CN113637673A - 用于裂解DNA/RNA嵌合体的DNAzyme组合、长链DNAzyme及应用 - Google Patents

用于裂解DNA/RNA嵌合体的DNAzyme组合、长链DNAzyme及应用 Download PDF

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Abstract

本申请公开了用于裂解DNA/RNA嵌合体的DNAzyme组合、长链DNAzyme及其应用。DNAzyme组合包括第一DNAzyme和第二DNAzyme，第一DNAzyme和第二DNAzyme具有相同的催化序列，催化序列用于将DNA/RNA嵌合体裂解；第一DNAzyme还具有连接在催化序列5’端的第一非催化序列，第一DNAzyme裂解连接在载体表面的DNA/RNA嵌合体的活性小于第二DNAzyme裂解连接在载体表面的DNA/RNA嵌合体的活性。本申请揭示了DNAzyme的长度对于其裂解连接在载体表面的DNA/RNA嵌合体的速率具有重大影响，并利用该现象实现了对APE1实现的高效检测和分析。

Description

用于裂解DNA/RNA嵌合体的DNAzyme组合、长链DNAzyme及应用
技术领域
本申请涉及APE1检测技术领域，尤其涉及用于裂解DNA/RNA嵌合体的DNAzyme组合、长链DNAzyme及以及将这些DNAzyme应用于制备检测和分析APE1的试剂盒或传感器中。
背景技术
人类脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1(apurinic/apyrimidinic endonuclease1，APE1)，又称氧化还原因子-1(redox effector factor-1，Ref-1)，是人体内的一种重要的DNA修复蛋白与基因调控蛋白。一方面，它作用于DNA双链中的脱嘌呤/脱嘧啶位点(apurinic/apyrimidinic sites，简称脱碱基位点)，是人体内最为重要的脱碱基核酸修复酶，在碱基切除修复途径(base excision repair，BER)中发挥重要作用；另一方面，APE1还能通过其氧化还原功能调控多种转录因子的DNA结合活性。已有研究表明，人体血液及组织细胞中APE1含量的异常变化与多种疾病相关，血清中APE1可作为生物标志物辅助肺癌、前列腺癌等疾病的临床诊断。此外，细胞内APE1的含量也会受活性氧等物质的影响。细胞暴露实验表明，大气中的颗粒物会提高细胞中APE1 mRNA的表达水平，但由于细胞中的mRNA表达水平并不与对应蛋白的表达水平完全相关，若要说明细胞受到的氧化性损伤程度与APE1表达水平的关系，需要对细胞内的APE1含量进行直接定量。另外，有研究表明APE1水平还与抗药性相关，抑制APE1活性有助于提高细胞对药物的敏感性。
现有的APE1检测方法主要有电化学分析法、凝胶电泳法、酶联免疫吸附分析法、液质联用技术与荧光探针法等。其中，荧光探针检测法相比于其他方法具有操作简便、灵敏度高等优点，能实现生物样品中APE1含量的高通量检测。由于来自其他非特异性内切酶(通常以DNase为代表)的严重干扰，仍然缺乏一种高灵敏度且能不受生物样品中其他核酸酶干扰的可靠检测方法。
发明内容
有鉴于此，本申请的目的至少提供一种高灵敏度的避免核酸酶干扰的APE1的检测方法。
第一方面，本申请实施例公开了一种用于裂解DNA/RNA嵌合体的DNAzyme组合，所述DNA/RNA嵌合体具有至少一个核糖核苷酸位点，所述核糖核苷酸位点将所述DNA/RNA嵌合体分为第一段和第二段；
所述DNAzyme组合包括第一DNAzyme和第二DNAzyme，所述第一DNAzyme和所述第二DNAzyme具有相同的催化序列，所述催化序列具有催化环以及连接在所述催化环两端的两个连接臂，两个所述连接臂分别用于与所述第一段和所述第二段杂交，以将所述DNA/RNA嵌合体裂解为由所述第一段形成的片段和由所述第二段形成的片段；
所述第一DNAzyme还具有连接在所述催化序列5’端的第一非催化序列，所述第一DNAzyme具有与连接在载体表面的所述DNA/RNA嵌合体杂交并催化所述DNA/RNA嵌合体裂解的第一活性，所述第二DNAzyme具有与连接在载体表面的所述DNA/RNA嵌合体杂交并催化所述DNA/RNA嵌合体裂解的第二活性，所述第一活性小于所述第二活性。
第二方面，本申请实施例公开了一种用于APE1检测的长链DNAzyme，其具有催化序列以及连接在所述催化序列5’端的第一非催化序列；
所述催化序列用于与连接在载体表面的DNA/RNA嵌合体杂交，所述DNA/RNA嵌合体具有至少一个核糖核苷酸位点，所述核糖核苷酸位点将所述DNA/RNA嵌合体分为第一段和第二段；
所述第一非催化序列具有中间区域和无关区域，其中，所述中间区域为双链区域，所述双链区域具有靠近所述催化序列一端的AP位点，所述AP位点可被所述APE1特异性识别，促使所述长链DNAzyme转变成短链DNAzyme，所述短链DNAzyme具有与所述催化序列相同的序列和结构；
所述长链DNAzyme具有裂解标记在AuNPs上的DNA/RNA嵌合体的第三活性，所述短链DNAzyme具有裂解标记在AuNPs上的DNA/RNA嵌合体第四活性，所述第三活性小于所述第四活性。
第三方面，本申请实施例还公开了第一方面涉及的DNAzyme组合或第二方面涉及的长链DNAzyme在制备检测APE1的生物传感器或试剂盒中的应用。
与现有技术相比，本申请至少具有以下有益效果：
本申请揭示了DNAzyme的长度对于其裂解连接在载体表面的DNA/RNA嵌合体的速率具有重大影响，直接影响DNAzyme裂解DNA/RNA嵌合体的“酶”活性。本申请还利用这种现象制备了APE1的检测试剂盒和生物传感器，实现了对APE1的高选择性、高灵敏度地检测和分析。
附图说明
图1为本申请实施例提供的AuNPs的TEM图(A)、probe-1-AuNPs的TEM图(B)以及AuNPs和probe-1-AuNPs紫外吸收扫描图。
图2为本申请实施例提供的荧光强度与底物浓度之间的线性关系(probe-1与AuNPs反应)。
图3为本申请实施例提供的(A)长度调控的DNAzyme反应速率差异现象示意图、(B)DNAzyme-0和DNAzyme-1对AuNPs上探针的荧光响应图(以不含任何DNAzyme的生物传感器作为空白对照)。
图4为本申请实施例提供的：(A)DNAzyme-0、DNAzyme-2和DNAzyme-3与AuNP的反应示意图；(B)DNAzyme-0、DNAzyme-2和DNAzyme-3对AuNP上底物的荧光强度结果图；(C)DNAzyme-0、DNAzyme-2和DNAzyme-3对溶液中底物的荧光强度结果图；(D)在不同的氯化钠浓度下，DNAzyme-2和DNAzyme-3的荧光相对增加速率；(E)不同处理后DNAzyme-2和DNAzyme-3的荧光相对增加速率；图中，相对速率表示在相同条件下，每个第一DNAzyme(DNAzyme-2或DNAzyme-3)与第二DNAzyme(DNAzyme-0)的荧光增长率的比值，误差条显示了所有图中三个实验的标准偏差。
图5为本申请实施例提供的不同类型DNAzyme-4和DNAzyme-5裂解probe-1-AuNPs的荧光相对增加速率。
图6为本申请实施例提供：(A)不同底物密度的DNAzyme-0在AuNP上的相对增加速率，DNAzyme-0与300/AuNP之间的荧光增加速率设为1.0(300/AuNP列)；(B)在AuNP上，底物密度不同的两种DNAzymes(DNAzyme-2和DNAzyme-3)的荧光相对增加速率。
图7为本申请实施例提供的四种DNAzymes(DNAzyme-6、DNAzyme-7、DNAzyme-8和DNAzyme-9)对AuNPs上探针的荧光响应图。
图8为本申请实施例提供的：(A)DNAzyme-10、DNAzyme-11和DNAzyme-12对溶液中probe-4的荧光响应结果图；(B)DNAzyme-10、DNAzyme-11和DNAzyme-12对probe-3-AuNPs上探针的荧光响应结果图。
图9为本申请实施例提供的APE1检测用生物传感器的合理设计示意图。
图10为本申请实施例提供的APE1检测的凝胶糖凝胶电泳图；M泳道:DNA marker；泳道1:DNAzyme-0；泳道2:P1/P2；泳道3:P1/P2+APE1；泳道4:P1/P2+AuNPs；泳道5:P1/P2+AuNPs+APE1。
图11为本申请实施例提供的：(A)APE1浓度为0～5U/mL的生物传感器的荧光响应结果图；(B)荧光增加速率与APE1浓度之间的线性关系图；(C)该生物传感器对APE1相对于其他酶的选择性结果图，以不含任何酶的生物传感器作为空白材料；(D)荧光增加速率与Hela细胞数量之间的线性关系结果图。
图12为本申请实施例提供的生物传感器对不同稀释倍数的Hela细胞裂解液的荧光反应图。
具体实施方式
为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。
脱氧核酶(DNAzyme)是在辅因子存在下表现出优异催化活性的核酸分子。此后，许多研究人员报告了各种具有不同催化特性的DNA酶，包括裂解RNA的DNAzyme，裂解DNA的DNAzyme和可催化连接反应的DNAzyme等。脱氧核糖核酸酶具有良好的可编程性，高稳定性和优异的活性，在环境监测，食品监管，生物传感和基因治疗等许多领域都具有广阔的前景。DNA酶被用作信号发生器和对特定刺激作出反应的构件，已被用于各种分析物的生物传感和生物成像。
由此，本申请发明人经过长期实践发现，DNAzyme的长度对于其裂解连接在载体表面的DNA/RNA嵌合体的速率具有重大影响，直接影响DNAzyme裂解DNA/RNA嵌合体的“酶”活性。其中，载体可以是纳米金属颗粒，纳米胶体颗粒，纳米磁性颗粒等等。
为此，如图3所示，本申请实施例公开了一种用于裂解DNA/RNA嵌合体的DNAzyme组合，DNA/RNA嵌合体具有至少一个核糖核苷酸位点，核糖核苷酸位点将所述DNA/RNA嵌合体分为第一段和第二段。其中，DNA/RNA连接在纳米金颗粒表面。DNAzyme组合包括第一DNAzyme和第二DNAzyme，第一DNAzyme和第二DNAzyme具有相同的催化序列，催化序列具有催化环(如图1中“extended nucleotides”的蓝色链)以及连接在催化环两端的两个连接臂(如图1中“extended nucleotides”的绿色链)，两个连接臂分别用于与第一段和第二段杂交，以将DNA/RNA嵌合体裂解为由第一段形成的片段和由第二段形成的片段；第一DNAzyme还具有连接在催化序列5’端的第一非催化序列(如图1中“extended nucleotides”的黑色链)，第一DNAzyme具有与DNA/RNA嵌合体杂交的第一活性，第二DNAzyme具有与DNA/RNA嵌合体杂交的第二活性，第一活性小于第二活性。由于，第一DNAzyme在其催化序列连接有第一非催化序列，以将第一DNAzyme和第二DNAzyme的长度区分开来，从而使得二者具有不同的裂解DNA/RNA嵌合体的活性。具体的，长链的第一DNAzyme的活性将显著低于短链的第二DNAzyme。
因而，上述此种DNAzyme的应用实施方式中，通过这种裂解活性的差别，可以将DNA/RNA嵌合体的一端连接在胶体金颗粒上、另一端连接荧光基团，在第一非催化序列上设计具有可被人类脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1(简称为APE1)特异性识别的AP位点，设计一种独特的DNAzyme序列，利用APE1对AP位点的特异性，将此种独特的DNAzyme序列从长链裂解后转变为短链，产生长度不同的DNAzyme序列，进而分别具有作用连接在胶体金颗粒上的DNA/RNA嵌合体不同活性，表现为不同的反应速率或者荧光产生速率，通过这种产生速率的差别可以判断和分析人类脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1的含量。当然，此种实施方式中，还可直接在DNA/RNA嵌合体的两端分别连接荧光基团及荧光猝灭基团，同样可通过不同的荧光产生速率来检测APE1的含量。
更多的应用实施方式中，第一非催化序列还可设计成任意目标序列，利用该目标序列与目标物的特异性结合以及此种长短链DNAzyme组合实现对目标物的检测和分析。例如，能够作用于RNA的核糖核酸酶，能够作用于DNA的脱氧核糖核酸酶(简称为DNase)，具体如DNase1、DNase1L1、DNase1L2和DNase1L3，可在第一非催化序列中涉及对应的DNase的超敏酶切位点，从而实现对这些酶的检测和分析。
下方将结合具体的实施例对此种长短链的DNAzyme组合对对应的DNA/RNA嵌合体(探针)的裂解反应进行说明。
试剂和仪器
20nm AuNPs购自BBI(Cardiff,UK)。APE1、T7外切酶(简称为T7Exo)、外切酶I(简称为ExoI)、脱氧核糖核酸酶I(简称为DNaseI)、尿苷啶糖基化酶(简称为UDG)和热电偶反应缓冲液(缩写为ThermoPol、20mmTris-HCl、10mM氯化钾、10mM(NH4)2SO4、2mM硫酸镁和0.1％TritonX-100、pH8.8+25℃)均来自新英格兰生物实验室(NEB，MA，USA)。链霉亲和素(SA)购自生工生物技术公司。DNase/RNase均购自天根生物技术公司(中国北京)，并用于所有实验。采用NanoDrop2000紫外可见分光光度计(ThermoFisher，美国)测定DNA寡核苷酸的浓度。第一DNAzyme、第二DNAzyme以及探针的合成
本申请实施例利用8-17E DNAzyme(标记为DNAzyme-0或DNAzyme-10，见表1中的序列)为基础，在其5’端或3’端连接不同序列或基团以制备成不同的DNAzyme，列入表1中，并对应设计不同的探针probe-1～probe-4列入表1中。表1中，探针probe-1～probe-4均为DNA/RNA嵌合体，作为DNAzyme作用底物；DNAzyme-1～DNAzyme-9、DNAzyme-11和DNAzyme-12均作为第一DNAzyme，DNAzyme-0和DNAzyme-10作为第二DNAzyme。所有寡核苷酸(表1)均由Sangon生物技术公司(中国上海)合成并纯化。表1中，“X”代表AP位点。
表1
Figure BDA0003209397540000081
Figure BDA0003209397540000091
探针及探针修饰的AuNPs的构建与表征
本申请实施例提供的探针是作为DNAzyme底物出现的，例如DNAzyme-0是8-17EDNAzyme，对应探针probe-1设计成通过一个或几个核糖核苷酸位点进行分隔的DNA/RNA嵌合体(例如表1中的probe-1、probe-2、probe-3或probe-4)，探针靠近5’端为第一段，靠近3’端为第二段，分布对应与DNAzyme的两臂进行特异性杂交。进一步的，本申请实施例还在probe-1中添加了一个14-nt的聚胸腺嘧啶间隔区，以增强其对DNAzyme的可及性。
根据Peng,H.；Li,X.-F.；Zhang,H.；Le,X.C.Nature Communications2017,8,14378.公开的方法，本实施例制备了probe-1修饰的AuNPs。简单而言，在室温下将5μMprobe-1以摩尔比为1:2000与AuNPs混合2小时，然后加入氯化钠和Tween 20，以减少非特异性吸附及AuNPs聚集；孵育24小时后，将上述溶液在16000g下离心20min后，用25mM Tris-HCl(pH7.4)洗涤三次后，获得probe-1修饰的AuNPs(probe-1-AuNPs)。最后，将制备的probe-1-AuNPs存储在25mMTris-HCl(pH7.4)中，浓度为2nM，并保存在4℃直到使用。
将产物probe-1-AuNPs重悬于在Tris-HCl缓冲溶液中，储存在4℃供进一步使用。使用透射电子显微镜(TEM)和紫外-可见光谱对probe-1修饰的AuNPs进行了相应的表征。在制备的probe-1-AuNPs溶液中加入20mM巯基乙醇，并在室温下孵育过夜。然后离心后测定上清液的荧光强度。
如图1所示，AuNPs颗粒均呈球形，直径为20nm，在图1C中，与未修饰的AuNPs相比，由于DNA取代了AuNPs的表面配体，AuNPs的吸收峰从525nm红移到530nm的位置随后。绘制不同probe-1浓度与AuNPs的反应荧光强度的标准曲线，如图2所示，根据标准曲线计算负载在AuNPs上的probe-1负载量，结果表明，每个AuNPs平均共轭约为300条底物链。
不同长度DNAzyme对探针修饰的AuNPs的裂解反应
具体的反应过程如下：
向20μl含有200nM DNAzymes的操作溶液(以不含DNAzyme的操作溶液作为空白对照组)中加入含有200mM probe-1-AuNPs的Tris-HCl缓冲液(pH7.4)和200mM氯化钠，加入Mn2+溶液(2μL，5mM)进行反应，并立即使用Rotor-GeneQ实时荧光定量PCR仪器(QIAGEN，Hilden，德国)测量荧光强度。
采用不同50nM的DNAzymes(表1中的DNAzyme-0、DNAzyme-1、DNAzyme-2、DNAzyme-3、DNAzyme-4和DNAzyme-5)在上述反应体系中分别与probe-1-AuNPs进行反应，反应条件相同，检测反应过程中的荧光强度。
结果如图1A所示，当与偶联有数百个probe-1的AuNPs发生反应时，DNAzyme可以裂解一条probe-1链，释放出两个短片段(即第一段和第二段)；然后，DNAzyme将从片段中分离出来，杂交并裂解另一条probe-1链；当具有FAM标记的片段(即第二段)离开AuNPs表面时，荧光信号将被恢复，因此，在DNAzyme的裂解过程中，荧光信号将继续增加，而荧光增加的速率可以反映DNAzyme的裂解速率。
如图1B所示，在DNAzyme-0中，DNAzyme的两臂(图1中DNAzyme中的绿色部分)与probe-1的第一段和第二段完美匹配；而由于DNAzyme-0的5’端引入了16个与probe-1不匹配的无关碱基(图1中DNAzyme中的黑色部分，即第一非催化序列)形成DNAzyme-1(见表1中的序列)时，DNAzyme-1裂解产生的荧光信号明显低于DNAzyme-0。对应的，DNAzyme-1即为第一DNAzyme，DNAzyme-0即为第二DNAzyme，通过在第一DNAzyme的5’端引入第一非催化序列，促使裂解probe-1(即为DNA/RNA嵌合体，其序列如表1所示，其中具有一个核糖核苷酸位点rA)的活性显著降低。
为进一步验证这种在DNAzyme的5’端添加无关的第一非催化序列导致其裂解probe-1活性降低的方式，进一步的实施方式将第一非催化序列设计成6或16个胸腺嘧啶，对应形成DNAzyme-2和DNAzyme-3，采用上述方式与probe-1-AuNPs反应，结果如图4B、C所示，DNAzyme-2和DNAzyme-3裂解probe-1产生的荧光信号也远低于DNAyzme-0。而且，第一非催化序列较长的DNAzyme-3的反应率更低。
为了排除AuNPs的影响，进一步的实施例设计了probe-2，其将probe-1的5’端的14(T)去除，替换成为小分子猝灭剂(BHQ-1)(序列见表1)。在完整的probe-2中，FAM被BHQ-1猝灭。当probe-2被DNAzyme裂解后，FAM和BHQ-1将相互分离，释放荧光信号。如图4B所示，当所有DNAzymes与不含AuNPs的probe-2反应时，对应的荧光信号产生速率几乎相同，并未存在裂解活性差别。
由此可见，第一DNAzyme和第二DNAzyme对所谓DNA/RNA嵌合体的裂解活性差异主要与长度不同DNAzyme与AuNPs形成的作用力有关。
综上，DNAzyme的序列越长(添加第一非催化序列)，越不利于其与AuNPs上的probe-1杂交，从而导致对probe-1低裂解速率。这还可能由于长链的第一DNAzyme由于添加的第一非催化序列，而第一非催化序列可能对AuNPs的表面活性位点产生非特异性吸附，从而导致其不利于与probe-1杂交，从而裂解活性降低。
为了证实这一假设，进一步实施例采用了一种小分子阻断剂，6-巯基-1-己醇(MCH)，来阻断AuNPs上的吸附位点，AuNPs上的MCH单层可以阻止DNA碱基和AuNPs之间的接触(K.A.Brown,S.Park,K.Hamad-Schifferli,The Journal of Physical Chemistry C,112(2008)7517-7521.)。因此，在添加DNAzyme之前进行对probe-1-AuNPs进行MCH处理可以尽量减少非特异性吸附的影响。
结果如图4D所示，相对于未对probe-1-AuNPs进行处理的方式，在MCH处理后，DNAzyme-2和DNAzyme-3分别对probe-1-AuNPs的相对裂解速率分别增加了约2.61倍和3.27倍。但并未恢复到DNAzyme-0的水平，说明不仅存在非特异性吸附，还可能存在其他作用力。同样地，相较于未对probe-1-AuNPs进行处理的方式，经对probe-1-AuNPs同时使用氯化钠处理和MCH处理后，增加氯化钠浓度有利于减少电荷排斥，DNAzyme-2和DNAzyme-3分别对probe-1-AuNPs的裂解速率分别增加了约4.1倍和4.8倍。其中，如图4E所示，在同时进行MCH和500mM氯化钠处理下，DNAzyme-2和DNAzyme-3分别对probe-1-AuNPs的相对裂解速率分别提升至86％和61％。由此可见，第一DNAzyme对probe-1-AuNPs上probe-1探针的吸附作用包括了非特异性吸附以及电荷排斥，而这种非特异性吸附和电荷排斥是不利于提高其对probe-1的裂解速率的。
由此可知，HS-ssDNA(即所谓DNA/RNA嵌合体)标记的AuNPs具有相对较高的电荷，并产生了一个静电排斥区。较长的第一DNAzyme由于其5’端连接有第一非催化序列，致使其比DNAzyme-0(第二DNAzyme)更难进入该静电排斥区。即使较长的第一DNAzyme的一部分偶然进入该静电排斥区，非特异性吸附也会阻止其产生荧光信号。对于较长的DNAzyme，扩展的不配碱基提供了更多的非特异性吸附位点，使吸附能显著提升。因此，只有一小部分较长的DNAzymes可以与底物链(探针)结合，而不能产生足够的裂解，从而影响其裂解活性。
生物素修饰DNAzyme
本实施例还通过在3’端或5’端对DNAzyme-0进行生物修饰得到DNAzyme-4和DNAzyme-5来探索空间效应(图5)，此种生物素修饰对裂解速率的影响不大。此外，通过强链霉亲和素-生物素相互作用，引入了一种相当大的链霉亲和素(SA)，以增加空间位阻。如图5所示，与DNAzyme-0相比，DNAzyme-4(3’生物素)活性下降了一半以上，而DNAzyme-5(5’生物素)活性没有变化。由于3’-生物素靠近AuNPs的表面，而5’-生物素则不是，结果表明AuNPs表面的空间位阻也会影响DNAzyme的性能。因此，由于通过在第二DNAzyme的3’端增加大的生物基团，由于其增加的空间位阻，也能导致得到的第一DNAzyme对载体表面探针的裂解活性显著降低。
本实施例还制备了一系列不同密度的probe-1-AuNPs(每个AuNPs大致偶联约为300、270、237、218、190或145个probe-1)。如图6A所示，当probe-1-AuNPs偶联的probe-1低于200个时，DNAzyme-0的裂解速率显著降低。如图6B所示，DNAzyme-2或DNAzyme-3对于不同密度的probe-1-AuNPs的裂解速率大致相同。这可能是因为非特异性吸附和静电斥力对性能的影响几乎相当相同。低密度的probe-1-AuNPs有利于减少静电排斥力，但会有一个更大的裸露表面，导致更多的吸附位点，从而对短链DNAzyme的裂解速率产生较大影响。
以上结果表明，受长度调节的DNAzyme反应速率的差异可能是由静电排斥力、非特异性吸附和空间位阻同时引起的。一旦增加了扩展的错配碱基的数量(即增加第一非催化序列)，非特异性吸附、静电排斥和空间位阻将主导DNAzyme和HS-s-ssDNA功能化AuNPs之间的相互作用，并阻止DNAzyme的作用。
验证长短链DNAzyme裂解探针的活性差异
进一步的实施例设计了4个DNAzymes(DNAzyme-6、DNAzyme-7、DNAzyme-8和DNAzyme-9)，此种DNAzyme在其3’端连接第二非催化序列，第二非催化序列为的6个或16个腺嘌呤(A)或聚胸腺嘧啶核苷酸，如表1所示。将此4个DNAzymes分别与probe-1-AuNPs在上述反应体系中，采用相同的浓度进行反应，检测反应过程中的荧光强度。结果如图7所示，DNAzyme-6和DNAzyme-7的对探针的裂解速率远大于DNAzyme-8和DNAzyme-9，而且DNAzyme-6(3’A6)和DNAzyme-7(3’A16)的对探针的裂解速率与DNAzyme-0的几乎相同；而DNAzyme-6和DNAzyme-7的裂解速率甚至低于DNAzyme-2和DNAzyme-3的裂解速率。由此可见，在DNAzyme的3’端设计延伸的第二非催化序列，并且此种催化序列与探针的第一段5’端的间隔序列能够配对杂交，例如与probe-1 5’端的14(T)间隔序列进行杂交，能够促使其更有利于接近AuNP表面，使静电斥力更强，从而提高其对于探针的裂解速率。
为了验证这种特殊现象的普遍性，本实施例进一步设计了DNAzyme-10、DNAzyme-11和DNAzyme-12(见表S1中的序列)、以及probe-3和probe-4。其中，probe-3和probe-4均为具有两个核糖核苷酸位点的DNA/RNA嵌合体。并且probe-3的5’端携带一个14T的间隔序列，3’端携带一个FAM基团以便产生荧光，以便将probe-3偶练至AuNPs上时形成间隔序列，以提高所得功能化胶体金颗粒的可及性以及静电斥力。而probe-4分别在两端分别携带荧光基团和荧光猝灭基团。
同样地，将DNAzyme-10、DNAzyme-11和DNAzyme-12分别与probe-3-AuNPs以及probe-4在上述相同的反应体系中进行裂解反应，检测反应过程中的荧光强度变化。如图8A所示，DNAzyme-10、DNAzyme-11和DNAzyme-12在溶液中对probe-4的裂解速率大致相同。然而，当处理HS-ssDNA标记的AuNPs时，DNAzyme-11和-12的裂解速率明显慢于DNAzyme-10(图8B)。这些结果与上方实施例使用的8-17EDNAzyme观察到的现象一致。因此，这表明，长度调控的DNAzyme反应速率的差异也适用于其他DNAzymes。
利用DNAzyme检测APE1
本申请实施例利用长短链的DNAzyme应用于检测APE1。为此，本实施例构建了一种特殊的长链DNAzyme，长链DNAzyme具有催化序列以及连接在催化序列5’端的第一非催化序列。其中，催化序列与上述的DNAzyme的结构相同，用于与DNA/RNA嵌合体杂交，即与探针杂交。不同之处在于第一催化序列，第一催化序列具有中间区域和无关区域，其中，中间区域为双链区域，无关区域为单链区域。中间区域具有靠近催化序列一端的AP位点，AP位点可被APE1特异性识别，促使长链DNAzyme转变成短链DNAzyme，短链DNAzyme具有与所述催化序列相同的序列和结构。由此，根据上方发现的规律，长链DNAzyme具有裂解标记在AuNPs上的DNA/RNA嵌合体的第三活性，短链DNAzyme具有裂解标记在AuNPs上的DNA/RNA嵌合体第四活性，第三活性小于所述第四活性。
也即，其中长链DNAzyme为长链DNAzyme，短链DNAzyme为短链DNAzyme，长链DNAzyme经过APE1对其具有的AP位点双链区域进行切割，从而将第一非催化序列从长链DNAzyme上切割下来，得到短链DNAzyme。此过程如图9所示。其中，AP位点设计在第一非催化序列的双链区域靠近催化序列一端，具体为靠近催化序列第二个碱基处，如表1中P1序列所示，中间区域有P1链和P2链杂交形成。
图9中，检测APE1的DNAzyme序列由三个区域组成，在含AP位点的链的5'端是由14个T碱基组成的poly-T区域(图中的黑色，即为无关区域)。中间有双链DNA(dsDNA)区域(黄色，即为中间区域)。DNAzyme区域位于含AP位点的链的3'末端(绿色)。AP位点设计在dsDNA区域和DNAzyme区域之间。
一个具体的检测APE1活性的实施例中，采用缓冲液体系为0.5倍稀释的热氨醇缓冲液、12.5mMTris-HCl和100mM氯化钠，反应体系体积为20μL，向反应体系中加入200nM的P1、200nM的P2以及不同浓度的APE1标准液，形成不同组别。加入APE1后，溶液在37℃孵育30min，APE1裂解生成游离DNAzyme。再向反应体系中加入2μL的AuNPs(2nM)和2μL的Mn2+(5mM)，并立即测定荧光强度，绘制不同浓度APE1对应的荧光强度的标准曲线，获得标准方程。将待测样品按照上述相同的方法进行反应，获得其荧光强度，再根据标准方程即可计算得到待测样品中APE1的含量。
采用琼脂糖凝胶电泳法验证了P1和P2的杂交作用，以及APE1与P1/P2的水解行为。琼脂糖凝胶电泳方法：5μL 20μM P1链和P2混合和2μL0.5×热摩尔缓冲液加上12.5mlTris-HCl和100mM氯化钠，5μL probe-1-AuNPs，2μLMn2+(5mM)和2μL APE1(10000U/mL)，然后添加水使总体积20mL。用4％琼脂糖凝胶分离DNA链。在140V下进行电泳20min。凝胶图像由Bio-radChemDocXRS(Bio-Rad，美国)或蓝光凝胶成像仪(Sangon生物技术公司)拍摄。
如图10A所示，游离DNAzyme(DNAzyme-0)显示为单体条带(第1道)。P1与P2杂交后(第2道和第4道)，比DNAzyme的单体条带有更亮、稍滞后的条带。当APE1加入P1/P2混合物时，与P1/P2相比，出现了两条新的条带，对应于APE1与P1/P2的裂解产物(3道和5道)的裂解产物。加入probe-1-AuNPs功能化的纳米颗粒后，游离DNAzyme的裂解产物出现到AuNP上的底物上(第5道)。相反，在没有APE1的P1/P2/AuNPs混合物中没有观察到其他条带。图10B显示了蓝光凝胶成像仪下相同的凝胶。红色条带用Redplus染色进行DNA染色。绿色条带为用DNAzyme酶切的FAM标记的底物片段。这些结果表明，APE1可以消化P1/P2形成的长链DNAzyme中的AP位点，将其转换成为游离的短链DNAzyme(DNAzyme-0)，导致FAM标记的片段释放，从而使得荧光产生。因此，荧光增加的速率反映了APE1的含量。
为了研究该方法的选择性，本实施例还选择DNaseI、UDG、T7exo和ExoI作为潜在的干扰酶，与APE1进行比较。APE1和其他酶的活性使用上述相同的程序进行检测；溶液中所有酶的浓度均为2U/mL。
从图11A和图11B可以看出，该生物传感器在不同浓度的APE1下可以快速响应，线性范围为0.0002～5U/mL，该方法的检测限为0.0002U/mL，其敏感性优于比大多数APE1检测方法。该生物传感器的高灵敏度可以归因于基于没有APE1的非特异性吸附、静电排斥和空间位阻的背景抑制，以及带有游离DNAzyme的功能化AuNPs的信号放大。图11C中总结了APE1的生物传感器对其他可能共存的核酸酶的选择性：APE1引起了较强的荧光反应，其他与APE1具有相同浓度的酶只产生可忽略的荧光信号。
为了在生物样本中检测APE1，制备含有大约106个人宫颈癌细胞裂解液(Hela细胞)的溶液。进一步的实施例应用所提出的生物传感器来测量人宫颈癌细胞裂解液(HeLa细胞)中的内源性APE1。该制备生物传感器的方法参照(Sensors and Actuators B:Chemical，330(2021)129332.)制得。将细胞提取液(含约106个细胞/50μL)稀释不同倍数，用2μL稀释的细胞裂解液取代上述APE1检测系统中的APE1，进行不同浓度APE1的样品的分析。结果如图12所示，荧光增加速率与稀释倍数高度相关。因此，该方法可用于单细胞水平生物样本中的APE1。
由此，本申请实施例发现的机理表明，在设计基于功能化AuNPs的生物传感器或功能器件时，应考虑静电排斥力、非特异性吸附和空间位阻对不同分析物的影响。
APE1在DNA损伤的碱基切除修复(BER)通路中起着关键作用，以维持基因组稳定性。它还参与调节细胞对氧化应激条件的反应。在肿瘤细胞中发现APE1的表达/定位异常。APE1特异性地将磷酸二酯直接裂解到5’到dsDNA的无嘌呤/无嘧啶位点(AP位点)，并产生一个短的DNA链。
HS-ssDNA标记的AuNPs经常被用于组装各种DNA纳米传感器或纳米器件。然而，分析物与AuNPs的相互作用经常被忽视。而本申请实施例通过监测不同长度的DNAzymes的裂解速率，系统地探讨了非特异性吸附、静电排斥力和空间位阻对DNA分析物的影响。结果揭示了非特异性吸附、静电斥力和空间位阻的关键作用，这对于设计和调节基于AuNPs的生物传感器或功能器件应进行仔细评估。本申请实施例还成功地采用了这些发现，使用于生物标志物检测的可扩增生物传感器的设计合理化。APE1检测生物传感器的设计和验证表明，对分析物与HS-ss-ssDNA功能化AuNPs之间相互作用的进一步理解，可能有助于未来生物传感器和纳米器件的发展。
以上所述，仅为本申请较佳的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。
序列表
<110> 华中科技大学
<120> 用于裂解DNA/RNA嵌合体的DNAzyme组合、长链DNAzyme及应用
<160> 19
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(1)
<223> Hs
<220>
<221> modified_base
<222> (30)..(30)
<223> FAM
<400> 1
tttttttttt ttttcactat rggaagagat 30
<210> 2
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(1)
<223> BHQ-1
<220>
<221> modified_base
<222> (16)..(16)
<223> FAM
<400> 2
cactatrgga agagat 16
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
atctcttctc cgagccggtc gaaatagtg 29
<210> 4
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
tagaaccgaa tttgtgatct cttctccgag ccggtcgaaa tagtg 45
<210> 5
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
ttttttatct cttctccgag ccggtcgaaa tagtg 35
<210> 6
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
tttttttttt ttttttatct cttctccgag ccggtcgaaa tagtg 45
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> modified_base
<222> (29)..(29)
<223> biotin
<400> 7
atctcttctc cgagccggtc gaaatagtg 29
<210> 8
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(1)
<223> biotin
<400> 8
atctcttctc cgagccggtc gaaatagtg 29
<210> 9
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
atctcttctc cgagccggtc gaaatagtga aaaaa 35
<210> 10
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
atctcttctc cgagccggtc gaaatagtga aaaaaaaaaa aaaaa 45
<210> 11
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
atctcttctc cgagccggtc gaaatagtgt ttttt 35
<210> 12
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
atctcttctc cgagccggtc gaaatagtgt tttttttttt ttttt 45
<210> 13
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(1)
<223> Hs
<400> 13
tttttttttt ttttagctac agrygtccga ta 32
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(1)
<223> BHQ-1
<220>
<221> modified_base
<222> (18)..(18)
<223> FAM
<400> 14
agctacagry gtccgata 18
<210> 15
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 15
tatcggacag gctagctaca acgactgtag ct 32
<210> 16
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 16
tttttttatc ggacaggcta gctacaacga ctgtagct 38
<210> 17
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 17
tttttttttt tttttttatc ggacaggcta gctacaacga ctgtagct 48
<210> 18
<211> 63
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 18
tttttttttt ttttcgatta gcattaagtt gtaaatctct tctccgagcc ggtcgaaata 60
gtg 63
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 19
atattacaac ttaatgctaa tcg 23

Claims (10)

1.一种用于裂解DNA/RNA嵌合体的DNAzyme组合，所述DNA/RNA嵌合体具有至少一个核糖核苷酸位点，所述核糖核苷酸位点将所述DNA/RNA嵌合体分为第一段和第二段；
所述DNAzyme组合包括第一DNAzyme和第二DNAzyme，所述第一DNAzyme和所述第二DNAzyme具有相同的催化序列，所述催化序列具有催化环以及连接在所述催化环两端的两个连接臂，两个所述连接臂分别用于与所述第一段和所述第二段杂交，以将所述DNA/RNA嵌合体裂解为由所述第一段形成的片段和由所述第二段形成的片段；
所述第一DNAzyme还具有连接在所述催化序列5’端的第一非催化序列，所述第一DNAzyme具有与连接在载体表面的所述DNA/RNA嵌合体杂交并催化所述DNA/RNA嵌合体裂解的第一活性，所述第二DNAzyme具有与连接在载体表面的所述DNA/RNA嵌合体杂交并催化所述DNA/RNA嵌合体裂解的第二活性，所述第一活性小于所述第二活性。
2.根据权利要求1所述的DNAzyme组合，其特征在于，所述第一非催化序列为16bp的脱氧核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的DNAzyme组合，其特征在于，所述第一非催化序列为6～16个胸腺嘧啶核苷酸序列。
4.根据权利要求1所述的DNAzyme组合，其特征在于，所述第一DNAzyme和所述第二DNAzyme均还具有连接在所述催化序列3’端的第二非催化序列，连接在所述第一DNAzyme中的第二非催化序列为6～16个胸腺嘧啶核苷酸序列，连接在所述第二DNAzyme中的第二非催化序列为6～16个腺嘌呤啶核苷酸序列。
5.根据权利要求1-4任一项所述的DNAzyme组合，其特征在于，所述DNA/RNA嵌合体的5’端连接在载体表面、3’端连接荧光基团。
6.一种用于APE1检测的长链DNAzyme，其具有催化序列以及连接在所述催化序列5’端的第一非催化序列；
所述催化序列用于与连接在载体表面的DNA/RNA嵌合体杂交，所述DNA/RNA嵌合体具有至少一个核糖核苷酸位点，所述核糖核苷酸位点将所述DNA/RNA嵌合体分为第一段和第二段；
所述第一非催化序列具有中间区域和无关区域，其中，所述中间区域为双链区域，所述双链区域具有靠近所述催化序列一端的AP位点，所述AP位点可被所述APE1特异性识别，促使所述长链DNAzyme转变成短链DNAzyme，所述短链DNAzyme具有与所述催化序列相同的序列和结构；
所述长链DNAzyme具有裂解标记在AuNPs上的DNA/RNA嵌合体的第三活性，所述短链DNAzyme具有裂解标记在AuNPs上的DNA/RNA嵌合体第四活性，所述第三活性小于所述第四活性。
7.根据权利要求6所述的长链DNAzyme，其特征在于，所述无关区域为16bp的脱氧核苷酸的单链序列。
8.根据权利要求6所述的长链DNAzyme，其特征在于，所述无关区域为6～16个胸腺嘧啶核苷酸的单链序列。
9.根据权利要求6所述的长链DNAzyme，其特征在于，所述无关区域为生物素或生物素和链霉亲和素连接的复合体。
10.权利要求1-5任一项所述的DNAzyme组合、或权利要求6-9任一项所述的长链DNAzyme在制备检测APE1的生物传感器或试剂盒中的应用。
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