CN110129416A - DNA walker信号放大构建MnO2-UCNPs荧光共振能量转移分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种DNA walker信号放大构建MnO2‑UCNPs荧光共振能量转移分析方法。该方法利用核酸链置换反应和Mn2+介导DNAzyme剪切，实现3D DNA walker在特定轨道上的自发行走过程，借助其优越的信号放大能力，同时结合MnO2‑UCNPs荧光共振能量转移的信号读出装置，实现荧光信号放大。该方法能够实现对Hela细胞在50~2000个数范围内的端粒酶活性高灵敏检测，其检测限低至23个Hela细胞，并有望用于人体复杂尿样的检测。

Description

DNA walker信号放大构建MnO2-UCNPs荧光共振能量转移分析 方法
技术领域
本发明涉及了一种DNA walker信号放大构建MnO2-UCNPs荧光共振能量转移分析方法，属于纳米材料和生物传感分析技术领域。
背景技术
上转换纳米材料（UCNPs）能够将低能量的近红外光子转换成高能量的可见光，使其广泛应用于生物分析和生物医学领域。相对于传统的荧光染料，UCNPs不仅具有良好的发光效率和生物相容性，而且具有高效的光稳定性、低自体荧光、大的反Stokes位移，高信噪比等优异性能。二氧化锰（MnO2）作为二维过渡金属氧化物，由于其具有宽的吸收光谱和大表面积，而被用作高效的荧光猝灭剂。目前，以MnO2为荧光受体，UCNPs为荧光供体构建的荧光共振能量转移（FRET）传感方法已经引起科研工作者的不少关注。因此，本发明基于具有良好发展前景的MnO2-UCNPs的FRET传感体系进行生物领域的研究。
DNA walker是一种新兴的DNA分子机器，能够在预设的DNA轨道上精确移动，并作为优异的信号放大技术应用于生物传感分析方法。DNA walker信号放大机制利用目标分子触发反应和特异的作用方式（如：支点调制的链置换、核酸调制的水解、DNAzyme介导的链剪切等）在DNA轨道上实现放大过程。比较一维和二维DNA分子轨道，三维轨道具有更高的迁移能力和富集效率。
端粒酶作为一种核糖核酸蛋白复合物，以其特定的RNA为模板，通过逆转录作用催化端粒重复序列(TTAGGG)n到人类染色体的3'末端。大量研究表明，端粒酶能够用于癌症早期诊断、预后监控和癌症发病机理的了解。本发明以三维DNA walker信号放大策略结合MnO2-UCNPs荧光共振能量转移（FRET）过程作为荧光信号传感平台，用于端粒酶活性的灵敏、特异性检测。利用端粒酶催化延伸反应启动DNA walker在磁珠的3D轨道表面的行走过程。随着DNA自发行走过程中Mn2+依赖型的DNAzyme被不断识别剪切，触发链trigger DNA被不断释放生成。Trigger DNA利用其与UCNPs表面修饰的DNA链进行双链杂交互补作用，破坏MnO2-UCNPs的FRET过程，从而增强UCNPs的上转换荧光信号。因此，利用DNA walker优异的信号放大能力，实现对端粒酶活性的高灵敏检测。
发明内容
基于以上背景，本发明的目的在于提供一种分析方法用于端粒酶活性的高灵敏检测。该方法利用核酸链置换反应和Mn2+介导DNAzyme剪切，实现三维DNA walker信号放大过程，同时结合MnO2-UCNPs荧光共振能量转移的信号读出装置，显著放大荧光信号，从而实现对端粒酶活性的高灵敏检测。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
包括如下步骤：
（1）制备NaYF4:Yb,Tm上转换纳米材料（UCNPs）和MnO2纳米片；
（2）将双链DNA walker支架序列（scaffold strand）和基底序列（substrate strand）分别锚定于亲和素修饰的磁珠（MBs）上形成DNA walker-MBs复合结构；
（3）将特定DNA序列（CP）连接于UCNPs获得CP-UCNPs，利用CP序列与MnO2的吸附作用，构建MnO2-UCNPs复合结构；
（4）利用端粒酶催化获得含(TTAGGG)n的延伸序列，该序列通过链置换作用于双链DNAwalker支架序列，驱动步骤（2）制得的DNA walker-MBs复合结构；在磁珠三维轨道上，双链DNA walker支架序列中Mn2+依赖型DNAzyme序列部分能够自由地与基底序列结合形成DNAzyme复合结构，Mn2+金属离子识别该结构的特定位点，并剪切释放Trigger DNA；生成的大量Trigger DNA与步骤（3）制得的MnO2-UCNPs复合结构进行孵育，由于CP序列与TriggerDNA杂交互补，MnO2-UCNPs结构破坏，UCNPs荧光信号恢复；在三维DNA walker信号放大作用下，实现端粒酶活性的荧光定量检测。
上述步骤（1）的具体制备方法为：
NaYF4:Yb,Tm上转换纳米材料（UCNPs）的制备：将 0.78 mmol YCl3·6H2O，0.20 mmolYbCl3·6H2O和0.02 mmol TmCl3·6H2O的镧系金属盐加入含有7 mL油酸和15 mL的1-十八烯的100 mL圆底烧瓶中，加热至150 ℃并在氮气环境中保持40 min，溶液逐渐变成澄清透明；冷却至50 ℃，逐滴加入10 mL含有4.0 mmol NH4F和2.5 mmol NaOH的甲醇溶液，搅拌40分钟；随后，在100 ℃蒸发去除甲醇溶液，将混合液进一步加热至290 ℃并保持1.5 h；反应结束，冷却至室温；合成的油酸包裹NaYF4:Yb,Tm上转换材料用乙醇清洗并分散于环己烷中；
MnO2纳米片的制备：将含有0.6 M 四甲基氢氧化铵（TMA•OH）和浓度为3.0 wt %的H2O2的20 mL水溶液快速加入10 mL 0.3 M MnCl2•4H2O，在15 s内黑棕色溶液快速生成，并在室温下剧烈搅拌过夜，确保空气充分氧化；在2000 rpm转速下离心15 min，并用超纯水和甲醇多次清洗获得大量的MnO2纳米片；随后，25 mg MnO2被重新分散在20 mL水溶液，超声10 h；再次在2000 rpm下离心30 min，去除残留的未剥落的MnO2，收集含有MnO2纳米片的上清液；利用ICP-OES法测得MnO2纳米片浓度为5 mg L-1。
上述步骤（2）的具体制备方法为：
将含有1 μM walking链（walking strand）和1 μM locking链（locking strand）的5mM pH 7.4 Tris-HCl缓冲溶液中混合95 °C退火3分钟，随后冷却至室温，形成双链DNAwalker支架序列；将亲和素修饰的磁珠（MBs）用5 mM Tris-HCl缓冲溶液洗涤，并重新分散于500 μL 5 mM Tris-HCl缓冲液，并加入500 μL 5 nM双链 DNA walker支架序列和基底序列，混合孵育15 min；利用磁性分离法将未连接作用于磁珠表面的序列去除；再者，将修饰成功的DNA walker-MBs复合结构用缓冲溶液清洗3次，最后，DNA walker-MBs复合结构重新分散于500 μL 5 mM缓冲液，并在4 °C保存。
上述步骤（2）中所用的Tris-HCl缓冲液均为：含有0.5 mM EDTA和1 M NaCl的5 mMpH 7.4的Tris-HCl缓冲溶液。
上述步骤（3）中CP的特定序列为：5'-TTTTTTTTATCGATTGGCCAGGTTAGCT-3'。
上述步骤（3）中CP@UCNPs的制备和MnO2-UCNPs复合结构制备：
将1.0 mg OA-UCNPs重新分散于1.0 mL 0.1 mM HCl超声1 h，移除油酸（OA）配体；通过12000 rpm离心0.5 h，并用去离子水洗涤三次获得油酸配体去除的UCNPs，最后，配体去除的UCNPs重新分散于1.0 mL去离子水；
由100 µL 5.0 µM CP序列和0.5 mL油酸配体去除的UCNPs溶液混合搅拌24 h；随后，甘油磷酸二钠盐水合物（GDSH）作为阻断剂加入上述溶液，最终浓度为100 µM；在搅拌24 h后获得CP@UCNPs，CP@UCNPs通过离心收集并用去离子水清洗三次；最后重新分散于含有50 mMNaCl的10 mM pH 7.4的Tris-HCl缓冲溶液；将上述制得的CP@UCNPs与5mg L-1 MnO2纳米片搅拌混合作用，利用CP序列与MnO2的吸附作用，获得MnO2-UCNPs的复合结构。
上述步骤（4）中端粒酶来自端粒酶提取液，该提取液的制备方法为：用含10wt％胎牛血清的DMEM培养基在37 °C的潮湿环境中进行HeLa细胞培养，在指数生长阶段收集细胞，并用血细胞计计数，有1 × 106个细胞被收集在EP管中；将细胞用冰冷却的浓度为0.1 M、pH 7.4的PBS洗涤2次，并重新分散于200 μL冰冷却的CHAPS裂解缓冲液，CHAPS裂解缓冲液为10mM Tris-HCl，pH 7.5，1mM MgCl2，1mM EGTA，0.1mM PMSF，0.5wt% CHAPS，10wt%甘油；将该裂解液在冰中孵育30 min，并在16000 rpm转速下离心30 min，收集上层清液并转移至1.5 mL EP管，置于-80 °C下保存。
具体地说，本发明一种DNA Walker信号放大构建MnO2-UCNPs荧光共振能量转移分析方法，包括如下步骤：
（1）制备NaYF4:Yb,Tm上转换纳米材料（UCNPs）和MnO2纳米片；
（2）将双链DNA walker支架序列（scaffold strand）和基底序列（substrate strand）分别锚定于亲和素修饰的磁珠（MBs）上形成DNA walker-MBs复合结构；
（3）将特定DNA序列（CP）连接于UCNPs获得CP-UCNPs，利用CP序列与MnO2的吸附作用，构建MnO2-UCNPs荧光共振能量转移传感平台；
（4）利用端粒酶催化获得含(TTAGGG)n的延伸序列，该序列通过链置换作用于DNAwalker支架序列，驱动步骤（2）制得的DNA walker-MBs复合结构；在磁珠三维轨道上，该Mn2+依赖型的DNAzyme序列能够与基底序列结合形成DNAzyme复合结构，Mn2+金属离子识别该结构的特定位点，并剪切释放Trigger DNA；将生成的大量Trigger DNA与步骤（3）制得的MnO2-UCNPs复合结构进行孵育，由于CP序列与Trigger DNA杂交互补，MnO2-UCNPs结构破坏，UCNPs荧光信号恢复。在三维DNA walker信号放大作用下，实现端粒酶活性的荧光定量检测。
步骤（1）具体方法为：
NaYF4:Yb,Tm上转换纳米材料（UCNPs）的制备：将 0.78 mmol YCl3·6H2O，0.20 mmolYbCl3·6H2O和0.02 mmol TmCl3·6H2O的镧系金属盐 加入含有7 mL油酸和15 mL的1-十八烯的100 mL圆底烧瓶中，加热至150 ℃ 并在氮气环境中保持40 min，溶液逐渐变成澄清透明。冷却至50 ℃，逐滴加入10 mL含有4.0 mmol NH4F和2.5 mmol NaOH的甲醇溶液，搅拌40分钟。随后，在100 ℃下蒸发去除甲醇溶液，将混合液进一步加热至290 ℃并保持1.5 h。反应结束，冷却至室温。合成的油酸包裹的NaYF4:Yb,Tm上转换材料用乙醇清洗并分散于环己烷中。
MnO2纳米片的制备：将含有0.6 M TMA•OH和浓度为3.0 wt % H2O2的20 mL水溶液快速加入10 mL 0.3 M MnCl2•4H2O，在15 s内黑棕色溶液快速生成，并在室温下剧烈搅拌过夜，确保空气充分氧化。在2000 rpm转速下离心15 min，并用超纯水和甲醇多次清洗获得大量的MnO2纳米片。随后，25 mg MnO2被重新分散在20 mL水溶液，超声10 h。再次在2000 rpm下离心30 min，去除残留的未剥落的MnO2，收集含有MnO2纳米片的上清液。利用ICP-OES法测定的的MnO2纳米片浓度为5 mg L-1。
步骤（2）具体方法为：将含有1 μM walking链和1 μM locking链的5 mM Tris-HCl缓冲溶液（pH 7.4）中混合95 °C退火3分钟，随后冷却至室温，形成双链DNA walker支架序列。将亲和素修饰的磁珠（MBs）用5 mM Tris-HCl缓冲溶液洗涤，并重新分散于500 μL上述缓冲液，并加入500 μL 5 nM DNA walker模板链和基底链，混合孵育15 min。利用磁性分离法将未连接作用于磁珠表面的walker模板链和基底链去除。再者，将修饰成功的DNAwalker-MBs用缓冲溶液清洗3次，最后，DNA walker-MBs重新分散于500 μL上述缓冲液，并在4 °C保存。
步骤（2）中亲和素修饰的磁珠（MBs）所用缓冲液为：含有0.5 mM EDTA和1 M NaCl的5 mM Tris-HCl缓冲溶液（pH 7.4）。
步骤（3）中CP的特定序列为：5'-TTTTTTTTATCGATTGGCCAGGTTAGCT-3'。
步骤（3）中CP@UCNPs的制备和MnO2-UCNPs制备：
将1.0 mg OA-UCNPs重新分散于1.0 mL 0.1 mM HCl超声1 h，移除油酸（OA）配体；通过12000 rpm离心0.5 h，并用去离子水洗涤三次获得油酸配体去除的UCNPs。最后，配体去除的UCNPs重新分散于1.0 mL去离子水。
由100 µL 5.0 µM CP序列和0.5 mL油酸配体去除的UCNPs溶液混合搅拌24 h。随后，磷酸甘油二钠水合物(GDSH)作为阻断剂加入上述溶液，最终浓度为100 µM。在搅拌24 h后，CP@UCNPs通过离心收集并用去离子水清洗三次。最后重新分散于含有50 mM NaCl的10mM Tris-HCl缓冲溶液（pH 7.4）。将上述制得的CP@UCNPs与5mg L-1 MnO2纳米片搅拌混合作用，利用CP序列与MnO2的吸附作用，获得MnO2-UCNPs的复合结构。
本发明的优点如下：
1．本发明提供一种三维（3D）DNA walker信号放大分析方法用于端粒酶活性的高灵敏检测。
2．本发明所提供的分析方法在端粒酶催化扩增反应下启动，并由DNAzyme催化下驱动剪切，从而实现3D DNA walker的快速信号放大过程。
3．本发明以MnO2-UCNPs荧光共振能量转移（FRET）作为荧光信号读出装置。
4．本发明将3D DNA walker放大技术和MnO2-UCNPs的FRET分析方法相结合，提高了传感器的检测灵敏度，并为荧光生物传感的开发提供了一种新的研究思路。
附图说明
图1为DNA walker信号放大构建MnO2-UCNPs荧光共振能量转移分析方法示意图。
图2为透镜表征对照图，图中的（A）为NaYF4:Yb,Tm上转换纳米材料（UCNPs）的透镜表征图，图中的（B）为MnO2纳米片的透镜表征图，图中的（C）为MnO2-UCNPs的透镜表征图。
图3为本发明分析方法的荧光响应图。
图4为本发明分析方法的标准工作曲线图。
图5为本发明分析方法的选择性。
具体实施方式
下面通过具体实施示例对本发明的技术方案做进一步说明，但是不能以此限制本发明的范围。
实施例1
1. 制备NaYF4:Yb,Tm上转换纳米材料（UCNPs）和MnO2纳米片：
1）油酸（OA）包裹的NaYF4:Yb,Tm上转换纳米材料（UCNPs）的制备方法：将 0.78 mmolYCl3·6H2O，0.20 mmol YbCl3·6H2O和0.02 mmol TmCl3·6H2O的镧系金属盐加入含有7 mL油酸和15 mL的1-十八烯的100 mL圆底烧瓶中，加热至150 ℃ 并在氮气环境中保持40min，溶液逐渐变成澄清透明。冷却至50 ℃，逐滴加入10 mL含有4.0 mmol NH4F和2.5 mmolNaOH的甲醇溶液，搅拌40分钟。随后，在100 ℃下蒸发去除甲醇溶液，将混合液进一步加热至290 ℃并保持1.5 h。反应结束，冷却至室温。合成的OA包裹的NaYF4:Yb,Tm上转换材料（OA-UCNPs）用乙醇清洗并分散于环己烷中。所得UCNPs进行透射电镜（TEM）表征，如图2中的A所示。该材料具有均一球型结构，平均粒径为32 ± 2.3 nm。
2）MnO2纳米片的制备方法：将含有0.6 M TMA•OH 和浓度为3.0 wt %H2O2的20 mL水溶液快速加入10 mL 0.3 M MnCl2·4H2O，在15 s内黑棕色溶液快速生成，并在室温下剧烈搅拌过夜，确保空气充分氧化。在2000 rpm转速下离心15 min，并用超纯水和甲醇多次清洗获得大量的MnO2纳米片。随后，25 mg MnO2被重新分散在20 mL水溶液，超声10 h。再次在2000 rpm下离心30min，去除残留的未剥落的MnO2，收集含有MnO2纳米片的上清液。利用ICP-OES法测定的的MnO2纳米片浓度为5mg L-1。所得MnO2透射电镜表征如图2中的B所示。该材料具有平面片状结构。
3）CP@UCNPs和MnO2-UCNPs的制备方法：
将步骤1）制得的1.0 mg OA-UCNPs重新分散于1.0 mL 0.1 mM HCl超声1 h，移除油酸（OA）配体；通过12000 rpm离心0.5 h，并用去离子水洗涤三次获得油酸配体去除的UCNPs。最后，配体去除的UCNPs重新分散于1.0 mL去离子水。
由100 µL 5.0 µM CP序列（TTTTTTTTATCGATTGGCCAGGTTAGCT）和0.5 mL油酸配体去除的UCNPs溶液混合搅拌24 h。随后，甘油磷酸二钠盐水合物（GDSH）作为阻断剂加入上述溶液，最终浓度为100 µM。在搅拌24 h后，CP@UCNPs通过离心收集并用去离子水清洗三次。最后重新分散于含有50 mM NaCl的10 mM Tris-HCl缓冲溶液（pH 7.4）。将上述制得的CP@UCNPs与步骤2）制得的5mg L-1 MnO2纳米片搅拌混合作用，利用CP序列与MnO2的吸附作用，获得MnO2-UCNPs的复合结构，透射电镜表征如图2中的C所示。
2. 端粒酶催化扩增反应驱动3D DNA walker的信号放大过程：
1）将含有1 μM walking链（5'- Biotin-(T)45AGGGTTAGGGTTATCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGT-3'）和1 μM locking链（5'- AAGAGATAACCCTAACCCTAACCCTAAAACTC-3'）的5 mMTris-HCl缓冲溶液（pH 7.4）中混合95 °C退火3分钟，随后冷却至室温，形成双链DNAwalker支架序列。将亲和素修饰的磁珠（MBs）（购买自美国Dynal生物技术公司）用5 mMTris-HCl缓冲溶液洗涤，并重新分散于500 μL Tris-HCl缓冲液，并加入500 μL的5 nM双链DNA walker支架序列和基底序列（Biotin-(T)14ACTATrAGGAAGAGATAGCTAACCTGGCCAATCGAT），混合孵育15 min。利用磁性分离法将未连接作用于磁珠表面的双链walker支架序列和基底序列去除。再者，将修饰成功的DNA walker-MBs复合结构用5 mM Tris-HCl缓冲溶液清洗3次，最后，DNA walker-MBs复合结构重新分散于500 μL 5 mM Tris-HCl缓冲液，并在4 °C下保存。
2）取20 μL端粒酶提取液加入30 μL延伸反应液（含20 mM Tris-HCl缓冲液pH8.3，4 mM MgCl2，1 mM EGTA，63 mM KCl，0.05% Tween 20和2.5 mM dNTPs）（其中dNTPs为三磷酸碱基脱氧核苷酸）和20 nm TS引物链（5'- AATCCGTCGAGCAGAGTT-3'），在37 °C下孵育1 h，TS引物链延伸获得富含(TTAGGG)n的序列（Extension strand），随后在95 °C下保持15 min发生热变性终止延伸反应。接着，将上述反应液与50 μL 步骤1）制得的DNA walker-MBs复合结构和50 μL 1.2 mM MnCl2在37 °C下混合30 min。在该过程中，形成的Mn2+依赖型的DNAzyme结构被特异性剪切并释放Trigger链，恢复自由的walking链在三维轨道上不断重新作用于DNA walker基底链，释放大量的Trigger链，从而实现3D DNA walker的信号放大过程。利用磁性分离去除MBs纳米粒子，将3D DNA walker信号放大所获得的含有大量Trigger链的上清液（溶液1）转移至含有50 μL MnO2-UCNPs复合悬浮液（溶液2）中，37 °C孵育25 min。Trigger链与UCNPs表面修饰CP链杂交，从而UCNPs的荧光信号恢复，并显著增强。
上述的端粒酶来自端粒酶提取液，该提取液的制备方法为：用含10wt％胎牛血清的DMEM（含各种氨基酸和葡萄糖）培养基（购自美国Gibco公司）在37 °C的潮湿环境中进行HeLa细胞培养，在指数生长阶段收集细胞，并用血细胞计计数，有1 × 106个细胞被收集在EP管中；将细胞用浓度为0.1 M、pH 7.4的冰冷却PBS洗涤2次，并重新分散于200 μL冰冷却的CHAPS裂解缓冲液，CHAPS裂解缓冲液为10mM Tris-HCl，pH 7.5，1mM MgCl2，1mM EGTA，0.1mM PMSF，0.5wt% CHAPS，10wt%甘油；将该裂解液在冰中孵育30 min，并在16000 rpm转速下离心30 min，收集上层清液并转移至1.5 mL EP管，置于-80 °C下保存。
3. 端粒酶活性检测
将上述步骤2中所获得的溶液1和溶液2充分混合，并进行荧光光谱检测。在980 nm激发光作用下，采用F-4600荧光分光光度计测得该反应系统的荧光信号。如图3所示，随着细胞个数的增多，端粒酶活性增强，荧光强度亦逐渐增强，当Hela细胞在50~2000个数响应范围内，标准工作曲线如图4所示，检测限为23个细胞。该方法的选择性如图5所示，phi29 DNA聚合酶（20 U），溶菌酶（20 U），抗外血酸（0.2 mM），加热过的Hela细胞（350 个）和HL-7702细胞提取液对荧光信号均没有明显响应。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (7)

1.一种DNA walker信号放大构建MnO2-UCNPs荧光共振能量转移分析方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）制备NaYF4:Yb,Tm上转换纳米材料（UCNPs）和MnO2纳米片；
（2）将双链DNA walker支架序列（scaffold strand）和基底序列（substrate strand）分别锚定于亲和素修饰的磁珠（MBs）上形成DNA walker-MBs复合结构；
（3）将特定DNA序列（CP）连接于UCNPs获得CP-UCNPs，利用CP序列与MnO2的吸附作用，构建MnO2-UCNPs复合结构；
（4）利用端粒酶催化获得含(TTAGGG)n的延伸序列，该序列通过链置换作用于双链DNAwalker支架序列，驱动步骤（2）制得的DNA walker-MBs复合结构；在磁珠三维轨道上，双链DNA walker支架序列中Mn2+依赖型DNAzyme序列部分能够自由地与基底序列结合形成DNAzyme复合结构，Mn2+金属离子识别该结构的特定位点，并剪切释放Trigger DNA；生成的大量Trigger DNA与步骤（3）制得的MnO2-UCNPs复合结构进行孵育，由于CP序列与TriggerDNA杂交互补，MnO2-UCNPs结构破坏，UCNPs荧光信号恢复；在三维DNA walker信号放大作用下，实现端粒酶活性的荧光定量检测。
2.根据权利要求1所述的DNA walker信号放大构建MnO2-UCNPs荧光共振能量转移分析方法，其特征在于，步骤（1）具体制备方法为：
NaYF4:Yb,Tm上转换纳米材料（UCNPs）的制备：将 0.78 mmol YCl3·6H2O，0.20 mmolYbCl3·6H2O和0.02 mmol TmCl3·6H2O的镧系金属盐加入含有7 mL油酸和15 mL的1-十八烯的100 mL圆底烧瓶中，加热至150 ℃并在氮气环境中保持40 min，溶液逐渐变成澄清透明；冷却至50 ℃，逐滴加入10 mL含有4.0 mmol NH4F和2.5 mmol NaOH的甲醇溶液，搅拌40分钟；随后，在100 ℃蒸发去除甲醇溶液，将混合液进一步加热至290 ℃并保持1.5 h；反应结束，冷却至室温；合成的油酸包裹NaYF4:Yb,Tm上转换材料用乙醇清洗并分散于环己烷中；
MnO2纳米片的制备：将含有0.6 M 四甲基氢氧化铵（TMA•OH）和浓度为3.0 wt %的H2O2的20 mL水溶液快速加入10 mL 0.3 M MnCl2•4H2O，在15 s内黑棕色溶液快速生成，并在室温下剧烈搅拌过夜，确保空气充分氧化；在2000 rpm转速下离心15 min，并用超纯水和甲醇多次清洗获得大量的MnO2纳米片；随后，25 mg MnO2被重新分散在20 mL水溶液，超声10 h；再次在2000 rpm下离心30 min，去除残留的未剥落的MnO2，收集含有MnO2纳米片的上清液；利用ICP-OES法测得MnO2纳米片浓度为5 mg L-1。
3.根据权利要求1所述的DNA walker信号放大构建MnO2-UCNPs荧光共振能量转移分析方法，其特征在于，步骤（2）具体制备方法为：
将含有1 μM walking链（walking strand）和1 μM locking链（locking strand）的5mM pH 7.4 Tris-HCl缓冲溶液中混合95 °C退火3分钟，随后冷却至室温，形成双链DNAwalker支架序列；将亲和素修饰的磁珠（MBs）用5 mM Tris-HCl缓冲溶液洗涤，并重新分散于500 μL 5 mM Tris-HCl缓冲液，并加入500 μL 5 nM双链 DNA walker支架序列和基底序列，混合孵育15 min；利用磁性分离法将未连接作用于磁珠表面的序列去除；再者，将修饰成功的DNA walker-MBs复合结构用缓冲溶液清洗3次，最后，DNA walker-MBs复合结构重新分散于500 μL 5 mM缓冲液，并在4 °C保存。
4.根据权利要求3所述的DNA walker信号放大构建MnO2-UCNPs荧光共振能量转移分析方法，其特征在于，步骤（2）中所用的Tris-HCl缓冲液均为：含有0.5 mM EDTA和1 M NaCl的5 mM pH 7.4的Tris-HCl缓冲溶液。
5.根据权利要求1所述的DNA walker信号放大构建MnO2-UCNPs荧光共振能量转移分析方法，其特征在于，步骤（3）中CP的特定序列为：
5'-TTTTTTTTATCGATTGGCCAGGTTAGCT-3'。
6.根据权利要求1所述的DNA walker信号放大构建MnO2-UCNPs荧光共振能量转移分析方法，其特征在于，步骤（3）中CP@UCNPs的制备和MnO2-UCNPs复合结构制备：
将1.0 mg OA-UCNPs重新分散于1.0 mL 0.1 mM HCl超声1 h，移除油酸（OA）配体；通过12000 rpm离心0.5 h，并用去离子水洗涤三次获得油酸配体去除的UCNPs，最后，配体去除的UCNPs重新分散于1.0 mL去离子水；
由100 µL 5.0 µM CP序列和0.5 mL油酸配体去除的UCNPs溶液混合搅拌24 h；随后，甘油磷酸二钠盐水合物（GDSH）作为阻断剂加入上述溶液，最终浓度为100 µM；在搅拌24 h后获得CP@UCNPs，CP@UCNPs通过离心收集并用去离子水清洗三次；最后重新分散于含有50 mMNaCl的10 mM pH 7.4的Tris-HCl缓冲溶液；将上述制得的CP@UCNPs与 5
mg L-1 MnO2纳米片搅拌混合作用，利用CP序列与MnO2的吸附作用，获得MnO2-UCNPs的复合结构。
7.根据权利要求1所述的DNA walker信号放大构建MnO2-UCNPs荧光共振能量转移分析方法，其特征在于，步骤（4）中端粒酶来自端粒酶提取液，该提取液的制备方法为：用含10wt％胎牛血清的DMEM培养基在37 °C的潮湿环境中进行HeLa细胞培养，在指数生长阶段收集细胞，并用血细胞计计数，有1 × 106个细胞被收集在EP管中；将细胞用冰冷却的浓度为0.1 M、pH 7.4的PBS洗涤2次，并重新分散于200 μL冰冷却的CHAPS裂解缓冲液，CHAPS裂解缓冲液为10mM Tris-HCl，pH 7.5，1mM MgCl2，1mM EGTA，0.1mM PMSF，0.5wt% CHAPS，10wt%甘油；将该裂解液在冰中孵育30 min，并在16000 rpm转速下离心30 min，收集上层清液并转移至1.5 mL EP管，置于-80 °C下保存。
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