CN106018390A - 比率型电化学发光纸芯片的制备及在铅离子检测中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种比率型电化学发光纸芯片的制备方法及所述的三维纸基设备在铅离子检测中的应用。通过蜡打印技术在纸芯片上制备工作区，并印制三电极，进而对工作区功能化，经过层层修饰，在工作区滴加含有H2O2的磷酸盐缓冲溶液，连接电化学工作站，实现Pb2+的高灵敏、便携式检测。

Description

比率型电化学发光纸芯片的制备及在铅离子检测中的应用
技术领域
本发明涉及一种电化学发光检测技术领域，更具体地说是一种适合于铅离子检测的三维纸芯片实验室技术平台的构建。
背景技术
近年来，随着经济快速发展的同时，环境污染问题日益突出，大气污染、土壤污染、水污染等问题接踵而至。重金属离子，如Pb2+，Hg2+等是引起水体污染的主要原因之一，它不仅会对生态系统产生很大的影响，而且对人类健康构成严重的威胁。例如，长期暴露在富含Pb2+环境中，会损害人类的中枢系统，甚至会损害人的大脑、肺、肾脏等器官，因此检测重金属离子意义重大。目前，重金属离子的检测方法主要有以下几种，包括：分光光度法、电位滴定法、色谱法、荧光方法、电化学方法、光电化学方法以及电化学发光方法等。在这些检测方法中，电化学发光方法以其灵敏度高、线性范围宽、操作简单等优点备受科学家青睐。但是在普通的电化学发光检测方法中，由于电极所处环境或仪器原因，容易使检测结果产生假阳性，检测结果的准确度有待进一步提高。
比率型电化学发光检测方法，是指在一次检测中，引入两种电化学发光试剂，通过控制电位，使两种发光试剂在单次扫描过程中在不同电位下发光，目标物的存在使两种发光试剂发光强度发生变化，通过测定两种发光试剂发光强度比值的变化，实现待测物质的检测。这种检测方法能够有效降低外在环境对检测产生的影响，因此可以提高检测结果的准确度。
三维纸基设备，作为一种新兴的实验室检测平台，广泛应用在生物样品、医药、环境诊断等领域。这种纸基设备制备过程简单，所需纸源储量丰厚且易于实现集成化及小型化。将比率型电化学发光方法与纸芯片结合，所得三维纸基电化学发光设备具有制备工艺简单，所需费用低，便于携带，测定结果可信度高，有望在资源有限的偏远地区得到应用，解决水体中重金属离子检测的瓶颈问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是制作一种操作简单、易于修饰和携带的三维比率型电化学发光纸芯片，以实现Pb2+的灵敏检测。
为了解决上述技术问题，本发明是通过以下措施来实现的：三维比率型电化学发光纸芯片的制备及在铅离子检测中的应用，其特征是包括以下步骤：
(1) 在计算机上设计如附图1所示的比率型电化学发光三维纸芯片的疏水蜡批量打印图案；
(2) 将纸片剪裁成常用A4大小的纸，将步骤(1)中设计的疏水蜡批量打印图案打印到A4纸上，随后将带有蜡图案的A4纸放置到烘箱中，150 ºC加热2 min，使蜡融化并浸透整个纸的厚度，形成疏水墙；
(3) 采用丝网印刷的方法，将工作电极、参比电极、对电极印刷图案依次印刷到步骤(2)中所得纸上，样式如附图2所示，其中右侧为工作区，上面印有工作电极，左侧为参比区，上面印有参比电极和对电极；
(4) 对（3）中亲水区域功能化，将CdS量子点功能化的DNA适配体链，定义为链1，其碱基序列如核苷酸序列表所示，固定在亲水区域，随后用巯基己醇封锁活性位点，滴加磷酸盐和H2O2组成的电解液，连接电化学工作站，在-1.5~1.0 V电位范围内，测定发光强度；
(5) 将一定浓度的Pb2+的底物链，定义为链2，其碱基序列如核苷酸序列表所示，其中至左向右，第十个碱基，也就是碱基A代表腺嘌呤核糖核苷酸，和Pb2+的特异性DNA模拟酶链，定义为链3，其碱基序列如核苷酸序列表所示，按一定比例混合在一起，43 ºC下反应3 h；
(6) 将一定浓度的Pb2+加入到步骤（5）所得混合液中，混匀，室温下反应30 min；
(7) 将步骤（6）中混合物滴加到步骤（4）所得纸芯片表面，室温下孵育5 h，二次水冲洗掉非特异性吸附的适配体链；
(8) 将Au@鲁米诺功能化的DNA适配体链，定义为链4，其碱基序列如核苷酸序列表所示，滴加到步骤（7）所得纸芯片表面，室温下反应，二次水冲洗掉非特异性吸附的适配体链，连接电化学工作站，再次测定发光强度；
(9) 绘制两次发光强度比率的变化与Pb2+浓度关系曲线，完成Pb2+的测定；
步骤（2）中所述的纸材料，其特征在于其为一级色谱纸；
步骤（4）中所述亲水区域功能化，其特征在于：在纸芯片上生长Ag纳米棒：向纸芯片表面滴加40 μL的Ag纳米粒子的生长溶液，此溶液中包含15 mM的AgNO3和200 mM的抗坏血酸，室温下反应20 min，随后用二次水冲洗表面，室温下干燥即可。
步骤(4)中所述链1，其特征在于: 其特定的碱基序列以及其5’端修饰上氨基，其3’端修饰上巯基。
步骤(8)中所述DNA链4，其特征在于：其特定的碱基序列以及其3’端修饰上巯基。
本发明的有益效果
（1）比率型电化学发光方法和纸芯片连用，具有便携式、高灵敏等特点。
（2）纸作为电化学发光检测基底，具有原料丰富，便于携带，易于折叠等特点。
（3）整个比率型纸基电化学发光器件制备过程简单，所需费用低，有望在资源有限的偏远地区实现Pb2+的便携式检测。
附图说明
图1：三维纸芯片的疏水蜡批量打印图案；
图2： 疏水蜡打印图案上丝网印刷上工作电极、参比电极和对电极，其中，右侧为工作电极，左侧为参比和对电极。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面通过实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明不仅仅局限于下面的实施例。
实施例1
一种比率型三维电化学发光纸芯片的制备及其在Pb2+检测中的应用：
(1) 在计算机上设计比率型电化学发光三维纸芯片的疏水蜡批量打印图案；
(2) 将纸片剪裁成常用A4大小的纸，将步骤(1)中设计的疏水蜡批量打印图案打印到A4纸上，随后将带有蜡图案的A4纸放置到烘箱中，150 ºC加热2 min，使蜡融化并浸透整个纸的厚度，形成疏水墙；
(3) 采用丝网印刷的方法，将工作电极、参比电极、对电极印刷图案依次印刷到步骤(2)中所得纸上，其中右侧为工作区，上面印有工作电极，左侧为参比区，上面印有参比电极和对电极；
(4) 对（3）中亲水区域功能化，将CdS量子点功能化的DNA适配体链，定义为链1，固定在亲水区域，随后用巯基己醇封锁活性位点，滴加磷酸盐和H2O2组成的电解液，连接电化学工作站，在-1.5~1.0 V电位范围内，测定发光强度；
(5) 将一定浓度的Pb2+的底物链，定义为链2，和Pb2+的特异性DNA模拟酶链，定义为链3，按一定比例混合在一起，43 ºC下反应3 h；
(6) 将一定浓度的Pb2+加入到步骤（5）所得混合液中，混匀，室温下反应30 min；
(7) 将步骤（6）中混合物滴加到步骤（4）所得纸芯片表面，室温下孵育5 h，二次水冲洗掉非特异性吸附的适配体链；
(8) 将Au@鲁米诺功能化的DNA适配体链，定义为链4，滴加到步骤（7）所得纸芯片表面，室温下反应，二次水冲洗掉非特异性吸附的适配体链，连接电化学工作站，再次测定发光强度；
(9) 绘制两次发光强度比率的变化与Pb2+浓度关系曲线，完成Pb2+的测定。
SEQUENCE LISTING
<110> 济南大学
<120> 一种比率型电化学发光纸芯片的制备及其在铅离子检测中的应用
<130> 4
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tcggaagaga gatg 14
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
actcactata ggaagagatg 20
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tttttttcat ctcttctccg agccggtcga aatagtgagt 40
<210> 4
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
actcactatt tcgac 15

Claims (3)

1.比率型电化学发光纸芯片的制备及在铅离子检测中的应用，其特征是包括以下步骤：
(1) 在计算机上设计比率型电化学发光三维纸芯片的疏水蜡批量打印图案；
(2) 将纸片剪裁成常用A4大小的纸，将步骤(1)中设计的疏水蜡批量打印图案打印到A4纸上，随后将带有蜡图案的A4纸放置到烘箱中，150 ºC加热2 min，使蜡融化并浸透整个纸的厚度，形成疏水墙；
(3) 采用丝网印刷的方法，将工作电极、参比电极、对电极印刷图案依次印刷到步骤(2)中所得纸上，其中右侧为工作区，上面印有工作电极，左侧为参比区，上面印有参比电极和对电极；
(4) 对（3）中亲水区域功能化，将CdS量子点功能化的DNA适配体链，定义为链1，固定在亲水区域，随后用巯基己醇封锁活性位点，滴加磷酸盐和H2O2组成的电解液，连接电化学工作站，在-1.5~1.0 V电位范围内，测定发光强度；
(5) 将一定浓度的Pb2+的底物链，定义为链2，和Pb2+的特异性DNA模拟酶链，定义为链3，按一定比例混合在一起，43 ºC下反应3 h；
(6) 将一定浓度的Pb2+加入到步骤（5）所得混合液中，混匀，室温下反应30 min；
(7) 将步骤（6）中混合物滴加到步骤（4）所得纸芯片表面，室温下孵育5 h，二次水冲洗掉非特异性吸附的适配体链；
(8) 将Au@鲁米诺功能化的DNA适配体链，定义为链4，滴加到步骤（7）所得纸芯片表面，室温下反应，二次水冲洗掉非特异性吸附的适配体链，连接电化学工作站，再次测定发光强度；
(9) 绘制两次发光强度比率的变化与Pb2+浓度关系曲线，完成Pb2+的测定；
步骤（2）中所述的纸材料，其特征在于其为一级色谱纸；
步骤（4）中所述亲水区域功能化，其特征在于：在纸芯片上生长Ag纳米棒：向纸芯片表面滴加40 μL的Ag纳米粒子的生长溶液，此溶液中包含15 mM的AgNO3和200 mM的抗坏血酸，室温下反应20 min，随后用二次水冲洗表面，室温下干燥即可。
2.根据权利要求 1 所述的比率型电化学发光纸芯片的制备及在铅离子检测中的应用，其特征在于：权利要求 1 步骤(4)中所述链1特定的碱基序列以及其5’端修饰上氨基，其3’端修饰上巯基。
3.根据权利要求 1 所述的三维纸基比率型电化学发光纸芯片的制备及在Pb2+检测中的应用，其特征在于：权利要求 1 步骤(8)中所述DNA链4特定的碱基序列以及其3’端修饰上巯基。
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