CN103091302A - 基于3D纸芯片电致化学发光DNA传感器的制备并用于同时检测Hg2+、Ag+ - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于3D纸芯片电致化学发光DNA传感器的制备并用于同时检测Hg2+、Ag+。传感器制备方法（示意图见附图），包括以下步骤：在计算机上设计微流控芯片图案，制备3D纸芯片传感器；按照现有方法制备多空金纳米线、PdAg合金、碳点及P酸等纳米材料，制备具有信号放大作用的PdAgCQDs,PdAgP-acid作为ECL探针，分别与Hg2+、Ag+进行特异性结合的DNA进行复合；利用电极表面修饰技术，将多空金纳米线修饰到传感器电极表面，吸附DNA片段，制备DNA传感器。一种同时检测Hg2+、Ag+的方法，包括如下步骤：将修饰好的电极连接到电致化学发光仪，对样品提取液中的Hg2+、Ag+进行检测。本发明的电极的特异性强，灵敏度高，可达p摩尔级；使用易处理的纸芯片传感器，实现同一电极上对两种物质进行同时检测，提高了检测效率，降低成本。
Description
技术领域
本发明涉及痕量重金属离子检测技术领域，更具体地说是一种能够同时检测两种重金属离子的基于3D纸芯片电致化学发光(ECL)DNA传感器的制备，本发明还涉及采用所述DNA传感器检测水样、血样、及食品的方法。
背景技术
重金属是指密度大于4或5 g/cm-3的一类金属元素。随着人口快速增长、现代工业技术的迅速发展，许多有害物质进入土壤系统，河流、海洋等地表水系统，并通过循环富集作用进入到动植物体内，进而严重影响到人类的身体健康。目前，由重金属污染引发的环境和健康问题已经成为备受关注的全球性问题之一，我国的重金属污染也十分严重。有资料表明，我国重金属污染的农业土地面积约为2500万m2，每年被重金属污染的粮食多达1200万吨，经济损失大于200亿元。不仅如此，重金属污染还通过食物链直接对人体健康造成了严重危害。
目前，工业“三废”排放、燃煤释放、生活垃圾渗出、采矿及冶金。及汽车尾气排放等造成了我国重金属污染的主要来源。这些重金属离子如Hg2+、Ag+, 其用途比较广泛，如在冶金工业、产品制造业等领域均具有广泛的应用，但是一旦排放过量，渗入到土壤、水中，这些重金属在水中不能被分解，在微生物的作用下能够转化为毒性更强的金属化合物。生物在环境中摄取重金属，通过食物链在动植物体内不断富集，最后通过食物链使人体中毒，危害人类的健康。
建立一种高灵敏度和特异性的快速检测重金属的方法，便成为当前该研究领域亟需解决的问题之一。目前检测重金属离子的方法主要有（1）原子荧光光度法，其特点是灵敏度较高，线性范围打，但是测定的金属种类有限；（2）电感耦合等离子体质谱法，其检出限比原子吸收发要低一些，但是价格昂贵，容易受到污染；（3）高效液相色谱法，该方法可以实现多种元素的同时测定，但是络合剂选择有限，具有局限性；（4）酶分析法，特点是特异性强，操作简单，但是可选择酶的种类有限，可测的重金属种类较少；（5）免疫分析法，其灵敏度高、特异性强，但是操作步骤比较复杂，而且试剂昂贵，成本比较高。（6）生物传感器如DNA传感器，通过检测电信号、光信号或其他信号等来判断待测物质的量，该传感器操作简单，灵敏度高；但像普通的DNA传感器，均需要PCR扩增，在样品的处理过程中DNA的变性作用及改方法的最大检测限度使其在当前的应用发展中受到了限制。
以上几种方法对于重金属的检测和分析，虽然都有优点，但是又都存在自身的局限性，因此迫切需要开发各种特异性强、灵敏度高、低成本、速度快、检测范围广的分析检测方法和技术来适应形势的发展。
发明内容
本发明的目的是提供一种3D纸芯片ECL DNA传感器的制备及应用，本发明以可分辨的电势电位为基础，建立了在同一工作电极上快速同时检测Hg2+、Ag+的方法，成功建立了样品处理简单、检测速度快、成本低、灵敏度高、特异性强的检测不同样品中Hg2+、Ag+的传感器。
为了解决上述技术问题，本发明是通过以下措施来实现的：一种基于3D纸芯片ECL DNA传感器的制备方法，其特征是包括以下步骤：
(1) 选择能用于修饰电极表面的多孔金纳米线，修饰到纸电极表面，制备金膜自组装传感器。
(2) 选择能够分别与Hg2+、Ag+进行特异性结合的DNA片段，利用自组装技术修饰到(1)处理过的电极表面。
(3) 选择不同的样品进行处理，利用自组装技术与(2)中的DNA片段分别进行特异性结合。
(4) 利用现有方法，制备能够在负电势下产生光信号的量子点。
(5) 利用现有方法，制备能够在正电势下产生光信号的功能纳米分子。
(6) 制备能够增强电子传递，起信号放大作用的多孔纳米材料。
(7) 利用层层自组装表面修饰技术等，将(6)分别与(4)和(5)制备的材料复合，制作具有信号放大作用的ECL探针。
本发明所述负电势发光量子点为CdTe、CdS、碳点(CQDs)；正电势发光分子为三联钌吡啶、鲁米诺、P酸(P-acid)；多孔纳米材料为多孔银(NPS)、多空金(NPG)、PtAg合金、PtCu合金、PdAg合金、PdCu合金。
本发明按上述方法制得所述CQDs、P酸分别与NPS复合，形成具有信号放大作用的PdAgCQDs, PdAgP-acid作为ECL探针，构建基于3D纸芯片的ECL DNA传感器，在同一工作电极上同时检测Hg2+、Ag+，包括以下步骤：
(1) 在计算机上设计微流控纸芯片的疏水区的打印图案，将滤纸裁剪成打印机所需尺寸(例如A4等)放到喷蜡打印机中，将疏水区打印到滤纸上。
(2) 将(1)中打印的滤纸进行丝网印刷，将工作电极、参比电极、对电极印刷到与疏水区匹配的区域。
(3) 将(2)中制备好的滤纸放置到加热器或者烘箱中，在70-140℃摄氏度下加热1-3 min。
(4) 将制备的整张滤纸按照蜡打印的图案进行裁剪，得到单个微流控3D纸芯片ECL传感器。
(5) 将制备的多孔金纳米线修饰到工作电极表面。
(6) 将制备的PdAg合金纳米材料溶液冰水浴超声处理10 - 30 min，得到分散的合金材料溶液。
(7) 将制备的碳点溶液离心处理5 - 10 min，除去不发光的沉淀，得到分散的碳点溶液。
(8) 将制备的P酸溶液超声处理10 - 30 min，得到分散的碳点材料溶液。
(9) 将步骤(6)制备的PdAg合金分别与步骤(7)、步骤(8)中制备的碳点、P酸溶液混合，超声处理15-30 min，之后离心处理5 - 10 min，除去沉淀，得到分散的PdAgCQDs, PdAgP-acid溶液。
(10) 将步骤(9)制备的PdAgCQDs, PdAgP-acid溶液与分别能与Hg2+、Ag+进行特异性结合的DNA片段混合，磁力搅拌1-2 h, 之后进行离心处理10 - 15 min，得到相应的单分散溶液。
(11) 将步骤(10)制备的溶液修饰到电极表面，用二次水冲洗掉没结合上的DNA，在室温下干燥3 - 5 min。
(12) 将一定浓度的含有Hg2+、Ag+样品滴加到步骤(11)中制备的DNA传感器表面，反应20-30 min, 用二次水冲洗没结合上的Hg2+、Ag+，放到检测池中进行ECL测定。
本发明所述的3D ECL传感器为可折叠的纸芯片传感器；所述的工作电极为多孔金纳米线修饰电极电极（Ф=2mm）；所述的含有Hg2+、Ag+的样品为自来水、矿泉水、血样、鱼肉、海带。
本发明的有益效果：
1. 基于3D纸芯片制备的ECL传感器，体积小，携带方便，便于使用和处理，并且降低了成本。
2. 在同一在纸芯片上可以同时印有多个工作电极，将同一样品进行重复测定，提高了结果的准确度。
3. 利用电势可控技术，制备了可分别在正电势和负电势发光的ECL探针，并用于分别标记不同的DNA, 实现同一电极上对两种物质进行同时检测，提高了检测的效率，并降低了成本。
4. 本发明的基于纸芯片的DNA传感器特异性强，样品中其它非特异性分子对检测结果无影响；采用信号放大技术，灵敏度高，可以达到p摩尔级；检测速度快，完成一个基本检测过程仅需1 - 2 min的时间，可在短时间内实现大量样本的高通量筛选，试剂用量少，检测一个样品只需要几微升试剂。
5. 本发明操作快速简单，检测结果均由仪器自动完成和记录，避免了主观因素的影响，重复性好，一个纸芯片上两个工作电极进行批间测定，结果稳定。
附图说明
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步详细描述。
图1.为3D纸芯片DNA传感器的构建及检测Hg2+、Ag+的示意图。工作电极(WE)，参比电极(RE)，对电极(CE)；DNA为PdAgCQDs, PdAgP-acid分别标记能与Hg2+、Ag+进行特异性结合的DNA片段；两个工作电极进行批间测定。
具体实施方式
实施例1（自来水的检测）
一种基于3D纸芯片ECL DNA传感器的制备及同时检测Hg2+、Ag+的方法，包括以下步骤：
(1) 取日常生活中使用的自来水10 mL 作为待测样品。
(2) 在计算机上设计微流控纸芯片的疏水区的打印图案，用丝网印刷技术将工作电极、参比电极、对电极印刷到与疏水区匹配的区域，将制备好的滤纸放置到加热器中，在90℃摄氏度下加热2 min，然后将整张滤纸按照蜡打印的图案进行裁剪，得到单个微流控3D纸芯片ECL传感器。
(3) 多孔金纳米线的制备：将Au0.18Ag0.82合金纳米线至于一芯片载体上，取体积分数为25%的稀HNO3溶液滴加到上面，腐蚀5 min，用二次水冲洗，将得到的多空金纳米线修饰到电极表面。
(4) 碳点的制备：在一电解池中以碳棒作为工作电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂网作为对电极，在pH 7.0 磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液中利用电化学工作站施加 (-3.0) V - (+3.0) V 电压（扫速 100 mV/S），扫描8 min。离心处理5 min，得到分散的碳点溶液。
(5) P酸的制备：利用现有方法合成1,4-二乙炔基-2,5-二甲氧基苯，将其加入到N(CH2CH3)3和THF体积比为1:3的的混合溶液中，加入对碘苯甲酸甲酯、Pd(PPh3)2Cl2和CuI，在N2保护下回流12 h。将反应液转移至分液漏斗，依次用饱和NH4Cl溶液、CH2Cl2、饱和NaCl溶液洗涤，分液，去水层。最后加入Na2SO4除水，用CHCl3溶解，再用Et2O洗去杂质，过滤，旋蒸，得到棕色固体产物，即1,4-二（对乙炔基苯甲酸甲酯）-2,5-二甲氧基苯。取上述产物0.1 g加入15 mL THF、1.0 g KOH、8 mL CH3OH，70 °C回流搅拌5 h。加入10 mL 10 % HCl溶液、碱，50 mL水。用CHCl3萃取，除水，旋蒸，得到黄色粉末状固体产物，即1.4-二（对乙炔基苯甲酸）-2,5-二甲氧基苯（p-酸）。
(6) PdAg合金的制备：将Ag23Al77合金置于1 mol/L NaOH溶液中，30℃下磁力搅拌72 h，得到的多孔银用二次水冲洗，并取5 mg 迅速加入到75 mL K2PdCl4 (1.2 mmol/L)溶液中，5℃下磁力搅拌2 h。将制备的PdAg合金纳米材料溶液冰水浴超声处理15 min，得到分散的合金材料溶液。
(7) 将步骤(6)制备的PdAg合金分别与步骤(4)、步骤(5)中制备的碳点、P酸溶液混合，分别超声处理15 min、20 min，之后离心处理5 min，除去沉淀，得到分散的PdAgCQDs, PdAgP-acid溶液。
(8) 将步骤(7)制备的PdAgCQDs, PdAgP-acid溶液与分别能与Hg2+、Ag+进行特异性结合的DNA片段混合，磁力搅拌1 h, 之后进行离心处理10 min，得到相应的单分散溶液。
(9) 将步骤(8)制备的溶液修饰到电极表面，用二次水冲洗掉没结合上的DNA，在室温下干燥3 min。
(10) 将自来水样品滴加到步骤(9)中制备的DNA传感器表面，反应25 min, 用二次水冲洗没结合上的Hg2+、Ag+，放到检测池中进行ECL测定。最低检测线为Hg2+ 0.5 nmol/L，Ag+ 1 nmol/L。
实施例2 (矿泉水的检测)
一种基于3D纸芯片ECL DNA传感器的制备及同时检测Hg2+、Ag+的方法，包括以下步骤：
(1) 取从超市中购买的农夫山泉水10 mL 作为待测样品。
(2) 在计算机上设计微流控纸芯片的疏水区的打印图案，用丝网印刷技术将工作电极、参比电极、对电极印刷到与疏水区匹配的区域，将制备好的滤纸放置到加热器中，在90℃摄氏度下加热2 min，然后将整张滤纸按照蜡打印的图案进行裁剪，得到单个微流控3D纸芯片ECL传感器。
(3) 多孔金纳米线的制备：将Au0.18Ag0.82合金纳米线至于一芯片载体上，取体积分数为25%的稀HNO3溶液滴加到上面，腐蚀5 min，用二次水冲洗，将得到的多空金纳米线修饰到电极表面。
(4) 碳点的制备：在一电解池中以碳棒作为工作电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂网作为对电极，在pH 7.0 磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液中利用电化学工作站施加 (-3.0) V - (+3.0) V 电压（扫速 100 mV/S），扫描8 min。离心处理5 min，得到分散的碳点溶液。
(5) P酸的制备：利用现有方法合成1,4-二乙炔基-2,5-二甲氧基苯，将其加入到N(CH2CH3)3和THF体积比为1:3的的混合溶液中，加入对碘苯甲酸甲酯、Pd(PPh3)2Cl2和CuI，在N2保护下回流12 h。将反应液转移至分液漏斗，依次用饱和NH4Cl溶液、CH2Cl2、饱和NaCl溶液洗涤，分液，去水层。最后加入Na2SO4除水，用CHCl3溶解，再用Et2O洗去杂质，过滤，旋蒸，得到棕色固体产物，即1,4-二（对乙炔基苯甲酸甲酯）-2,5-二甲氧基苯。取上述产物0.1 g加入15 mL THF、1.0 g KOH、8 mL CH3OH，70 °C回流搅拌5 h。加入10 mL 10 % HCl溶液、碱，50 mL水。用CHCl3萃取，除水，旋蒸，得到黄色粉末状固体产物，即1.4-二（对乙炔基苯甲酸）-2,5-二甲氧基苯（p-酸）。
(6) PdAg合金的制备：将Ag23Al77合金置于1 mol/L NaOH溶液中，30℃下磁力搅拌72 h，得到的多孔银用二次水冲洗，并取5 mg 迅速加入到75 mL K2PdCl4 (1.2 mmol/L)溶液中，5℃下磁力搅拌2 h。将制备的PdAg合金纳米材料溶液冰水浴超声处理15 min，得到分散的合金材料溶液。
(7) 将步骤(6)制备的PdAg合金分别与步骤(4)、步骤(5)中制备的碳点、P酸溶液混合，分别超声处理15 min、20 min，之后离心处理5 min，除去沉淀，得到分散的PdAgCQDs, PdAgP-acid溶液。
(8) 将步骤(7)制备的PdAgCQDs, PdAgP-acid溶液与分别能与Hg2+、Ag+进行特异性结合的DNA片段混合，磁力搅拌1 h, 之后进行离心处理10 min，得到相应的单分散溶液。
(9) 将步骤(8)制备的溶液修饰到电极表面，用二次水冲洗掉没结合上的DNA，在室温下干燥3 min。
(10) 将农夫山泉水样品滴加到步骤(9)中制备的DNA传感器表面，反应20 min, 用二次水冲洗没结合上的Hg2+、Ag+，放到检测池中进行ECL测定。最低检测线为Hg2+ 50 pmol/L，Ag+ 65 pmol/L。
实施例3 (血液的测定)
一种基于3D纸芯片ECL DNA传感器的制备及同时检测Hg2+、Ag+的方法，包括以下步骤：
(1) 取从肿瘤医院获得的病人血清2 mL 作为待测样品，将血清稀释10倍进行检测。
(2) 在计算机上设计微流控纸芯片的疏水区的打印图案，用丝网印刷技术将工作电极、参比电极、对电极印刷到与疏水区匹配的区域，将制备好的滤纸放置到加热器中，在90℃摄氏度下加热2 min，然后将整张滤纸按照蜡打印的图案进行裁剪，得到单个微流控3D纸芯片ECL传感器。
(3) 多孔金纳米线的制备：将Au0.18Ag0.82合金纳米线至于一芯片载体上，取体积分数为25%的稀HNO3溶液滴加到上面，腐蚀5 min，用二次水冲洗，将得到的多空金纳米线修饰到电极表面。
(4) 碳点的制备：在一电解池中以碳棒作为工作电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂网作为对电极，在pH 7.0 磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液中利用电化学工作站施加 (-3.0) V - (+3.0) V 电压（扫速 100 mV/S），扫描8 min。离心处理5 min，得到分散的碳点溶液。
(5) P酸的制备：利用现有方法合成1,4-二乙炔基-2,5-二甲氧基苯，将其加入到N(CH2CH3)3和THF体积比为1:3的的混合溶液中，加入对碘苯甲酸甲酯、Pd(PPh3)2Cl2和CuI，在N2保护下回流12 h。将反应液转移至分液漏斗，依次用饱和NH4Cl溶液、CH2Cl2、饱和NaCl溶液洗涤，分液，去水层。最后加入Na2SO4除水，用CHCl3溶解，再用Et2O洗去杂质，过滤，旋蒸，得到棕色固体产物，即1,4-二（对乙炔基苯甲酸甲酯）-2,5-二甲氧基苯。取上述产物0.1 g加入15 mL THF、1.0 g KOH、8 mL CH3OH，70 °C回流搅拌5 h。加入10 mL 10 % HCl溶液、碱，50 mL水。用CHCl3萃取，除水，旋蒸，得到黄色粉末状固体产物，即1.4-二（对乙炔基苯甲酸）-2,5-二甲氧基苯（p-酸）。
(6) PdAg合金的制备：将Ag23Al77合金置于1 mol/L NaOH溶液中，30℃下磁力搅拌72 h，得到的多孔银用二次水冲洗，并取5 mg 迅速加入到75 mL K2PdCl4 (1.2 mmol/L)溶液中，5℃下磁力搅拌2 h。将制备的PdAg合金纳米材料溶液冰水浴超声处理15 min，得到分散的合金材料溶液。
(7) 将步骤(6)制备的PdAg合金分别与步骤(4)、步骤(5)中制备的碳点、P酸溶液混合，分别超声处理15 min、20 min，之后离心处理5 min，除去沉淀，得到分散的PdAgCQDs, PdAgP-acid溶液。
(8) 将步骤(7)制备的PdAgCQDs, PdAgP-acid溶液与分别能与Hg2+、Ag+进行特异性结合的DNA片段混合，磁力搅拌1 h, 之后进行离心处理10 min，得到相应的单分散溶液。
(9) 将步骤(8)制备的溶液修饰到电极表面，用二次水冲洗掉没结合上的DNA，在室温下干燥3 min。
(10) 将稀释10倍的病人血清滴加到步骤(9)中制备的DNA传感器表面，反应20 min, 用二次水冲洗没结合上的Hg2+、Ag+，放到检测池中进行ECL测定。最低检测线为Hg2+ 20 pmol/L，Ag+ 0.1 nmol/L。
实施例4 (鱼肉的检测)
一种基于3D纸芯片ECL DNA传感器的制备及同时检测Hg2+、Ag+的方法，包括以下步骤：
(1) 取从市场中购买的带鱼作为待测样品。称取带鱼肉20g，按重量体积比g/mL为1:10 浸入正己烷中脱脂，将鱼肉搅拌均匀，4℃浸提过夜，冷冻离心，收集上层液，取5mL上层液缓慢加至质量浓度30%的饱和硫酸铵，4℃下静置过夜，6000r离心沉淀，对上层清液再缓慢加至质量浓度50%饱和硫酸铵，静置30min，离心，将离心后沉淀物溶解在PBS中，装入透析袋对蒸馏水透析3h，即得带鱼样品待测液，取待测液1mL进行检测；
(2) 在计算机上设计微流控纸芯片的疏水区的打印图案，用丝网印刷技术将工作电极、参比电极、对电极印刷到与疏水区匹配的区域，将制备好的滤纸放置到加热器中，在90℃摄氏度下加热2 min，然后将整张滤纸按照蜡打印的图案进行裁剪，得到单个微流控3D纸芯片ECL传感器。
(3) 多孔金纳米线的制备：将Au0.18Ag0.82合金纳米线至于一芯片载体上，取体积分数为25%的稀HNO3溶液滴加到上面，腐蚀5 min，用二次水冲洗，将得到的多空金纳米线修饰到电极表面。
(4) 碳点的制备：在一电解池中以碳棒作为工作电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂网作为对电极，在pH 7.0 磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液中利用电化学工作站施加 (-3.0) V - (+3.0) V 电压（扫速 100 mV/S），扫描8 min。离心处理5 min，得到分散的碳点溶液。
(5) P酸的制备：利用现有方法合成1,4-二乙炔基-2,5-二甲氧基苯，将其加入到N(CH2CH3)3和THF体积比为1:3的的混合溶液中，加入对碘苯甲酸甲酯、Pd(PPh3)2Cl2和CuI，在N2保护下回流12 h。将反应液转移至分液漏斗，依次用饱和NH4Cl溶液、CH2Cl2、饱和NaCl溶液洗涤，分液，去水层。最后加入Na2SO4除水，用CHCl3溶解，再用Et2O洗去杂质，过滤，旋蒸，得到棕色固体产物，即1,4-二（对乙炔基苯甲酸甲酯）-2,5-二甲氧基苯。取上述产物0.1 g加入15 mL THF、1.0 g KOH、8 mL CH3OH，70 °C回流搅拌5 h。加入10 mL 10 % HCl溶液、碱，50 mL水。用CHCl3萃取，除水，旋蒸，得到黄色粉末状固体产物，即1.4-二（对乙炔基苯甲酸）-2,5-二甲氧基苯（p-酸）。
(6) PdAg合金的制备：将Ag23Al77合金置于1 mol/L NaOH溶液中，30℃下磁力搅拌72 h，得到的多孔银用二次水冲洗，并取5 mg 迅速加入到75 mL K2PdCl4 (1.2 mmol/L)溶液中，5℃下磁力搅拌2 h。将制备的PdAg合金纳米材料溶液冰水浴超声处理15 min，得到分散的合金材料溶液。
(7) 将步骤(6)制备的PdAg合金分别与步骤(4)、步骤(5)中制备的碳点、P酸溶液混合，分别超声处理15 min、20 min，之后离心处理5 min，除去沉淀，得到分散的PdAgCQDs, PdAgP-acid溶液。
(8) 将步骤(7)制备的PdAgCQDs, PdAgP-acid溶液与分别能与Hg2+、Ag+进行特异性结合的DNA片段混合，磁力搅拌1 h, 之后进行离心处理10 min，得到相应的单分散溶液。
(9) 将步骤(8)制备的溶液修饰到电极表面，用二次水冲洗掉没结合上的DNA，在室温下干燥3 min。
(10) 将带鱼液样品滴加到步骤(9)中制备的DNA传感器表面，反应25 min, 用二次水冲洗没结合上的Hg2+、Ag+，放到检测池中进行ECL测定。最低检测线为Hg2+ 5 nmol/L，Ag+ 2 nmol/L。
实施例5 (海带的检测)
一种基于3D纸芯片ECL DNA传感器的制备及同时检测Hg2+、Ag+的方法，包括以下步骤：
(1) 取从市场中购买的海带作为待测样品。称取带海带20g，按重量体积比g/mL为1:10 浸入正己烷中脱脂，将海带搅拌均匀，4℃浸提过夜，冷冻离心，收集上层液，取5mL上层液缓慢加至质量浓度30%的饱和硫酸铵，4℃下静置过夜，6000r离心沉淀，对上层清液再缓慢加至质量浓度50%饱和硫酸铵，静置30min，离心，将离心后沉淀物溶解在PBS中，装入透析袋对蒸馏水透析3h，即得海带样品待测液，取待测液1mL进行检测；
(2) 在计算机上设计微流控纸芯片的疏水区的打印图案，用丝网印刷技术将工作电极、参比电极、对电极印刷到与疏水区匹配的区域，将制备好的滤纸放置到加热器中，在90℃摄氏度下加热2 min，然后将整张滤纸按照蜡打印的图案进行裁剪，得到单个微流控3D纸芯片ECL传感器。
(3) 多孔金纳米线的制备：将Au0.18Ag0.82合金纳米线至于一芯片载体上，取体积分数为25%的稀HNO3溶液滴加到上面，腐蚀5 min，用二次水冲洗，将得到的多空金纳米线修饰到电极表面。
(4) 碳点的制备：在一电解池中以碳棒作为工作电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂网作为对电极，在pH 7.0 磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液中利用电化学工作站施加 (-3.0) V - (+3.0) V 电压（扫速 100 mV/S），扫描8 min。离心处理5 min，得到分散的碳点溶液。
(5) P酸的制备：利用现有方法合成1,4-二乙炔基-2,5-二甲氧基苯，将其加入到N(CH2CH3)3和THF体积比为1:3的的混合溶液中，加入对碘苯甲酸甲酯、Pd(PPh3)2Cl2和CuI，在N2保护下回流12 h。将反应液转移至分液漏斗，依次用饱和NH4Cl溶液、CH2Cl2、饱和NaCl溶液洗涤，分液，去水层。最后加入Na2SO4除水，用CHCl3溶解，再用Et2O洗去杂质，过滤，旋蒸，得到棕色固体产物，即1,4-二（对乙炔基苯甲酸甲酯）-2,5-二甲氧基苯。取上述产物0.1 g加入15 mL THF、1.0 g KOH、8 mL CH3OH，70 °C回流搅拌5 h。加入10 mL 10 % HCl溶液、碱，50 mL水。用CHCl3萃取，除水，旋蒸，得到黄色粉末状固体产物，即1.4-二（对乙炔基苯甲酸）-2,5-二甲氧基苯（p-酸）。
(6) PdAg合金的制备：将Ag23Al77合金置于1 mol/L NaOH溶液中，30℃下磁力搅拌72 h，得到的多孔银用二次水冲洗，并取5 mg 迅速加入到75 mL K2PdCl4 (1.2 mmol/L)溶液中，5℃下磁力搅拌2 h。将制备的PdAg合金纳米材料溶液冰水浴超声处理15 min，得到分散的合金材料溶液。
(7) 将步骤(6)制备的PdAg合金分别与步骤(4)、步骤(5)中制备的碳点、P酸溶液混合，分别超声处理15 min、20 min，之后离心处理5 min，除去沉淀，得到分散的PdAgCQDs, PdAgP-acid溶液。
(8) 将步骤(7)制备的PdAgCQDs, PdAgP-acid溶液与分别能与Hg2+、Ag+进行特异性结合的DNA片段混合，磁力搅拌1 h, 之后进行离心处理10 min，得到相应的单分散溶液。
(9) 将步骤(8)制备的溶液修饰到电极表面，用二次水冲洗掉没结合上的DNA，在室温下干燥5 min。
(10) 将海带液样品滴加到步骤(9)中制备的DNA传感器表面，反应30 min, 用二次水冲洗没结合上的Hg2+、Ag+，放到检测池中进行ECL测定。最低检测线为Hg2+ 0.5 nmol/L，Ag+ 3 nmol/L。
Claims (1)
1.一种基于3D纸芯片电致化学发光DNA传感器的制备并用于同时检测Hg2+、Ag+，其特征是包括以下步骤：
1.1 选择能用于修饰电极表面的多孔金纳米线，修饰到纸电极表面，制备金膜自组装传感器；
1.2 选择能够分别与Hg2+、Ag+进行特异性结合的DNA片段，利用自组装技术修饰到(1)处理过的电极表面；
1.3 选择不同的样品进行处理，利用自组装技术与1.2中的DNA片段分别进行特异性结合；
1.4 利用现有方法，制备能够在负电势下产生光信号的量子点；
1.5 利用现有方法，制备能够在正电势下产生光信号的功能纳米分子；
1.6 制备能够增强电子传递，起信号放大作用的多孔纳米材料；
1.7 利用层层自组装表面修饰技术等，将1.6分别与1.4和1.5制备的材料复合，制作具有信号放大作用的ECL探针；
根据权利要求1所述的制备基于3D纸芯片ECL DNA传感器的方法，及在同一工作电极上对样品中的Hg2+、Ag+进行同时检测，其特征在于该方法的具体步骤为：
2.1 在计算机上设计微流控纸芯片的疏水区的打印图案，将滤纸裁剪成打印机所需尺寸(例如A4等)放到喷蜡打印机中，将疏水区打印到滤纸上；
2.2 将2.1中打印的滤纸进行丝网印刷，将工作电极、参比电极、对电极印刷到与疏水区匹配的区域；
2.3 将2.2中制备好的滤纸放置到加热器或者烘箱中，在70-140℃摄氏度下加热1-3 min；
2.4 将制备的整张滤纸按照蜡打印的图案进行裁剪，得到单个微流控3D纸芯片ECL传感器；
2.5 将制备的多孔金纳米线修饰到工作电极表面；
2.6 将制备的PdAg合金纳米材料溶液冰水浴超声处理10 - 30 min，得到分散的合金材料溶液；
2.7 将制备的碳点溶液离心处理5 - 10 min，除去不发光的沉淀，得到分散的碳点溶液；
2.8 将制备的P酸溶液超声处理10 - 30 min，得到分散的碳点材料溶液；
2.9 将步骤2.6制备的PdAg合金分别与步骤2.7、步骤2.8中制备的碳点、P酸溶液混合，超声处理15-30 min，之后离心处理5 - 10 min，除去沉淀，得到分散的PdAgCQDs, PdAgP-acid溶液；
2.10 将步骤2.9制备的PdAgCQDs, PdAgP-acid溶液与分别能与Hg2+、Ag+进行特异性结合的DNA片段混合，磁力搅拌1-2 h, 之后进行离心处理10 - 15 min，得到相应的单分散溶液；
2.11 将步骤2.10制备的溶液修饰到电极表面，用二次水冲洗掉没结合上的DNA，在室温下干燥3 - 5 min；
2.12 将一定浓度的含有Hg2+、Ag+样品滴加到步骤2.11中制备的DNA传感器表面，反应20-30 min, 用二次水冲洗没结合上的Hg2+、Ag+，放到检测池中进行ECL测定；
根据权利要求1所述负电势发光量子点为CdTe、CdS、碳点(CQDs)；正电势发光分子为三联钌吡啶、鲁米诺、P酸(P-acid)；多孔纳米材料为多孔银(NPS)、多空金(NPG)、PtAg合金、PtCu合金、PdAg合金、PdCu合金；
根据权利要求2所述的3D ECL传感器为可折叠的纸芯片传感器；所述的工作电极为多孔金纳米线修饰电极电极（Ф=2mm）；所述的含有Hg2+、Ag+的样品为自来水、矿泉水、血样、鱼肉、海带。
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