50 mL 2 mg/mL的rGO-NH2@AuNPs溶液于烧杯中，向溶液中加入10 mL 25wt% 戊二醛溶液，在室温下磁力搅拌反应1～3 h，3000～6000 rpm条件下无水乙醇离心清洗三次，取下层沉淀分散于50 mL无水乙醇中，向其中加入1 mL 0.1 moL/L氨基二茂铁溶液，室温条件下磁力搅拌反应3～6 h，3000～6000 rpm条件下去离子水离心清洗三次，取下层沉淀分散于去离子水中，制备成浓度为0.02～2 mg/mL的rGO-NH2@AuNPs&Fc分散液；
f. 功能化还原氧化石墨烯复合生物纳米材料制备
取50 μL含10 μmol/L Probe DNA1、10 μmol/L Probe DNA2和10 mmol/L三（2-羧乙基）膦（TCEP）的pH = 7～8的0.01～0.1 mol/L的PBS缓冲液，加入50 μL浓度为2 mg/mL的rGO-NH2@AuNPs&Fc分散液，在4 ℃孵育6～12 h，离心清洗三次，分散于50 μL的去离子水中，即得功能化还原氧化石墨烯复合生物纳米材料分散液；
步骤（2）固载有Probe DNA3金电极的制备中：
a.将直径为2 mm的金电极依次用1 µm、0.3 µm、0.05 µm的Al2O3抛光成镜面，然后依次用由浓硝酸和水按体积比为1：1混合而成的硝酸溶液、无水乙醇、水超声洗涤1～5 min，水冲洗干净后，氮气吹干备用；
b.取10 µL含Probe DNA3和三（2-羧乙基）膦（TCEP）的PBS缓冲溶液，滴在金电极表面，在37℃恒温恒湿条件下静置20～40 min，使Probe DNA3结合到电极表面；
c.将步骤（2）b所得的Probe DNA3修饰电极用pH = 7～8的0.01～0.1 mol/L的PBS缓冲液淋洗，去除未与金电极结合的Probe DNA3；
d.取10 μL 5 mmol/L的3-巯基-1-丙醇（MCH）滴加到步骤（2）c处理后的电极表面，在37℃恒温恒湿条件下静置0.5～1 h，封闭电极上非活性位点，即得固载有Probe DNA3金电极；
步骤（3）Hg2+电化学生物传感器的构建中：
取5 μL含Hg2+的溶液加入到5 μL功能化还原氧化石墨烯复合生物纳米材料分散液中，混合均匀；取5 μL上述混合溶液滴加在固载有Probe DNA3金电极上，在37℃恒温恒湿条件下孵育0.5～1 h后，用pH = 7～8的0.01～0.1 mol/L的PBS缓冲液清洗电极，即制备得到基于快速扫描循环伏安技术检测汞离子的电化学生物传感器。
具体实施例二
利用具体实施例一制备的基于快速扫描循环伏安技术检测汞离子的电化学生物传感器用于汞离子检测的方法，其检测原理如图1所示，包括以下步骤：
以制备得到的捕获Hg2+后结合有功能化还原氧化石墨烯复合生物纳米材料的金电极为工作电极，铂电极为辅助电极，Ag/AgCl为参比电极，置入0.1～1 mol/L 高氯酸钠（NaClO4）溶液，采用快速扫描循环伏安法（FSCV），初始电位为−0.5～0 V，终止电位为0.3～0.8 V，电位扫描速度为100～600 V/s；测定不同浓度Hg2+条件下对应的氧化峰值电流，建立Hg2+浓度与峰电流的定量关系，根据该定量关系测定未知样品中Hg2+的浓度。
由图3可知，对比在Hg2+浓度为10-8 mol/L时，经典伏安法（扫描速度0.01 V/s）和FSCV方法（400 V/s）的氧化峰值电流强度比较图，可见高扫描速率下电流强度明显增大。
由图4可知，在400 V/s的电极电位扫描速率下，FSCV检测不同浓度（5×10-7～10-13mol/L）的Hg2+离子存在时传感器的电流，随着Hg2+浓度增大，电流强度依次增大。
由图5可知，不同浓度Hg2+的电流大小(y)—浓度(x)对数线性关系，线性方程为y =0.164*logx + 2.471，相关系数R = 0.995，线性关系良好，可以用于未知样品中Hg2+检测。
具体实施例三
为验证本方法在实际应用中的价值，在自来水中加入Hg2+标准溶液作为实际样品，采用加标回收的方法对自来水中不同浓度的Hg2+进行了检测，结果如表1所示。相对标准偏差（RSD）小于6.5%，回收率为97.4～108.8%，结果令人满意。表明本发明对于水样中Hg2+的检测结果准确可靠。
表1 自来水中Hg2+的检测结果（n = 5）
。
具体实施例四
由图6可知，利用具体实施例一制备的传感器分别对浓度为10-5 mol/L的Mg2+、Cd2+、Ba2 +、Pb2+、Mn2+和10-10 mol/L的Hg2+溶液进行FSCV检测的电流信号响应进行比较分析，当Hg2+存在时，检测的电流信号强度远远大于干扰金属离子电流响应，表明该传感器对Hg2+具有特异性检测。
以上结果说明，本发明研究出一种高灵敏度、高选择性的基于快速扫描循环伏安技术检测汞离子的方法，该方法具有简单、快速、易于操作等优点，且双通道信号之间互相比对，结果准确可靠，具有良好的应用前景。
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种基于快速扫描循环伏安技术检测汞离子的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）功能化还原氧化石墨烯复合生物纳米材料的制备
a. 氨基化还原氧化石墨烯的预处理
取2～20 mg氨基化还原氧化石墨烯加入到10～100 mL的无水乙醇中，超声分散5～10h，制备成浓度为0.02～2 mg/mL的rGO-NH2乙醇分散液；
b. AuNPs溶液合成
将50～100 mL去离子水和1～10 mL 0.01～0.1 moL/L HAuCl4·4H2O 溶液加入到烧杯中，然后磁力搅拌下，加热至沸腾，在沸腾状态下，迅速加入0.1～10 mL 的0.01～0.1 moL/L柠檬酸三钠水溶液，继续煮沸，沸腾状态下继续加热搅拌10～60 min，即得AuNPs溶液；
c. rGO-NH2@AuNPs材料合成
取1～10 mL浓度为0.02～2 mg/mL的rGO-NH2乙醇分散液，加入到10～50 mL AuNPs溶液中，室温搅拌6～24 h，3000～6000 rpm条件下离心清洗三次，保留沉淀，将沉淀加入无水乙醇，获得0.02～2 mg/mL的rGO-NH2@AuNPs溶液；
d. 0.01～0.1 moL/L氨基二茂铁溶液制备
取0.004～0.04 g氨基二茂铁固体溶于0.2～2 mL无水乙醇中，超声10～50 min，使氨基二茂铁完全溶于无水乙醇，即得0.01～0.1 moL/L氨基二茂铁溶液；
e. rGO-NH2@AuNPs&Fc分散液制备
取10～50 mL 0.02～2 mg/mL的rGO-NH2@AuNPs溶液于烧杯中，向溶液中加入1～10 mL5～25wt% 戊二醛溶液，在室温下磁力搅拌反应1～3 h，3000～6000 rpm条件下无水乙醇离心清洗三次，取下层沉淀分散于10～50 mL无水乙醇中，向其中加入0.1～1 mL 0.01～0.1moL/L氨基二茂铁溶液，室温条件下磁力搅拌反应3～6 h，3000～6000 rpm条件下去离子水离心清洗三次，取下层沉淀分散于去离子水中，制备成浓度为0.02～2 mg/mL的rGO-NH2@AuNPs&Fc分散液；
f. 功能化还原氧化石墨烯复合生物纳米材料制备
取10～50 μL含1～10 μmol/L Probe DNA1、1～10 μmol/L Probe DNA2和1～10 mmol/L三（2-羧乙基）膦的pH = 7～8的0.01～0.1 mol/L的PBS缓冲液，加入10～50 μL浓度为0.02～2 mg/mL的rGO-NH2@AuNPs&Fc分散液，在4 ℃孵育6～12 h，离心清洗三次，分散于10～50 μL的去离子水中，即得功能化还原氧化石墨烯复合生物纳米材料分散液；
（2）固载有Probe DNA3金电极的制备
a.将直径为2 mm的金电极依次用1 µm、0.3 µm、0.05 µm的Al2O3抛光成镜面，然后依次用由浓硝酸和水按体积比为1：1混合而成的硝酸溶液、无水乙醇、水超声洗涤1～5 min，水冲洗干净后，氮气吹干备用；
b.取5～10 µL含Probe DNA3和三（2-羧乙基）膦的PBS缓冲溶液，滴在金电极表面，在37℃恒温恒湿条件下静置20～40 min；所述的含Probe DNA3和三（2-羧乙基）膦的PBS缓冲溶液中Probe DNA3的浓度为1～10 µmol/L以及三（2-羧乙基）膦的浓度为1～10 mmol/L，溶剂为pH = 7～8的0.01～0.1 mol/L的PBS缓冲液；
c.将步骤（2）b所得的Probe DNA3修饰电极用pH = 7～8的0.01～0.1 mol/L的PBS缓冲液淋洗；
d.取5～10 μL 1～5 mmol/L的3-巯基-1-丙醇滴加到步骤（2）c处理后的电极表面，在37℃恒温恒湿条件下静置0.5～1 h，即得固载有Probe DNA3金电极；
（3）Hg2+电化学生物传感器的构建
取3～5 μL含Hg2+的溶液加入到3～5 μL功能化还原氧化石墨烯复合生物纳米材料分散液中，混合均匀；取5 μL上述混合溶液滴加在固载有Probe DNA3金电极上，在37℃恒温恒湿条件下孵育0.5～1 h后，用pH = 7～8的0.01～0.1 mol/L的PBS缓冲液清洗电极，即制备得到基于快速扫描循环伏安技术检测汞离子的电化学生物传感器。
2.根据权利要求1所述的基于快速扫描循环伏安技术检测汞离子的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于所述的Probe DNA1结构式为：5´-TTCTTGTATAGCATCTGCA-(CH2)3-SH-3´；所述的Probe DNA2结构式为：5´-TGCAGATGCT-3´；所述的Probe DNA3结构式为：5´-TTACTAGTT-(CH2)3-SH-3´。
3.一种利用权利要求1-2中任一项所述的基于快速扫描循环伏安技术检测汞离子的电化学生物传感器用于汞离子检测的方法，其特征在于包括以下步骤：
以制备得到的捕获Hg2+后结合有功能化还原氧化石墨烯复合生物纳米材料的金电极为工作电极，铂电极为辅助电极，Ag/AgCl为参比电极，置入0.1～1 mol/L 高氯酸钠溶液，采用快速扫描循环伏安法，初始电位为−0.5～0 V，终止电位为0.3～0.8 V，电位扫描速度为100～600 V/s；测定不同浓度Hg2+条件下对应的氧化峰值电流，建立Hg2+浓度与峰电流的定量关系，根据该定量关系测定未知样品中Hg2+的浓度。
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