KR102005366B1

KR102005366B1 - 다공성 복합 나노구조체를 이용한 바이오물질의 포집 및 진단 시스템 및 방법

Info

Publication number: KR102005366B1
Application number: KR1020170174773A
Authority: KR
Inventors: 이경균; 김경훈; 이광세; 배남호; 이석재; 정 김; 박인규
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2017-12-19
Filing date: 2017-12-19
Publication date: 2019-07-30
Also published as: KR20190073691A

Abstract

본 개시 내용의 구체예에 따르면, 본 개시 내용은 고분자 스펀지 구조물 상에 산화아연(ZnO) 재질의 나노와이어를 형성시킨 다공성 복합 나노구조체를 이용하여 박테리아, 바이러스 등의 바이오물질을 간편하면서도 고효율로 포집하고, 검출할 수 있는 진단 플랫폼을 제공할 수 있는 시스템 및 방법이 기재된다.

Description

다공성 복합 나노구조체를 이용한 바이오물질의 포집 및 진단 시스템 및 방법{System and Method for Capturing and Assaying Biomaterials Using Porous Hybrid Nano-structures}

본 개시 내용은 다공성 복합 나노구조체를 이용한 바이오물질의 포집 및 진단 시스템 및 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 개시 내용은 고분자 스펀지 구조물 상에 산화아연(ZnO) 재질의 나노와이어를 형성시킨 다공성 복합 나노구조체를 이용하여 박테리아, 바이러스 등의 바이오물질을 간편하면서도 고효율로 포집하고, 검출할 수 있는 진단 플랫폼을 제공할 수 있는 시스템 및 방법에 관한 것이다.

인간을 포함한 모든 온혈동물의 장 내에는 박테리아, 바이러스 등과 같은 다양한 병원체가 서식하는데 매우 좋은 환경이 제공되고 있다. 병원체는 주변 환경에서 널리 분포되어 있는 바, 구체적으로 박테리아 병원체는 흙, 동물 장기, 동물의 변에 의하여 오염된 물 등에서 발견되고 있다. 인체 역시 평균적으로 인체 내외에 걸쳐 150 타입 이상의 박테리아를 갖고 있으며, 이중 많은 미생물들이 인체에 무해하기는 하나, 몇몇 종류는 식중독(botulism), 콜레라(cholera), 설사(diarrhea), 구토(emesis), 폐렴(pneumonia), 장티푸스(typhoid) 등을 포함하는 다양한 감염성 질환을 유발한다. 특히, 200 종류 이상의 질병이 음식 및 음용수 단독을 통하여 전염될 수 있다. 예를 들면, Escherichia Coli(또는 E.coli) 계열은 섭취시 큰 문제를 일으키지 않지만, 이중 몇몇은 설사 등을 유발하는 독소를 생성하는 병원체로 알려져 있다.

특히, 병원성 대장균 E.coli O157:H7은 장 출혈성 대장균으로서 식중독의 원인균으로 널리 알려져 있으며, 전세계적으로 문제시되고 있다. 또한, 감염 시 용혈성 요독 증후군, 출혈성 대장염, 설사, 신장부전, 발작 등을 유발하며, 심한 경우에는 사망에 이르도록 한다(Reisner, A. et al., 2006. Journal of Bacteriology. 188, 3572-3581; Barrientos, R. M. et al., 2009. Brain, Behavior, and Immunity. 23, 450-454; Schrag, S. J. et al., 2006. PEDIATRICS. 118, 570-576). 살모넬라속균(Salmonella choleraesuis, Salmonella bongori, Salmonella typhimurium) 역시 식중독을 일으키는 대표적인 병원체로서 장티푸스 및 파라티푸스의 원인균이며, 다양한 가축 및 동물 등에 오염될 수 있다. 또한, 적절한 세척, 가공온도 및 저장조건이 지켜지지 못한다면, 살모넬라균이 번식할 수 있으며, 이렇게 오염된 식수, 식품 등을 통하여 다른 식품과 교차 오염될 수 있다.

병원체는 오염된 토양, 그리고 수질 환경을 통해 쉽게 인간에게 감염될 수 있다. 통상의 조건 하에서 병원체의 번식속도는 매우 빠르기 때문에 아무리 적은 수의 병원체라도 일단 인체 내에 침입할 경우, 이의 생장환경에 매우 적합한 장 속에서 빠르게 성장하여 인간의 건강을 위협할 수 있는 수준까지 이르게 된다. 따라서, 오염된 환경으로부터 빠르고 간편하게 병원체(특히, E.coli)의 유무를 검출할 수 있는 진단 기술이 요구되고 있다. 이처럼, 유전학적 분석을 기반으로 하는 임상 진단 기술은 통상적으로 박테리아(bacteria), 균류(fungus) 또는 바이러스(virus)로부터 핵산을 회수하여 증폭 반응을 수행한 다음, 다양한 검출 수단(예를 들면, 광학적, 전기화학적 또는 기계적 바이오센서 디바이스)을 이용하여 앰플리콘(amplicon)을 분석하는 방식을 이용한다.

한편, 자연발생적으로 입수되는 환경 시료는 식수, 음식물(예를 들면, 우유, , 음식물 등), 식수, 혈액 등과 같은 다양한 오염 가능원으로부터 채취될 수 있는 바, 진단 대상인 특정(타겟) 박테리아 또는 바이러스와 같은 바이오물질이 미량으로 존재하는 경우가 일반적이다. 이와 같은 유해 바이오물질의 분석을 위하여는 해당 음식물 등을 물에 세척하고 배양한 후에 유해 바이오물질의 농도 또는 량을 측정하는 방식이 수행되고 있다.

또한, 최근 독감 바이러스로 문제시되는 H1N1 인플루엔자 바이러스 등은 공기 중에 함유되어 전파되고 있는 바, 이러한 기상 내 유해 바이오물질의 진단을 위하여 포집하기 위하여는 통상적으로 필터를 이용한 부착 방식이 이용되고 있다. 이와 관련하여, 박테리아 및 바이러스를 포집하기 위하여, 포토마스크 패턴 또는 디지털 마이크로 미러 소자 공정을 통하여 제작된 마이크로 구조물을 이용하는 기술이 개발된 바 있다(예를 들면, 국내특허번호 제1243631호 등). 또한, 기재 상에 금 코팅층을 형성하고 Br-thiol를 코팅한 후에 1.5M TMAEMA 단량체, BPY 및 구리(I) 브롬화물을 반응시켜 제조된 p-TMAEMA(poly(trimethylamino)ethyl methacrylate chloride) 브러시를 이용하여 박테리아를 포집/사멸시키는 방법(ACS Appl. Mater. Interfaces 2015, 7, 2415-2423), 그리고 수크로오스 용액, 실리카 파우더 및 황산 용액을 혼합하여 반응시킨 후, 열처리시켜 얻은 메조포러스 카본을 이용하여 박테리아 포집에 사용하는 방법(Carbon 111 (2017) 689-704)도 알려져 있다.

그러나, 전술한 기술의 경우, 미생물 또는 바이러스를 일정 수준으로 분리/포집할 수 있으나, 필터 교체 등의 과정에서 2차 감염을 일으킬 수 있고, 더욱이 이를 이용하여 신속하게 유전자를 분석 또는 진단하는데 기술적 한계가 있다. 따라서, 포집 및 진단에 비교적 많은 시간을 요구하고, 또한 복잡한 절차를 수반하기 때문에 재현성 및 효율성 면에서 문제점이 있으며, 특히 진단에 소요되는 비용이 높은 수준이다.

이처럼, 다양한 상(phase)으로 입수되는 환경 시료와 같이 저 농도로 존재하는 유해 바이오물질(예를 들면, 병원체)을 함유하는 시료에 대하여 표적 바이오물질을 용이하면서도 효과적으로 포집하고, 또한 저비용으로 정확하게 진단할 수 있는 방법에 대한 개발이 요구되고 있다.

본 개시 내용에 따른 구체예에서는 종래기술의 한계를 극복하기 위하여, 저가의 재료를 사용하면서도 바이오물질(예를 들면, 각종 병원체 등의 유해 바이오물질)을 효과적으로 포집할 수 있고, 이를 간편하면서 정확하게 진단하는 방안을 제공하고자 한다.

본 개시 내용의 제1 면에 따르면,

시료 내 함유된 바이오물질을 포집하는 방법으로서,

시료를 상기 바이오물질에 대한 고정능을 갖는 다공성 복합 나노구조체와 접촉시켜 상기 바이오물질을 상기 다공성 복합 나노구조체 상에 포집하는 단계를 포함하며,

여기서, 상기 다공성 복합 나노구조체는,

다공성 고분자 스펀지 구조물; 및

상기 스펀지 구조물 상에 형성된 복수의 산화아연 재질의 나노와이어 어레이;

를 포함하는 방법이 제공된다.

본 개시 내용의 제2 면에 따르면,

a) 바이오물질을 함유하는 시료를 상기 바이오물질에 대한 고정능을 갖는 다공성 복합 나노구조체와 접촉시켜 상기 바이오물질을 다공성 복합 나노구조체 상에 포집하는 단계;

b) 상기 포집된 바이오물질을 용해(lysis)시켜 핵산을 추출하는 단계; 및

c) 상기 추출된 핵산을 증폭하여 검출하는 단계;

를 포함하는 바이오물질의 진단 방법으로서,

여기서, 상기 다공성 복합 나노구조체는,

다공성 고분자 스펀지 구조물; 및

를 포함하는 방법이 제공된다.

본 개시 내용의 제3 면에 따르면,

시료 내 바이오물질의 포집 및 진단 시스템으로서,

다공성 고분자 스펀지 구조물, 및 상기 스펀지 구조물 상에 형성된 복수의 산화아연 재질의 나노와이어 어레이를 포함하는 다공성 복합 나노구조체, 상기 다공성 복합 나노구조체는 시료와 접촉하여 상기 나노와이어 어레이에 의하여 시료 내 바이오물질을 포집하도록 구성됨;

상기 다공성 복합 나노구조체에 포집된 바이오물질로부터 유래하는 핵산에 대한 증폭 수단; 및

상기 증폭된 핵산의 검출 수단;

을 포함하는 진단 시스템이 제공된다.

예시적 구체예에 따르면, 상기 고분자는 폴리우레탄, 폴리비닐알코올, 폴리에틸렌, 폴리스티렌 또는 이의 조합일 수 있다.

예시적 구체예에 따르면, 상기 산화아연 재질의 나노와이어는 하기의 단계를 포함하는 방법에 따라 제조될 수 있다:

(i) 상기 스펀지 구조물의 표면에 산화아연 시드층을 형성하는 단계;

(ii) 아연 전구체-함유 수용액을 제공하는 단계; 및

(iii) 상기 아연 전구체-함유 수용액 내에서 상기 시드층이 형성된 스펀지 구조물 상에 수열합성법에 의하여 산화아연을 나노와이어 형상으로 성장시키는 단계.

예시적 구체예에 따르면, 상기 시드층은 딥-코팅, 스핀-코팅, 기상증착, 또는 스퍼터링에 의하여 형성될 수 있다.

예시적 구체예에 따르면, 상기 아연 전구체-함유 수용액은, 헥사메틸렌테트라아민, 에틸렌디아민, 암모니아, 폴리에틸렌이민, 또는 이의 조합을 더 포함할 수 있다.

예시적 구체예에 따르면, 상기 단계 (iii)은 60 내지 200 ℃에서 열처리(annealing) 단계를 포함할 수 있다.

예시적 구체예에 따르면, 상기 산화아연 재질의 나노와이어의 각각의 직경은 1 내지 10 ㎛이고, 이의 길이는 10 내지 50 ㎛ 범위일 수 있다.

본 개시 내용의 구체예에 따라 제공되는 바이오물질의 포집, 또는 포집/진단 시스템 및 방법은, 다공성 복합 나노구조체를 이용한 병원체의 고정을 통하여 각종 음식물 및 식수 내 유해 병원체의 진단은 물론, 인체의 피부 접촉, 기침, 공기 전파 등 다양한 직간접적 전파 또는 감염 경로에 대하여도 유연한 진단 방안을 제공할 수 있다. 특히, 복합 나노구조체의 기저 구조물로서 저가의 스펀지(구체적으로 시판 중인 폴리우레탄 스펀지)를 사용하기 때문에 유해 바이오물질의 포집 및 진단에 소요되는 비용을 절감할 수 있는 신규 플랫폼을 제공한다.

따라서, 향후 임상 진단, 환경 모니터링, 약물 유전학 분석 등의 다양한 분야에서 광범위한 활용이 기대된다.

도 1은 본 개시 내용의 일 구체예에 따라 제작된 다공성 복합 나노구조체를 이용하여 유해 바이오물질(박테리아 등)을 포집하는 일련의 적용예를 보여주는 모식도 및 주사전자현미경(SEM) 사진이고,
도 2a 내지 도 2c는 각각 실시예 1에서 복합 나노구조체의 기저 구조물로 사용되는 대구경 포어 사이즈의 스펀지, 그리고 이에 산화아연 재질의 나노와이어를 성장시킨 복합 나노구조체의 SEM 사진, 그리고 복합 나노구조체에 포집된 박테리아(식중독균)에 대한 SEM 사진이고,
도 3a 및 도 3b는 각각 실시예 2에서 복합 나노구조체의 기저 구조물로 사용되는 중간구경 포어 사이즈의 스펀지, 그리고 이에 산화아연 재질의 나노와이어를 성장시킨 후에 포집된 박테리아(식중독균)에 대한 SEM 사진이고,
도 4a 및 도 4b는 각각 실시예 3에서 복합 나노구조체의 기저 구조물로 사용되는 소구경 포어 사이즈의 스펀지, 그리고 이에 산화아연 재질의 나노와이어를 성장시킨 후에 포집된 박테리아(식중독균)에 대한 SEM 사진이고,
도 5는 실시예 4에 따라 실시예 1 내지 3에 의하여 제작된 복합 나노구조체 각각을 이용하여 가습기 분사 및 담금 방식으로 포집한 박테리아(E. coli O157:H7)의 증폭 산물에 대한 전기영동 분석 결과를 나타내는 도면이고,
도 6은 실시예 5에 따라 중간구경 포어 사이즈를 갖는 스펀지 구조물을 기반으로 하는 복합 나노구조체를 이용하여 가습기 분사 방식에 의하여 다양한 농도의 시료로부터 박테리아를 포집하고, 포집된 박테리아에 대한 PCR 증폭 생성물에 대한 전기영동 분석 결과를 나타내는 도면이고, 그리고
도 7은 실시예 6에서 실시예 1에 따라 제작된 복합 나노구조체를 이용하여 시료 내 바이러스(H1N1 인플루엔자)를 포집한 다음, 세포 용해를 거쳐 qRT-PCR을 수행하여 얻은 분석 결과를 나타내는 그래프이다.

본 발명은 첨부된 도면을 참고로 하여 하기의 설명에 의하여 모두 달성될 수 있다. 하기의 설명은 본 발명의 바람직한 구체예를 기술하는 것으로 이해되어야 하며, 본 발명이 반드시 이에 한정되는 것은 아님을 이해해야 한다.

또한, 첨부된 도면은 이해를 돕기 위하여 실제 층의 두께(또는 높이) 또는 다른 층과의 비율에 비하여 다소 과장되게 표현된 것일 수 있으며, 그 의미는 후술하는 관련 기재의 구체적 취지에 의하여 적절히 이해될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어는 하기와 같이 정의될 수 있다.

"고분자"는 단일중합체 및 공중합체를 모두 포함하며, 공중합체는 랜덤 공중합체 및 블록 공중합체를 포함하는 것으로 이해될 수 있다.

"나노구조물" 또는 "나노구조체"는 협의로는 나노 스케일(예를 들면, 약 0.1 내지 1000 nm, 구체적으로는 1 내지 100 nm)의 치수 또는 사이즈를 갖는 특징부(feature) 또는 텍스츄어(texture), 예를 들면 나노필라, 나노로드, 나노 벽(wall), 나노와이어, 나노 웹 등을 구비하는 임의의 나노 스케일의 객체를 의미할 수 있다. 다만, 광의로는 수 마이크로미터의 치수 또는 사이즈를 갖는 특징부를 포함하는 것으로도 이해될 수 있다.

"어레이(array)"는 지지, 부재(member) 또는 백킹 부재(backing member)로부터 도출되거나 이에 부착(고정)된, 섬유, 컬럼, 필라, 루프, 튜브, 콘, 블록, 큐브, 헤미스페어, 스페어, 벽, 그리드, 홀 또는 이의 조합을 포함하는 형태학적 특징부, 텍스츄어 또는 표면을 의미하는 것으로 폭넓게 해석될 수 있다.

"부착(adhesion)" 또는 "고정(immobilization)"은 단백질, 세포 또는 기타 물질이 표면에 공유 또는 비공유 방식으로 결합 또는 연결되는 것을 의미할 수 있다.

"바이오물질"은 광의로는 임의 타입의 생물학적 유기체(biological organism)로부터 유래하는 물질을 의미할 수 있으며, 구체적으로는 복수의 세포로 이루어질 수 있고 핵산일 필요는 없으며, 예를 들면 병원체(병원성 세포, 박테리아, 바이러스 등)일 수 있다.

"시료"는 검출하고자 하는 바이오물질을 함유할 수 있는 한, 특정 종류, 형태 또는 상(phase)로 한정되는 것은 아니다. 예시적으로, 시료는 생물학적 시료, 예를 들면 바이오물질을 함유하는, 액상, 고상 또는 기상의 생물학적 유체(fluid) 또는 생물학적 조직일 수 있다. 생물학적 유체의 예로서, 뇨, 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 정액, 대변, 가래, 뇌척수액, 눈물, 점액, 양수, 공기(또는 기상 유체) 등을 들 수 있다. 생물학적 조직은 세포의 집합으로서, 대체적으로 인간, 동물, 식물, 세균, 진균 또는 바이러스 구조물의 구조적 물질의 하나를 형성하는 세포 내 물질들과 특정 종류의 집합으로서 연결 조직, 상피 조직, 근육 조직 및 신경 조직 등이 이에 해당될 수 있다. 또한, 생물학적 조직의 예에는 장기, 종양, 림프절, 동맥 및 개별적인 세포(들)도 포함될 수 있다. 이외에도, 시료는 바이오물질을 저농도로 함유하는 환경 시료(environmental sample)를 포함할 수 있으며, 예를 들면 식수, 음식물 등과 같이 다양한 형태 및 종류를 포함할 수 있다.

"세포 용해 또는 용해(lysis)"는 세포 등의 분해에 따라서 세포막이 파열되는 동시에 세포 내용물이 노출되는 현상을 의미할 수 있는 바, 통상적으로 PCR과 같은 증폭 과정의 전단계에서 DNA 또는 RNA를 분리하기 위하여 많이 사용되고 있다.

“핵산”은 유기 염기(사이토신, 티미딘 또는 우라실과 같은 치환된 피리미딘이거나 아덴 또는 구아닌과 같은 치환된 퓨린)에 연결된 당으로 이루어지는 복수의 뉴클레오티드를 의미할 수도 있다. 즉, 리보핵산(RNA), 디옥시리보핵산(DNA), 메틸포스포네이트 핵산, S-올리고, c-DNA, cRNA, miRNA, siRNA, 압타머(aptamer) 등을 예시할 수 있고, 천연적으로 발생하거나 인공적으로 합성된 것 모두 포함하는 개념일 수 있다. 다만, 보다 전형적으로는 DNA, RNA 등일 수 있다.

"프로브"는 협의로는 표적 핵산 내에 함유된 특정 염기 서열과 상보적 염기 서열을 포함하고 있어, 적절한 조건 하에서 혼성화되는 성분 또는 바이오분자를 의미할 수 있으나, 광의로는 특정 성질 또는 량을 측정하기 위하여 표적 성분과 선택적이고 미리 정해진 방식으로 상호 작용하는 성분을 의미할 수 있다.

"용해 완충액(lysis buffer)"은, 예를 들면 25℃에서 약 6 내지 약 9의 pKa로, pH 값을, 예를 들면 6 내지 9(구체적으로 약 7.5 내지 9, 보다 구체적으로 약 7.8 내지 8.5)로 효과적으로 유지할 수 있는 조성물을 의미할 수 있다. 이때, 완충액은 전형적으로 효소 활성의 기능과 조화되고, 생물학적 분자의 정상적인 생리적 및 생화학적 기능을 유지할 수 있도록 생리학적으로 조화 가능한(physiologically compatible) 완충액을 의미할 수 있다.

"박테리아"는 외막(bacterial envelope)은 구조에 따라 그람(Gram) 염색반응이 구별되는 바, 그람 음성 박테리아(얇은 뮤레인(murein) 또는 펩티도글리칸 층을 가지며 외막의 지질 이중층을 가짐)와 그람 양성 박테리아(두꺼운 뮤레인 또는 펩티도글리칸 층을 가지며 이로써 Crystal violet을 보유함)로 구분된다. 그람 음성 박테리아의 세포막은 포스포리피드(phospholipid)와 기타 글리코프로테인(glycoprotein)으로 이루어져 있으며, 포스포리피드의 대부분은 (-)의 하전을 띄고 있다(net negative charge). 그 종류로는 살모넬라균, 수막염균, 스피로헤타 콜레라균, 페스트균, 티푸스균, 이질균, 대장균, 임균 등이 있다. 반면, 그람 양성 박테리아의 경우, 세포벽은 주로 펩티도글리칸(peptidoglycan) 및 타이코산(teichoic acid)으로 구성되는 바, 그 표면은 거의 중성에 가까운 하전 특성을 갖고 있으며, 포도상구균, 연쇄상구균, 탄저균, 디프테리아균, 파상풍균, 폐렴균 등을 들 수 있다.

"증폭(amplification)"은 주형 분자의 적어도 하나의 세그먼트의 복수개 복제물을 형성하기 위하여 반복적으로 일어나는 반응을 의미할 수 있다.

"PCR"은 사이클 프로세스(가열 및 냉각이 교대로 이루어짐)에 의하여 하나의 최초 주형으로부터 다량의 동일한 DNA 스트랜드가 형성되는 반응을 의미하는 바, 통상적으로 PCR 혼합물은 (i) 증폭하고자 하는 염기서열을 갖는 주형인 이중나선형 DNA 분자, (ii) 프라이머(주형 DNA 내 상보적 DNA 염기서열과 결합할 수 있는 단일 스트랜드 DNA 분자), (iii) dATP, dTTP, dGTP, 및 dCTP의 혼합물(PCR 증폭 과정에서 새로운 DNA 분자를 형성하도록 합쳐지는 뉴클레오티드 서브유닛)인 dNTP, 및 (iv) Taq DNA 폴리머라아제(dNTP)를 사용하여 새로운 DNA 분자를 합성하는 효소)를 포함할 수 있다.

"접촉한다"는 협의로는 2개의 대상 간의 직접적인 접촉을 의미하기는 하나, 광의로는 임의의 추가 구성 요소가 개재될 수 있는 것으로 이해될 수 있다.

"형광(fluorescence)"이라는 용어는 전자기적 여기에 의하여 짧은 시간 동안 생성되는 발광 타입을 의미할 수 있다. 즉, 형광은 특정 물질이 짧은 파장에서 광 에너지를 흡수한 후에 보다 긴 파장에서 광 에너지를 방출할 때 생성되는 현상을 의미한다. 예시적으로, 흡수와 방출 간의 시간 길이는 통상적으로 비교적 짧은데, 예를 들면 약 10^-9 내지 10^-8 초 수준일 수 있다.

"상에" 및 "위에"라는 표현은 상대적인 위치 개념을 언급하기 위하여 사용되는 것으로 이해될 수 있다. 따라서, 언급된 층에 다른 구성 요소 또는 층이 직접적으로 존재하는 경우뿐만 아니라, 그 사이에 다른 층(중간층) 또는 구성 요소가 개재되거나 존재할 수도 있다. 이와 유사하게, "하측에", "하부에" 및 "아래에"라는 표현 및 "사이에"라는 표현 역시 위치에 대한 상대적 개념으로 이해될 수 있을 것이다. 또한, "순차적으로"라는 표현 역시 상대적인 위치 개념으로 이해될 수 있다.

다공성 복합 나노구조체의 제작

본 개시 내용의 일 구체예에 따르면, 시료 내 바이오물질을 포집하기 위하여 다공성 복합 나노구조체가 사용된다. 상기 다공성 복합 나노구조체는, (i) 다공성 고분자 스펀지 구조물, 및 (ii) 상기 스펀지 구조물 상에 형성된 복수의 산화아연 재질의 나노와이어 어레이를 포함하며, 바이오물질을 효과적으로 포집할 수 있는 나노사이즈의 트랩 구조를 형성할 수 있다. 이와 관련하여, 바이오물질의 포집을 위한 나노와이어 어레이의 재질로서 산화아연을 선정하는 이유는 (001) 방향, 즉 y축으로의 성장을 용이하게 유도할 수 있을 뿐만 아니라, 이의 합성 반응이 간편하고 수상에서도 반응하여 친환경적이면서 독성이 적고 향균성을 나타내어 2차 감염을 억제할 수 있는 물질이기 때문이다.

본 구체예에 따르면, 상기 복수의 산화아연 재질의 나노와이어 어레이는 고분자 재질의 스펀지 구조물 상에 산화아연을 나노와이어 형상으로 성장시키는 방식으로 형성될 수 있다.

예시적 구체예에 따르면, 스펀지 구조물의 재질은, 예를 들면 폴리우레탄, 폴리비닐알코올, 폴리에틸렌, 폴리스티렌, 이의 조합 등일 수 있으며, 보다 구체적으로는 폴리우레탄일 수 있다. 상기 예시된 고분자는 범용 고분자로서 특히 폴리우레탄 재질의 스펀지 구조물은 당업계에서 용이하게 입수할 수 있다.

일 예로서, 다공성 고분자 스펀지 구조물의 포어 사이즈(직경)는, 예를 들면 약 100 내지 1000 ㎛, 구체적으로 약 150 내지 600 ㎛, 보다 구체적으로 약 200 내지 500 ㎛ 범위일 수 있다. 포어 사이즈가 지나치게 크거나 작은 경우에는 후술하는 바이오물질의 포획능을 감소시킬 수 있는 만큼, 이를 고려하여 적절한 포어 사이즈의 스펀지 구조물을 사용하는 것이 바람직할 수 있다.

일 구체예에 따르면, 산화아연 나노와이어는 당업계에서 알려진 방법, 예를 들면 VLS 공정(vapor-liquid-solid process), 전기도금법(electrodeposition), 졸-겔법(sol-gel), MOCVD(metal-organic chemical vapor deposition), 수열합성법(hydrothermal process) 등을 통하여 다공성 고분자 스펀지 구조물(기재) 상에 형성될 수 있는 바, 대표적으로는 수열합성법을 이용할 수 있다.

이와 관련하여, 수열 합성법을 통한 산화아연 나노와이어 어레이를 형성할 경우, 아연전구체-함유 수용액을 이용한 습식 성장 방식을 이용할 수 있다. 예시적 구체예에 따르면, 아연 전구체는 수용성 아연 화합물(또는 염)일 수 있으며, 구체적으로 질산아연, 황산아연, 아세트산아연, 포름산아연, 염화(II) 아연, 요오드화아연, 이의 수화물 등일 수 있는 바, 이들을 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 보다 구체적으로, 아연 전구체로서 질산아연 또는 이의 수화물을 사용할 수 있는 바, 이는 질산아연을 사용할 때 나노와이어 구조와 같은 1차원적 형상을 구현하기가 보다 용이하기 때문이다.

이와 관련하여, 수용액 내 아연 전구체의 농도는 산화아연 나노와이어의 밀도에 영향을 줄 수 있는 인자로서, 예를 들면 아연 이온의 농도가 증가함에 따라 스펀지 구조물 기재 상에 생성되는 핵 생성점이 증가하게 된다. 이러한 점을 고려할 때, 수용액 내 아연 전구체의 농도는, 예를 들면 약 1 내지 100 mM, 구체적으로 약 10 내지 60 mM, 보다 구체적으로 약 20 내지 40 mM, 특히 구체적으로 약 25 내지 30 mM 범위일 수 있는 바, 아연 전구체의 농도가 지나치게 낮거나 높은 경우에는 산화아연의 생성이 곤란한 만큼, 전술한 범위 내에서 조절하는 것이 유리할 수 있다. 다만, 상기 농도 범위는 예시적인 것으로 반응 조건, 원하는 나노와이어 어레이의 형상 및 치수 등을 고려하여 변경될 수 있다.

수열합성 반응을 위하여 아연전구체-함유 수용액은 아연전구체가 산화아연으로 전환됨과 동시에 기재 상에서 특정 면 방향으로(예를 들면, 1차원 방향으로) 성장할 수 있도록 하는 적어도 하나의 첨가 성분을 더 포함할 수 있다. 이러한 첨가 성분의 예는 헥사메틸렌테트라아민, 에틸렌디아민, 암모니아, 폴리에틸렌이민, 또는 이들의 조합일 수 있다. 특히, 상술한 첨가 성분은 수열합성 반응 중 산화아연 나노와이어의 형태학적 특징에 영향을 주는 바, 구체적으로 특정 결정 면의 성장을 촉진하거나 억제하는 역할을 한다. 즉, 아연전구체가 산화물로 전환되고 나노와이어와 같이 1차원적 구조로 성장하도록, 측 방향의 성장은 억제하는 역할을 한다.

이와 관련하여, 산화아연 나노와이어 어레이는 다공성 고분자 스펀지 구조물 기재의 표면에 대하여 비등방성으로, 구체적으로 수직(perpendicular) 또는 비수직(non-perpendicular) 방향으로 성장할 수 있으나, 후술하는 바와 같이 박테리아 등과 같은 바이오물질의 포집 효율성 측면에서는 기재 표면에 대하여, 예를 들면 약 60 내지 120°, 구체적으로 약 70 내지 110°, 보다 구체적으로 약 80 내지 100°, 특히 구체적으로는 실질적으로 수직 방향으로 성장(구체적으로 결정 성장)할 수 있다.

예시적으로, 아연전구체-함유 수용액 내 상기 첨가 성분의 전체 농도는 약 5 내지 60 mM, 구체적으로 약 10 내지 50 mM, 보다 구체적으로 약 15 내지 35 mM 범위 내에서 적절히 조절될 수 있다.

또한, 예시적 구체예에 따르면, 아연전구체-함유 수용액 내에서 아연 : 첨가 성분의 몰 비는, 예를 들면 약 0.5 내지 5 : 1, 구체적으로 약 1 내지 3.5 : 1, 보다 구체적으로 약 1.5 내지 2 : 1의 범위일 수 있다.

특정 구체예에 따르면, 상기 첨가 성분은 헥사메틸렌테트라아민과 폴리에틸렌이민의 조합을 함유할 수 있으며, 이때 헥사메틸렌테트라아민은 환원제의 기능을 하는 한편, 폴리에틸렌이민은 1차원 구조의 어레이 형성을 유도한다. 이때 헥사메틸렌테트라아민/폴리에틸렌이민의 몰 비는, 예를 들면 약 1 내지 10, 구체적으로 약 2 내지 7, 보다 구체적으로 약 3 내지 5의 범위일 수 있다.

예시적 반응 시스템에 있어서, 수용액 내에서 아연 전구체는 하기 반응식 1 내지 5에 따라 산화아연으로 전환되면서 다공성 스펀지 구조물 상에서 나노와이어와 같은 1차원적 형상으로 성장하게 된다.

한편, 산화아연의 합성 반응 시간 및 온도는 산화아연의 형태에 영향을 주는 바, 반응 온도는, 예를 들면 약 60 내지 200℃, 구체적으로 약 70 내지 120℃, 보다 구체적으로 약 80 내지 100℃, 특히 구체적으로 약 75 내지 95℃ 범위일 수 있고, 또한 반응(열처리) 시간은, 예를 들면 약 1 내지 48 시간, 구체적으로 약 5 내지 20 시간, 보다 구체적으로 약 7 내지 15 시간, 특히 구체적으로 약 9 내지 11 시간 범위일 수 있다.

이와 같이 다수의 핵 생성점으로부터 결정 성장하여 다수의 나노와이어 어레이를 형성하게 되는 바, 이때 나노와이어의 각각의 직경은, 예를 들면 약 0.1 내지 2 ㎛(약 100 내지 2000 nm), 구체적으로 약 0.2 내지 0.9 ㎛(약 200 내지 900 nm), 보다 구체적으로 약 0.5 내지 0.8 ㎛ (약 500 내지 800 nm)일 수 있다.

이때, 나노와이어의 직경은 전형적으로 반응 시간에 따라 변화할 수 있는 바, 예를 들면 반응(열처리) 시간에 따라 약 0.5 내지 10 ㎛/hr, 구체적으로 약 1 내지 2 ㎛/hr의 속도로 성장할 수 있으나, 이는 예시적인 의미로 이해될 수 있다.

또한, 나노와이어 각각의 길이는, 예를 들면 약 2 내지 100 ㎛, 구체적으로 약 10 내지 70 ㎛, 보다 구체적으로 약 20 내지 50 ㎛ 범위일 수 있다. 이외에도, 나노와이어의 종횡비(aspect ratio)는, 예를 들면 약 40 내지 200, 구체적으로 약 100 내지 155, 보다 구체적으로 약 80 내지 125 범위일 수 있다.

한편, 전술한 바와 같이 수열합성법에 의한 산화아연(구체적으로 결정성 산화아연) 나노와이어의 성장을 위하여는 반응에 앞서 기재인 다공성 고분자 스펀지 구조물의 표면에 시드층, 구체적으로 산화아연 시드층을 형성하는 단계가 수행될 수 있다. 이러한 시드층은 산화아연이 성장할 수 있는 핵점(nucleation spot)으로 작용할 수 있는 바, 예를 들면 결정화된 산화아연 시드 충일 수도 있고, 또는 단결정 산화아연층일 수도 있다. 예시적 구체예에 따르면, 시드층을 형성하기 위한 방법으로, 산화아연 시드 용액과 다공성 스펀지 구조물을 접촉시키는 방식, 물리적 방식(기상증착, 스퍼터링 등) 등으로 형성할 수 있다.

일 예로서, 산화아연 시드 용액을 이용하는 경우, 예를 들면 아세트산아연과 같은 전구체 용액(농도: 예를 들면 약 0.5 내지 10 mM, 구체적으로 약 1 내지 8 mM, 보다 구체적으로 약 2 내지 5 mM)을 기재 상에 예를 들면, 딥 코팅, 스핀 코팅 등에 의하여 코팅층을 형성하고, 산소-함유 분위기 하에서 열처리(예를 들면, 약 200 내지 500℃, 구체적으로 약 300 내지 400℃)하는 방식으로 수행 가능하며, 열 처리 전에 세척(구체적으로 알코올(에탄올) 세척 및/또는 건조가 수행될 수도 있다. 또한, 코팅 과정 또는 코팅 후에 견고한 시드층 형성을 위하여 선택적으로 초음파 처리가 수행될 수도 있다.

택일적 예로서, 산화아연 시드층은 물리적 방식, 특히 구체적으로 스퍼터링 방식으로 스펀지 구조물 상에 형성될 수 있다. 이때, 예시적인 스퍼터링 조건은 RF 출력(power)이, 예를 들면 약 100 내지 200 W(구체적으로 약 120 내지 180 W, 보다 구체적으로 약 140 내지 170W) 범위이고, 스퍼터링 시간은, 예를 들면 약 1 내지 60 분, 구체적으로 약 10 내지 40분, 보다 구체적으로 약 20 내지 30 분 범위일 수 있다.

전술한 시드층 형성 방식으로, 스퍼터링을 이용할 경우, 단일분산(monodisperse) 형태의 산화아연 나노와이어를 형성하는데 유리할 수 있다.

시료 내 바이오물질의 포집

도 1은 본 개시 내용의 일 구체예에 따라 제작된 다공성 복합 나노구조체를 이용하여 유해 바이오물질(박테리아 등)을 포집하는 일련의 적용예를 보여주는 모식도 및 주사전자현미경(SEM) 사진이다.

상기 도면을 참조하면, 먼저 다공성 고분자 스펀지 구조물 상에 산화아연(구체적으로 결정성 산화아연) 나노와이어 어레이가 배향되어 있는 복합 나노구조체는 바이오물질, 특히 박테리아와 같은 유해 바이오물질을 포집하기 위한 트랩(나노트랩) 수단을 제공한다.

본 명세서에서 적용 가능한 바이오물질은 전형적으로는 병원체 또는 병원성 세균을 포함할 수 있다. 병원체는 동식물의 생체에 침입하여 기생하면서 병을 일으키거나 위해를 주는 모든 미생물을 포함할 수 있다.

예시적 구체예에 따르면, 바이오물질은 그람-양성균 및 그람-음성균을 포함할 수 있는 바, 구체적으로 대장균 E. coli O157:H7, 살모넬라속균(Salmonella choleraesuis, Salmonella bongori, Salmonella typhimurium), 황색포도상구균, 리스테리아속균(Listeria monocytogenes, Listeria denitrificans, Listeria grayi, Listeria murrayi), 콜레라균, 적리균, 백일해균, 디프테리아균, 장티푸스균, 페스트균, 용혈성 연쇄구균 또는 스타필로코커스 아우레우스일 수 있으며, 보다 구체적으로는 E.coli O157:H7, Salmonella choleraesuis, Salmonella bongori, Salmonella typhimurium, Listeria monocytogenes, Listeria denitrificans, Listeria grayi, Listeria murrayi, S. enteritidis, Y. enterocolitica, S. aureus, B. cereus, L. monocytognes 등일 수 있다. 이외에도, 바이러스 종류로서 인플루엔자 바이러스, A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, E형 간염 바이러스, G형 간염 바이러스, HIV 바이러스, 황열 바이러스, 뎅기 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 진드기-매개 뇌염 바이러스, 누수투 또는 웨스트 나일 바이러스, 리프트 계곡 열 또는 토스카나 바이러스, 치쿤구니아 바이러스, 호흡기 합포체 바이러스, 로시오 바이러스, 홍역 바이러스, 머레이 뇌염 바이러스, 베셀스브론 바이러스, 지카(Zika) 바이러스, 림프구 무도수막염(lymphocytic choreomeningitis) 바이러스, 에볼라 바이러스, 마르부르그 바이러스, 크리미아-콩고 출혈 열 바이러스, 리사 바이러스, 주닌(Junin) 바이러스, 마추포(Machupo) 바이러스, 사비아(Sabia) 바이러스, 구아나리토(Guanarito) 바이러스, 유행성 이하선염 바이러스, 광견병 바이러스, 루벨라(rubella) 바이러스, 수두 대상 포진 바이러스, 단순 포진 1형 및 2형 바이러스, 보다 전형적으로 알파바이러스, 아데노바이러스, 에코바이러스, 로타바이러스, 플라비바이러스, 리노바이러스, 오쏘부냐바이러스(orthobunyavirus), 폴리오바이러스, 인간 파보바이러스, 엔테로바이러스, 코로나바이러스, 인간 파필로마바이러스, 인간 시토메갈로바이러스, 엡스테인-바르 바이러스, 1, 2 및 3형의 파라인플루엔재 바이러스, 또는 임의의 확인된 바이러스를 포함할 수 있다. 상기 나열된 종류는 예시적인 것으로 이해되어야 하며, 반드시 특정 종류로 한정되는 것은 아니다.

이러한 바이오물질은 다양한 방식, 즉 각종 기상, 액상 및/또는 고상 매질 또는 매개체(medium)를 통하여 전파될 수 있으며, 경우에 따라서는 인체 접촉(예를 들면, 손 접촉)을 통하여 전파될 수 있다.

그 다음, 바이오물질을 함유하는 시료를 복합 나노구조체 기반의 필름에 접촉시키는 바, 이때 복합 나노구조체는 산화아연 나노와이어 어레이에 의한 물리화학적 또는 비특이적 고정(또는 포집) 원리를 이용하도록 구성된다.

일반적으로, 박테리아와 같은 바이오물질과 고체 표면 간의 상호 작용에는 전하에 의한 상호작용(정전기적 결합), 수소 결합 및 소수성 결합(hydrophobic interaction)이 관여된다. 한편, 바이오물질 간의 상호 작용에 있어서도 이러한 3가지 힘이 작용한다.

고체 표면의 친수성이 높은 경우에는 소수성 상호작용이 우세하게 되어 바이오물질(구체적으로 그람-음성 및 그람-양성 박테리아)이 모두 비교적 용이하게 친수성 고체 표면에 흡착 고정될 수 있다. 특히, 고농도 시료에서는 바이오물질의 표면 전하에 관계없이 소수성 결합에 의하여 서로 용이하게 응집될 수 있다. 반면, 저농도 시료에 있어서는 바이오물질 간의 거리가 크기 때문에 수소 결합 및 소수성 상호작용이 감소하게 된다. 따라서, 저농도 시료에서는 고체 표면과 바이오물질 간의 상호 작용뿐만 아니라, 바이오물질들 간의 상호 작용과 관계되는 힘을 증가시킬 필요가 있다. 상기의 점에서 복합 나노구조체는 효과적인 포집(또는 고정) 효과를 제공할 수 있다.

구체적으로, 본 구체예에서는 화학적 방식 또는 항원-항체의 생화학적 방식을 이용하는 대신에, 다수의 산화아연 나노와이어와 병원체 등의 유해 바이오물질 표면의 섬모 구조와의 상호 작용을 이용하여 물리적으로 바이오물질을 고정하는 원리를 이용한다. 더 나아가, 복합 나노구조체의 제작 과정 중 나노와이어의 길이, 직경 및 이들 간의 간격을 조절할 수 있기 때문에, 박테리아뿐만 아니라, 보다 작은 사이즈의 바이러스까지도 포집 및 검출할 수 있다.

예시적 구체예에 따르면, 병원체와 같은 바이오물질은 다양한 방식으로 또는 다양한 매개체를 통하여, 예를 들면 인체(예를 들면, 피부) 접촉, 액상(예를 들면, 기침 중 타액) 및/또는 기상(예를 들면, 공기)를 통하여 복합 나노구조체와 접촉하여 고정될 수 있다. 특히, 피부 전염으로 전파는 병원체의 경우, 손 접촉만으로도 용이하게 고정시킬 수 있다.

포집된 바이오물질의 진단

이와 같이 복합 나노구조체 상에 고정된 바이오물질(구체적으로 박테리아)의 핵산 추출을 위하여 용해(lysis) 단계가 수행될 수 있다. 이와 관련하여, 당업계에서 알려진 다양한 용해법을 적용할 수 있는 바, 조절된 온도 조건 하에서 포집된 바이오물질을 약 70 내지 95 ℃(구체적으로 약 80 내지 90 ℃)에서 가열하는 방법. 초음파 분쇄기(sonicator)를 이용하여 펄스 온(pulse on) 및 펄스 오프(pulse off)를 교대로 실시하는 방법, 용해 완충액(lysis buffer)을 사용하는 방법 등이 적용 가능하다.

특정 구체예에 따르면, 용해 완충액을 이용한 핵산 추출 방식을 이용할 수 있다. 이러한 용해 완충액에 첨가 가능한 버퍼(buffer) 성분의 예로서, HEPES((4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산), MOPS(3-(N-모르폴리노)-프로판설폰산), N-트리스(히드록시메틸)메틸글리신 산(Tricine), 트리스(히드록시메틸)메틸아민 산(Tris), 피페라진-N,N'-비스(2-에탄술폰산)(PIPES) 및 아세테이트 또는 포스페이트 함유 버퍼(K₂HPO₄, KH₂PO₄, Na₂HPO₄, 및/또는 NaH₂PO₄), 또는 이의 조합 등을 들 수 있으나, 본 발명이 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 용해 완충액 내 버퍼 성분의 농도는, 예를 들면 약 3 내지 30 mM, 구체적으로 약 5 내지 20 mM, 보다 구체적으로 약 6 내지 10 mM 범위일 수 있으나, 이는 예시적인 것으로 반드시 상기 수치 범위에 한정되는 것은 아니다. 선택적으로, 용해 완충액은 프로테나아제 K, 트립신, 키모트립신, 엘라스타아제, 스트렙토그리신 등과 같이 당업계에서 핵산 추출을 위하여 사용되는 프로테아제를 더 함유할 수도 있다. 예시적 구체예에 따르면, 핵산 추출을 위하여, 시판 중인 G-spin^™ 핵산 추출 키트, easy-spin^™ 핵산 추출 키트, Pathogen-spin^™ 핵산 추출 키트 등을 사용할 수 있다.

일 구체예에 있어서, 포집된 바이오물질의 용해 온도는 사용되는 효소의 종류 등을 고려하여 적절한 범위로 조절할 수 있는데, 예를 들면 약 30 내지 95 ℃(전형적으로 약 40 내지 80 ℃, 보다 전형적으로 약 55 내지 72 ℃) 범위 내에서 정하여질 수 있다. 상기 온도 범위는 예시 목적으로 기술되는 바, 본 개시 내용이 이에 한정되는 것은 아니다.

이와 같이, 포집된 바이오물질의 용해 과정 이후에는 당업계에서 알려진 방법에 따라 추출된 핵산에 대한 증폭 반응을 수행한다. 증폭 반응을 위하여, PCR(DNA 증폭 방식), NASBA(Nucleic Acid Sequence Based Amplification; RNA를 이용한 등온 조건 하에서의 증폭 방식) 등과 같이 당업계에서 공지된 임의의 증폭 기술을 활용할 수 있다.

예를 들면, PCR 방식은 국내특허번호 제593687호 등에 기재되어 있고, NASBA 방식은 EP 0 329 822 B1, 미국특허번호 제6,110,681호 등에 예시되어 있는 바, 전술한 선행문헌들은 본 발명의 참고자료로 포함된다. 예시적인 PCR 방식으로서, 어셈블리-PCR, 비대칭(asymmetric) PCR, 디지털(digital) PCR, 종점(endpoint) PCR, 인버스(inverse) PCR, 메틸화-특이성 PCR, 정성(qualitiative) PCR, 정량화(quantitative) PCR, 실시간(real-time) PCR, RT(reverse transcription)-PCR 등을 예시할 수 있다.

상술한 바와 같이 증폭된 생성물은 당업계에서 알려진 방법에 의하여 검출(detection)될 수 있는 바, 예를 들면 겔 전기영동(gel electrophoresis), ELGA(enzyme-linked gel assay), ECL(electrochmiluminescent) 등을 이용할 수 있다. 다만, 상기 방식은 증폭 반응의 결과를 확인하기 위하여 각 샘플에 대하여 검출 단계를 별도로 수행해야 하는 불편한 점이 있기 때문에 택일적으로 형광을 이용한 검출 방법을 이용할 수도 있다.

예시적 구체예에 따르면, 증폭된 생성물은 라벨화된 프로브, 구체적으로는 형광 라벨화된 프로브를 이용하여 검출될 수 있다. 이러한 형광 라벨화된 프로브의 대표적인 예로서, 엄벨리페론(umbelliferone), 플루오레신(fluorescein), 플루오레신이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate; FITC), 로다민(rhodamine), 탐라(TAMRA), 디클로로트리아지닐아민플루오레신(dichlorotriazinylamine fluorescein), 단실클로라이드(dansyl chloride), 양자점(quantum dots), 피코에리스린(phycoerythrin), FAM(fluorecein amidite) 등을 포함하는 플루오세인계(fluorescein), 알 렉사플로어계 (alexa fluor) 및 Cy3, Cy5, Cy7, 인도시아닌그린을 포함하는 시아닌계(cyanine) 등의 형광 물질 등을 들 수 있으며, 이중 1종 또는 2종 이상을 사용할 수 있다. 다만, 본 발명이 상기 예시된 형광 물질로 한정되는 것은 아니다. 이와 관련하여, 형광 물질은 특정 파장의 광에 의하여 여기된 후, 또 다른 파장의 광을 방출하여 잉여 에너지를 배출하는 바, FITC와 같은 형광 물질은 550 nm 파장의 광을 방출한다

또 다른 구체예에서는 분자 비콘 프로브 또는 TaqMan 프로브의 형광을 이용한 검출 방법을 이용할 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 바이오 칩을 사용할 경우에는 분자 비콘 또는 TaqMan 프로브를 이용한 형광 검출 방식이 특히 유리한 바, 이는 단일 바이오 칩 내에서 샘플의 농축, 증폭 및 검출을 모두 수행할 수 있기 때문이다.

분자 비콘 프로브는 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단을 형광체(fluorescent dye)로, 3' 말단을 소광제(quencher)로 결합시킨 것이다. 올리고뉴클레오타이드 스트랜드는 타겟서열에 상보적인 루프형 프로브 부분과 그 양쪽 끝에 5 내지 6개의 뉴클레오타이드의 자기상보(Self-complementary) 영역으로 구성되는데, 타겟이 없을 경우에는 프로브의 상보부분이 인접된 머리핀 형태로 형광체와 소광제가 인접하여 강한 소광 효과를 나타낸다. 반면, 타겟과 반응하면 루프형의 배열이 펴지며 직선으로 되어 형광체와 소광제의 거리가 멀어지게 되어 형광이 관찰된다.

TaqMan 프로브의 경우, 5' 말단을 형광체(FAM 등)로, 3' 말단을 소광제(TAMRA 등)로 수식한 올리고뉴클레오타이드를 증폭 용액에 첨가하는 방법으로서, TaqMan 프로브는 어닐링 단계에서는 주형 핵산에 특이적으로 혼성화되지만 프로브 상의 소광제에 의하여 형광 발색이 억제된다. 연장 반응 시에 Taq DNA 중합효소가 갖는 5'→3' 핵산말단분해효소(exonuclease)의 활성으로 주형에 혼성화된 TaqMan 프로브가 분해됨에 따라 형광 색소가 프로브로부터 유리되면서 소광제에 의한 억제가 해제되어 형광을 나타낸다. 다만, 검출 특이성 면에서 분자 비콘을 사용하는 것이 보다 바람직할 수 있다.

전술한 프로브는 증폭 용액에 첨가하여 사용하는데, 이와 같이 증폭에 앞서 첨가할 경우에는 프라이머가 핵산과 결합함에 있어서 프로브와 경쟁적 관계를 형성할 수 있다. 즉, 프로브와 타겟 핵산의 혼성화에 의하여 비특이적(non-specific) 결합이 증가할 수 있다. 따라서, 과량을 사용할 경우에는 증폭 반응의 저해제로 작용할 수 있다. 반면, 프로브의 량이 일정 수준 미만인 경우에는 증폭된 핵산에 비하여 불충분한 형광 특성으로 인하여 원하는 검출 효과를 기대하기 어렵게 된다. 결국, 증폭 방식을 고려하여 프로브의 사용량, 기타 반응 조건을 실험적으로 적절히 조절하는 것이 바람직하다. 이러한 문제 가능성을 해소하기 위하여, 예를 들면 증폭 반응 시간을 증가시킴으로써 프로브 첨가가 증폭 반응에 미치는 영향을 억제하면서 프로브의 최대 한계 사용량을 증가시킬 수 있다.

다른 예시적 구체예에 따르면, 증폭 단계에 앞서 또는 증폭 과정 중 삽입 염료가 증폭 혼합물에 첨가될 수 있다. 이때, 핵산으로서 DNA를 증폭할 경우, 삽입 염료는 이중 스트랜드 DNA(dsDNA) 사이에 삽입되어, 추후 형광 검출에 따른 강도(intensity)를 측정함으로써 증폭 정도를 확인할 수 있다. 이와 관련하여, 삽입 염료는 증폭 과정에서 이중 스트랜드 내로 삽입 가능한 염료로서, SYBR Green, PicoGreen, Hoechst 시리즈(series), BOBO, TOTO, YOYO, JOJO, POPO, LOLO, PO-PRO, BO-PRO, YO-PRO, TO-PRO, JO-PRO, LO-PRO, SYTO 시리즈 등을 포함할 수 있으며, 이들을 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 전형적으로는, SYBR Green, TOTO 시리즈 중 TOTO-3, POPO 시리즈 중 POPO-3, BOBO 시리즈 중 BOBO-3 등을 사용할 수 있다. 본 발명이 상술한 종류로 반드시 한정되는 것은 아니며, 증폭 반응 중 이중 스트랜드에 삽입되어 이로부터 유래하는 형광 특성을 검출할 수 있는 한, 다양한 종류를 사용할 수도 있다. 또한, 첨가되는 삽입 염료의 량은, 삽입 염료의 특성 등을 고려하여 적절히 조절할 수 있는 바, 예를 들면 약 0.1 내지 20 μM 중량%(구체적으로, 약 1 내지 5 μM) 범위일 수 있다. 다만, 본 개시 내용이 상기 수치 범위로 한정되는 것은 아니다.

상술한 바와 같이, 증폭 생성물로부터 유래된 형광은, 예를 들면 공초점 현미경(confocal microscope), 형광 현미경(fluorescence microscope), 형광계(fluorometer), 형광 스캐너(fluorescence scanner), 플로우사이토메터(flow cytometer) 등과 같이 당업계에 알려진 검출 수단(또는 장치)를 통하여 확인할 수 있는데, 형광의 유무 및 강도를 고려하여 타겟 핵산의 존재 여부 및 농도를 분석할 수 있다. 예시적 구체예에 따르면, 형광 검출을 위하여, 예를 들면 레이저-유도 공초점 형광 현미경을 이용할 수 있다. 이외에도, 핵산(표적 핵산)의 존재에 따른 형광 유무 및 형광 세기의 변화를 확인할 수 있는 장비라면 특별한 제한 없이 사용 가능한 바, 예를 들면 QuantaMaster PTI spectrofluorimeter (PTI), SPEX Fluorolog 3 (ISA) 등을 예시할 수 있다.

예시적 구체예에 따른 진단 시스템의 검출 한계(LOD)는, 예를 들면 약 10 내지 10² CFU/ml 범위일 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해 바람직한 실시예를 제시하지만, 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예

본 실시예에서 사용된 물질 및 장치는 하기와 같다:

- 폴리우레탄 스펀지: 상대적인 포어 사이즈에 따라 시판 중인 3종(대구경 포어, 중간구경 포어 및 소구경 포어 사이즈)의 폴리우레탄 스펀지를 입수하여 사용하였다.

- 질산아연((Zn(NO₃)₂·H₂O): Sigma-Aldrich(99%)

- 헥사메틸렌테트라아민(HMTA, (CH₂)₆N₄): Sigma-Aldrich(99.5%)

- 폴리에틸렌이민(PEI): (C₂H₅N)n), M_w 800, Sigma-Aldrich

- 스퍼터링 장치: Ultech사에서 주문 제작하여 사용하였음

- 주사전자현미경: Nova230(FEI company)

또한, 실시예에서 사용된 시료는 하기와 같이 제조되었다.

- 박테리아 함유 시료

E.coli O157:H7 ((ATCC 43895): American Type Culture Collection (Washington DC, USA))를 선택하였으며, 병원체를 튜브에 넣고 15mL의 Luria-Bertani (LB) 배지와 함께 250 rpm으로 37℃에서 교반하면서 24 시간 동안 배양하였다. 이때, UV 흡광도 측정법(600 nm)에 의한 광학 밀도(optical density; OD) 값이 1이 되었을때 배양을 종료하여 배양물을 회수하였다.

실시예 1

다공성 복합 나노구조체의 제작

도 2a에 나타낸 대구경 포어 사이즈(약 800 내지 1000 ㎛ 범위)를 갖는 폴리우레탄 스펀지 1 cm x 1 cm 를 절단하여 기저 구조물로 하였고, 이를 20분 동안 스퍼터링(150 W)하여 표면 상에 수 나노미터 두께 수준의 산화아연 시드층을 형성하였다.

이와 별도로, 25 mM의 질산아연, 25 mM의 헥사메틸렌테트라아민 및 6 mM의 폴리에틸렌이민을 함유하는 아연 전구체 수용액을 제조하였다. 그 다음, 시드층이 코팅된 다공성 폴리우레탄 스펀지 구조물을 아연 전구체 수용액에 넣어 침적시켰고 교반 없이 95℃에서 10 시간 동안 유지하는 방식으로 열 처리(어닐링)하였다. 열 처리 과정에서 용액은 투명색에서 점차 불투명해졌다.

이후, 열처리된 다공성 스펀지 구조물을 꺼내고, 탈이온수 및 에탄올을 이용하여 반복하여 세척하였고, 공기 분위기 및 상온 조건에서 건조시켰다. 상기와 같이 제조된 복합 나노구조체의 SEM 사진을 도 2b에 나타내었다.

상기 도면을 참조하면, 다공성의 스펀지 구조물 상에 다수의 가시 형상(spiky)의 나노와이어 구조가 형성됨을 알 수 있다. 상기 나노와이어의 직경은 대략 1 ㎛ 수준이었고, 이의 길이는 대략 50 ㎛이었다(종횡비: 100).

박테리아에 대한 포집 테스트

상기와 같이 제작된 복합 나노구조체에 대하여 5 cm 거리에서 앞서 제조된 시료를 각각 3초에 걸쳐 앞뒤로 분사하였고(총 6초), 이후 1 시간 동안 상온에서 건조시킨 후에 시료 내 박테리아(E.coli)의 포집 여부에 대하여 SEM 분석을 수행하였으며(박테리아 농도: 10⁹ cell/mL), 그 결과를 도 2c에 나타내었다.

상기 도면에 따르면, 시료 내 박테리아 다수가 복합 나노구조체 표면, 즉 침상의 산화아연 상에 균일하게 부착되어 있음을 확인할 수 있다.

실시예 2

도 3a에 나타낸 중간구경 포어 사이즈(약 500 ㎛ 범위)를 갖는 폴리우레탄 스펀지를 절단하여 기저 구조물로 사용한 것을 제외하고는 실시예 1에서와 동일한 방식으로 산화아연 재질의 나노와이어 어레이를 형성한 복합 나노구조체를 제작하였고, 이를 이용하여 시료 내 박테리아의 포집 여부에 대하여 SEM 분석을 수행하였으며, 그 결과를 도 3b에 나타내었다.

상기 도면으로부터 확인되는 바와 같이, 스펀지 구조물 상에 형성된 산화아연의 나노와이어 어레이에 의하여 다수의 박테리아가 포집되어 있음을 알 수 있다.

실시예 3

도 4a에 나타낸 소구경 포어 사이즈(약 200 내지 300 ㎛ 범위)를 갖는 폴리우레탄 스펀지를 절단하여 기저 구조물로 사용한 것을 제외하고는 실시예 1에서와 동일한 방식으로 산화아연 재질의 나노와이어 어레이를 형성한 복합 나노구조체를 제작하였고, 이를 이용하여 시료 내 박테리아의 포집 여부에 대하여 SEM 분석을 수행하였으며, 그 결과를 도 4b에 나타내었다.

상기 도면으로부터 확인되는 바와 같이, 침상의 산화아연 상에 박테리아들이 부분적으로 부착되어 있음을 확인할 수 있다.

실시예 4

바이오물질(박테리아)에 대한 검출 테스트

실시예 1 내지 3에 따라 제작된 복합 나노구조체 각각에 대하여 분사 및 담금을 통하여 포집된 박테리아에 대하여 G-spin^™ 핵산 추출 키트를 이용하여 세포용해를 수행하여 핵산을 추출하였다. 이들 각각에 대하여 i-StarMAX^™을 이용한 PCR에 의하여 증폭 반응시켰고, 증폭 생성물에 대한 전기영동 분석을 수행하였다. 이때, 전기영동 분석을 위한 아가로오스 겔(2%)을 제조하기 위하여, 1X TAE 버퍼 100 mL 및 Agarose LE(intron, Cat No. 32034) 2 g을 혼합한 후에 전자레인지 내에서 녹였고, 이에 형광 염료(red safe)를 첨가하여 혼합한 다음, 겔 플레이트에 부어 응고시켰다.

전기영동 겔 실험은 PCR에 의한 증폭 생성물 샘플 6 ul 및 6X 로딩 버퍼 1 ul를 혼합한 후, 앞서 제조된 2% 아가로오스 겔에 5 ul를 로딩시켰으며, 전기 영동 장치에서 20분 동안 겔을 내려준 후에 UV로 측정하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.

상기 도면에 있어서, (i) 번호 1 및 7은 소구경 포어 사이즈를 갖는 스펀지 구조물을 기반으로 하면서 가습기에 대하여 분사한 경우, (ii) 번호 2 및 8은 소구경 포어 사이즈를 갖는 스펀지 구조물을 기반으로 하면서 담금 방식을 적용한 경우, (iii) 번호 3 및 9는 중간구경 포어 사이즈를 갖는 스펀지 구조물을 기반으로 하면서 가습기에 대하여 분사한 경우, (iv) 번호 4 및 10은 중간구경 포어 사이즈를 갖는 스펀지 구조물을 기반으로 하면서 담금 방식을 적용한 경우, (v) 번호 5 및 11은 대구경 포어 사이즈를 갖는 스펀지 구조물을 기반으로 하면서 가습기에 대하여 분사한 경우, 그리고 (vi) 번호 6 및 12는 대구경 포어 사이즈를 갖는 스펀지 구조물을 기반으로 하면서 담금 방식을 적용한 경우를 의미한다.

상기 도면으로부터 확인되는 바와 같이, 소구경 포어 사이즈를 갖는 스펀지 구조물을 기반하는 경우에는 검출 효과가 낮았으나, 이를 제외한 대다수의 경우에서는 효과적으로 박테리아를 검출할 수 있었다.

실시예 5

시료 내 바이오물질(박테리아)의 농도에 따른 검출 테스트

실시예 2에서와 같이 중간구경 포어 사이즈를 갖는 스펀지 구조물을 기반으로 하면서 가습기에 대하여 분사한 경우에 있어서, 시료 내 박테리아(E. coli O157:H7)의 농도에 따른 포집, 그리고 PCR 및 검출 테스트를 수행하였다. 시료 내 박테리아 농도는 10⁸ cell/mL에서 10⁰ cell/mL까지 변화시켰으며, 음성 대조군으로 탈이온수를 사용하였다. 검출 테스트 결과를 도 6에 나타내었다.

상기 도면에 따르면, 본 실시예에 따른 검출 플랫폼을 적용할 경우, 낮은 농도의 박테리아 함유 시료(10² TCID 50/mL)에 대하여도 유효하게 박테리아를 포집할 수 있었다.

실시예 6

시료 내 바이오물질(바이러스: H1N1 인플루엔자)에 대한 포집 및 검출 테스트

불활성화된 인플루엔자 바이러스(10⁷ 내지 10² TCID 50/mL)를 함유하는 시료 100 mL를 가습기에 넣고 바이러스-함유 시료를 스프레이건으로 분사시킨 후, 30초 동안 실시예 1에 따라 제작된 복합 나노구조체(매크로포어 사이즈를 갖는 스펀지 구조물을 기반으로 하는 복합 나노구조체)를 상온에 방치하여 건조시켰고, 이에 세포 용해(lysis) 버퍼 500 ul를 첨가하고 볼텍싱한 후에 10분 동안 방치하였다. 이때, 볼텍싱은 3분 간격으로 수행되었다. 이후, 샘플 5 ul를 주형으로 하여 하기 표 1에 기재된 실시간(real-time) RT(reverse transcription)-PCR 조성물을 이용하여 qRT-PCR을 실시하였다. 또한, 대조군으로 탈이온수를 사용하였다.

조성	Add vol. (㎕)
Superscript Ⅲ RT /Platinum Taq mix	1
2X 반응 버퍼(reaction buffer)	25
Forward primer (4 μM)	2.5
Reverse primer (4 μM)	2.5
프로브 (2 μM)	2.5
추출된 바이러스 용해물(Extracted viral lysate)	5
탈이온수	11.5

qRT-PCR 결과에 따라 시료 내 바이러스 농도 별 Cq(quantification cycle) 값을 도 7에 나타내었다. 상기 도면에 따르면, 10² CFU/ml 저농도에서도 박테리아를 검출할 수 있었다.

본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 이용될 수 있으며, 이러한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.

Claims

삭제
a) 박테리아 및 바이러스로 이루어진 군으로부터 적어도 하나가 선택되는 병원체를 함유하는 시료를 상기 병원체에 대한 고정능을 갖는 다공성 복합 나노구조체와 접촉시켜 상기 병원체를 다공성 복합 나노구조체 상에 포집하는 단계;
b) 상기 포집된 병원체를 용해(lysis)시켜 핵산을 추출하는 단계; 및
c) 상기 추출된 핵산을 증폭하여 검출하는 단계;
를 포함하는 병원체의 검출 방법으로서,
여기서, 상기 다공성 복합 나노구조체는,
100 내지 1000 ㎛ 범위의 포어 사이즈(직경)를 갖는 다공성 고분자 스펀지 구조물; 및
상기 스펀지 구조물 상에 형성된 복수의 산화아연 재질의 나노와이어 어레이;
를 포함하고,
상기 산화아연 재질의 나노와이어는,
(i) 상기 고분자 스펀지 구조물의 표면에 산화아연 시드층을 형성하는 단계;
(ii) 아연 전구체-함유 수용액을 제공하는 단계; 및
(iii) 상기 아연 전구체-함유 수용액 내에서 상기 시드층이 형성된 고분자 스펀지 구조물 상에 수열합성법에 의하여 산화아연을 1차원 형상의 나노와이어 형상으로 배향 성장시키는 단계;
를 포함하는 방법에 의하여 제조되고, 상기 산화아연 재질의 나노와이어 각각의 직경은 0.1 내지 2 ㎛이고, 이의 길이는 2 내지 100 ㎛ 범위인 방법.
제2항에 있어서, 상기 고분자는 폴리우레탄, 폴리비닐알코올, 폴리에틸렌, 폴리스티렌 또는 이의 조합인 것을 특징으로 하는 방법.
삭제
제2항에 있어서, 상기 산화아연 시드층은 스퍼터링에 의하여 형성되는 것을 특징으로 하는 방법.
제5항에 있어서, 상기 스퍼터링은 100 내지 200 W의 RF 출력으로 1 내지 60 분 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 아연 전구체-함유 수용액은, 헥사메틸렌테트라아민, 에틸렌디아민, 암모니아, 폴리에틸렌이민, 및 이의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 첨가 성분을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 단계 (iii)은 60 내지 200 ℃에서 열처리(annealing) 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
삭제
삭제
제2항에 있어서, 상기 아연 전구체는 질산아연, 황산아연, 아세트산아연, 포름산아연, 염화(II) 아연, 요오드화아연 및 이의 수화물로 이루어진 군으로부터 적어도 하나가 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 아연 전구체-함유 수용액 내 아연 전구체의 농도는 1 내지 100 mM 범위인 것을 특징으로 하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 나노와이어 형상의 산화아연은 상기 시드층이 형성된 스펀지 구조물의 표면에 대하여 60 내지 120° 방향으로 성장하는 것을 특징으로 하는 방법.
제6항에 있어서, 상기 아연전구체-함유 수용액 내 상기 첨가 성분의 전체 농도는 5 내지 60 mM 범위이고, 또한 아연 : 첨가 성분의 몰 비는 0.5 내지 5 : 1의 범위인 것을 특징으로 하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 산화아연 재질의 나노와이어의 종횡비는 40 내지 200 범위인 것을 특징으로 하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 병원체는 대장균 E. coli O157:H7, 살모넬라속균(Salmonella choleraesuis, Salmonella bongori, Salmonella typhimurium), 황색포도상구균, 리스테리아속균(Listeria monocytogenes, Listeria denitrificans, Listeria grayi, Listeria murrayi), 콜레라균, 적리균, 백일해균, 디프테리아균, 장티푸스균, 페스트균, 용혈성 연쇄구균 및 스타필로코커스 아우레우스로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 병원체는 인플루엔자 바이러스, A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, E형 간염 바이러스, G형 간염 바이러스, HIV 바이러스, 황열 바이러스, 뎅기 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 진드기-매개 뇌염 바이러스, 누수투 또는 웨스트 나일 바이러스, 리프트 계곡 열 또는 토스카나 바이러스, 치쿤구니아 바이러스, 호흡기 합포체 바이러스, 로시오 바이러스, 홍역 바이러스, 머레이 뇌염 바이러스, 베셀스브론 바이러스, 지카(Zika) 바이러스, 림프구 무도수막염(lymphocytic choreomeningitis) 바이러스, 에볼라 바이러스, 마르부르그 바이러스, 크리미아-콩고 출혈 열 바이러스, 리사 바이러스, 주닌(Junin) 바이러스, 마추포(Machupo) 바이러스, 사비아(Sabia) 바이러스, 구아나리토(Guanarito) 바이러스, 유행성 이하선염 바이러스, 광견병 바이러스, 루벨라(rubella) 바이러스, 수두 대상 포진 바이러스 및 단순 포진 1형 및 2형 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제2항에 있어서, 증폭은 어셈블리-PCR, 비대칭(asymmetric) PCR, 디지털(digital) PCR, 종점(endpoint) PCR, 인버스(inverse) PCR, 메틸화-특이성 PCR, 정성(qualitiative) PCR, 정량화(quantitative) PCR, 실시간(real-time) PCR, 또는 RT(reverse transcription)-PCR에 의하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 검출은 겔 전기영동(gel electrophoresis), ELGA(enzyme-linked gel assay) 또는 ECL(electrochmiluminescent)에 의하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 검출은 형광 라벨화된 프로브를 이용하거나, 또는 분자 비콘 프로브 또는 TaqMan 프로브를 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
시료 내 박테리아 및 바이러스로 이루어진 군으로부터 적어도 하나가 선택되는 병원체의 검출 시스템으로서,
100 내지 1000 ㎛ 범위의 포어 사이즈(직경)를 갖는 다공성 고분자 스펀지 구조물, 및 상기 고분자 스펀지 구조물 상에 형성된 복수의 산화아연 재질의 나노와이어 어레이를 포함하는 다공성 복합 나노구조체, 상기 다공성 복합 나노구조체는 시료와 접촉하여 상기 나노와이어 어레이에 의하여 시료 내 병원체를 포집하도록 구성됨;
상기 다공성 복합 나노구조체에 포집된 병원체로부터 유래하는 핵산에 대한 증폭 수단; 및
상기 증폭된 핵산의 검출 수단;
을 포함하고,
상기 산화아연 재질의 나노와이어는,
(i) 상기 고분자 스펀지 구조물의 표면에 산화아연 시드층을 형성하는 단계;
(ii) 아연 전구체-함유 수용액을 제공하는 단계; 및
(iii) 상기 아연 전구체-함유 수용액 내에서 상기 시드층이 형성된 고분자 스펀지 구조물 상에 수열합성법에 의하여 산화아연을 1차원 형상의 나노와이어 형상으로 배향 성장시키는 단계;
를 포함하는 방법에 의하여 제조되고, 상기 산화아연 재질의 나노와이어 각각의 직경은 0.1 내지 2 ㎛이고, 이의 길이는 2 내지 100 ㎛ 범위인 시스템.
제21항에 있어서, 상기 시스템의 검출 한계(LOD)는 10 내지 10² CFU/ml 범위인 것을 특징으로 하는 검출 시스템.