JP2013516179A - 微小粒子を用いた生きた生物負荷の検出法 - Google Patents

微小粒子を用いた生きた生物負荷の検出法 Download PDF

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Abstract

本発明は、細胞を微小粒子上に濃縮し、この微小粒子を濃縮し、更に細胞を検出するための方法を提供する。本発明はまた、上記方法に基づいて使用するための一体型の試料調製及び検出装置も含む。
【選択図】図２Ｃ

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２００９年１２月３０日に出願された米国仮特許出願第６１／２９１，３０１号、及び２０１０年５月６日に出願された同第６１／３３１，９３１号の利益を主張するものであり、これらの仮特許出願は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
試料（例えば表面、水、空気等）中の細胞又は複数の細胞と関連する生物学的検体の存在を評価するために用いることができる種々の試験が利用可能である。こうした試験としては、ホタルルシフェラーゼ反応を利用したＡＴＰの検出に基づく試験、比色計を用いたタンパク質の検出に基づく試験、微生物培養法を用いた微生物の検出に基づく試験、及び免疫化学的方法を用いた微生物の検出に基づく試験がある。スワブ装置を用いたり、あるいは寒天プレートなどの培養装置との直接的な接触によって表面の試料を採取することができる。この試料を、生きた細胞の存在、特に生きた微生物の存在について分析することができる。
これらの試験の結果はしばしば、表面の清浄度について判定を行うために用いられる。例えば、こうした試験は、食品加工機器が生産に使用するうえで充分に洗浄されているか否かを判定するために用いることができる。上記の試験は、汚染された表面の検出に有用であるが、試験の実施に多くの工程を要し得るものであり、生きた細胞の存在を死細胞から迅速かつ／又は容易に区別できない場合があり、場合によっては、結果を判定できるまでに長い時間（例えば、数時間又は数日）を要し得る。
これらの試験を用いて、生きた微生物の存在を示すことができる。こうした試験では、生きた細胞に付随する生物学的検体（例えば、ＡＴＰ）を放出させるために、細胞抽出剤がしばしば使用される。細胞外物質（例えば、死んだ又はストレス下の動物細胞、植物細胞、及び／又は微生物から環境中に放出される非細胞性ＡＴＰなど）が存在すると、高い「バックグラウンド」濃度のＡＴＰを生じ、これが生きた細胞の検出を困難とする場合がある。
生きた細胞を検出するための多くの方法及び装置が存在するにも関わらず、生きた細胞、特に生きた微生物細胞の検出のための単純かつ信頼できる試験が依然求められている。
本開示は一般的には、試料中の生きた細胞を検出するための物品及び方法に関する。本物品及び方法により、表面上の細菌などの細胞の存在を迅速に検出する（例えば、蛍光、化学発光、又は色反応などにより）ことが可能になる。いくつかの実施形態では、本発明の物品は「すぐに試料測定が行える状態」（即ち、物品が、試料中の生きた細胞を検出するために必要なすべての要素を含む）である。特定の態様では、本発明の物品及び方法は、真核細胞（例えば、植物細胞又は動物細胞）に関連する生物学的検体（例えば、ＡＴＰ又は酵素）を原核細胞（例えば、細菌細胞）に関連する同様又は同一の生物学的検体から区別するための手段を提供する。更に、本発明の物品及び方法は、環境中に遊離している生物学的検体（即ち、非細胞性の生物学的検体）を、生きた細胞に関連する同様又は同一の生物学的検体から区別するための手段を提供する。
本開示の方法は、操作者が液体試料から細胞を濃縮し、細胞に関連した検体を検出することを可能とするものである。特定の実施形態では、検体の検出は、特に試料中の生きた微生物細胞を含む生きた細胞の指標となり得る。いくつかの実施形態において、本方法は、操作者が試料中の生物学的検体及び／又は細胞の量を測定することを提供する。いくつかの実施形態では、本方法は、組成物から有効量の細胞抽出剤が液体混合物中に放出される所定の時間の後に操作者が生物学的検体の量を測定することにより、試料中の非細胞性物質に由来する生物学的検体の量と、生きた細胞に由来する生物学的検体の量を区別して求めることを提供する。いくつかの実施形態では、本方法は、操作者が第１の所定の時間内に生物学的検体の量の第１の測定を行い、更に組成物から有効量の細胞抽出剤が放出される第２の所定の時間内に生物学的検体の量の第２の測定を行うことによって、試料中の生きた細胞の存在を検出することを提供する。いくつかの実施形態では、本方法は、試料中の生物学的検体が生きた植物又は動物細胞から放出されたものであるか、あるいは生きた微生物細胞（例えば、細菌）から放出されたものであるかを操作者が区別することを提供する。本発明は、食品調理サービス施設、医療環境などの比較的過酷な現場環境において、操作者が使用することが可能である。
一態様では、本開示は、試料中の細胞を検出する方法を提供する。本方法は、細胞濃縮剤と、細胞抽出剤を含む放出要素と、液体試料とを提供することを含むことができる。本方法は、液体試料と細胞濃縮剤とを所定の時間接触させることと、液体試料の少なくとも一部から細胞濃縮剤を分離することと、分離された細胞濃縮剤と放出要素とを含む液体混合物を形成することと、ここで、細胞抽出剤は混合物中に放出される、細胞からの生物学的検体を検出すること、を更に含むことができる。任意に、検体は、２つ以上の別個の時点で検出されることができる。いくつかの実施形態において、生物学的検体を検出することは、生きた細胞を検出することを含む。いくつかの実施形態において、生物学的検体を検出することは、検出系を使用することを含むことができる。いくつかの実施形態において、生物学的検体を検出することは、検体の量を定量することを含むことができる。いくつかの実施形態において、生物学的検体を検出することは、細胞からのＡＴＰを検出することを含むことができる。いくつかの実施形態において、生物学的検体を検出することは、遺伝学的又は免疫学的方法によって細胞を検出することを含むことができる。いくつかの実施形態において、本方法は、体細胞抽出剤を提供する工程と、この体細胞抽出剤を試料からの細胞と接触させる工程と、を更に含むことができる。
別の態様において、本開示は試料中の細胞を検出する方法を提供する。本方法は、試料；細胞濃縮剤；細胞抽出剤を含む放出要素；第１及び第２の貯留部を備えたハウジングと試料を受容するように構成された開口部とを含む検出物品；細胞濃縮剤を分離してハウジングの第１の貯留部から第２の貯留部に移動させるための手段、を提供する工程を含むことができる。本方法は、ハウジングの第１の貯留部内の液体媒質中で試料と細胞濃縮剤とを接触させることを更に含むことができる。本方法は、ハウジング内の第２の貯留部に細胞濃縮剤を移動させることを更に含むことができる。本方法は、分離された細胞濃縮剤と放出要素とを含む液体混合物を形成することを更に含むことができ、細胞抽出剤は混合物中に放出される。本方法は、細胞からの生物学的検体を検出することを更に含むことができる。任意に、生物学的検体は、２つ以上の別個の時点で検出することができる。いくつかの実施形態において、生物学的検体を検出することは、生きた細胞を検出することを含むことができる。いくつかの実施形態において、生物学的検体を検出することは、検出系を使用することを含むことができる。いくつかの実施形態において、生物学的検体を検出することは、検体の量を定量することを含むことができる。いくつかの実施形態において、生物学的検体を検出することは、細胞からのＡＴＰを検出することを含むことができる。いくつかの実施形態において、生物学的検体を検出することは、遺伝学的又は免疫学的方法によって細胞を検出することを含むことができる。いくつかの実施形態において、本方法は、体細胞抽出剤を提供する工程と、この体細胞抽出剤を試料からの細胞と接触させる工程と、を更に含むことができる。
別の態様において、本開示は試料中の細胞を検出するための方法を提供する。本方法は、試料；試料を受容するように構成された開口部と、細胞濃縮剤が収容された第１の貯留部と、細胞抽出剤を含む放出要素が収容された第２の貯留部と、を備えるハウジングを含む検出物品；細胞濃縮剤を液体試料の少なくとも一部から分離するための手段；及び細胞濃縮剤をハウジングの第１の貯留部から第２の貯留部に移動させるための手段、を提供する工程を含むことができる。本方法は、ハウジングの第１の貯留部内の液体媒質中で試料と細胞濃縮剤とを接触させることを含むことができる。本方法は、細胞濃縮剤を分離して、ハウジングの第２の貯留部に移動させる工程を更に含むことができる。本方法は、分離された細胞濃縮剤と放出要素とを含む液体混合物を形成することを更に含むことができ、細胞抽出剤は、混合物中に放出される。本方法は、細胞からの生物学的検体を検出することを更に含むことができる。任意に、生物学的検体は、２つ以上の別個の時点で検出されることができる。いくつかの実施形態において、生物学的検体を検出することは、生きた細胞を検出することを含むことができる。いくつかの実施形態において、生物学的検体を検出することは、検出系を使用することを含むことができる。いくつかの実施形態において、生物学的検体を検出することは、検体の量を定量することを含むことができる。いくつかの実施形態において、生物学的検体を検出することは、細胞からのＡＴＰを検出することを含むことができる。いくつかの実施形態において、生物学的検体を検出することは、遺伝学的又は免疫学的方法によって細胞を検出することを含むことができる。いくつかの実施形態において、本方法は、体細胞抽出剤を提供する工程と、この体細胞抽出剤を試料からの細胞と接触させる工程と、を更に含むことができる。
別の態様において、本開示は一体型試料調製及び検出装置を提供する。装置は、それらの間に通路を有する第１の貯留部と第２の貯留部とを含むハウジングを含むことができる。ハウジングの第１の貯留部は、試料を受容するように構成された開口部と、その中に配置された細胞濃縮剤を含むことができる。ハウジングの第２の貯留部は、その中に配置された検出試薬を含むことができる。装置は、第１の貯留部を第２の貯留部から隔離するための手段を更に含むことができる。装置は、細胞濃縮剤を第１の貯留部から第２の貯留部に移動させるための手段を更に含むことができる。いくつかの実施形態において、第１の貯留部と第２の貯留部とを隔離するための手段は、細胞濃縮剤を第１の貯留部から第２の貯留部に移動させるための手段である。いくつかの実施形態において、ハウジングは、隔離された第１の貯留部と第２の貯留部との間の破断可能なシールを更に含むことができる。いくつかの実施形態において、第１の貯留部はテーパ領域を含むことができる。いくつかの実施形態において、装置は、細胞抽出剤を含む放出要素を更に含むことができる。いくつかの実施形態において、ハウジングは、第３の貯留部を更に含むことができる。いくつかの実施形態において、装置は、試料取得装置を更に含むことができる。いくつかの実施形態において、検出試薬は、ＡＴＰを検出するための試薬を含むことができる。いくつかの実施形態において、装置は、検出試薬を含む放出要素を更に含むことができる。
別の態様において、本開示は一体型試料調製及び検出装置を提供する。装置は、それらの間に通路を有する隔離された第１及び第２の貯留部と、通路に嵌合するように構成されたピストンとを含むハウジングを含むことができる。ハウジングの第１の貯留部は、試料を受容するように構成された開口部と、その中に配置された細胞濃縮剤を含むことができる。ハウジングの第２の貯留部は、その中に配置された検出試薬を含むことができる。いくつかの実施形態において、ハウジングは、隔離された第１の貯留部と第２の貯留部との間の破断可能なシールを更に含むことができる。いくつかの実施形態において、第１の貯留部は、テーパ形状の内壁を含むことができる。いくつかの実施形態において、装置は、細胞抽出剤を含む放出要素を更に含むことができる。いくつかの実施形態において、ハウジングは、第３の隔離された貯留部を更に含むことができる。いくつかの実施形態において、装置は、試料取得装置を更に含むことができる。いくつかの実施形態において、検出試薬は、ＡＴＰを検出するための試薬を含むことができる。いくつかの実施形態において、装置は、検出試薬を含む徐放性組成物を更に含むことができる。
別の態様において、本開示は一体型試料調製及び検出装置を提供する。装置は、それらの間に通路を有する隔離された第１の貯留部と第２の貯留部を含むハウジングを含むことができる。ハウジングの第１の貯留部は、試料を受容するように構成された開口部と、その中に配置された細胞濃縮剤とを含む。第２の貯留部は、その中に配置された検出試薬を含むことができる。装置は、第１の貯留部から第２の貯留部への物質の通過を制御するように構成された弁を更に含むことができる。いくつかの実施形態において、第１の貯留部は、テーパ形状の内壁を含むことができる。いくつかの実施形態において、装置は、細胞抽出剤を含む放出要素を更に含むことができる。いくつかの実施形態において、ハウジングは、第３の隔離された貯留部を更に含むことができる。いくつかの実施形態において、装置は、試料取得装置を更に含むことができる。いくつかの実施形態において、検出試薬は、ＡＴＰを検出するための試薬を含むことができる。いくつかの実施形態において、装置は、検出試薬を含む徐放性組成物を更に含むことができる。
別の態様において、本開示は、それらの間に通路を有する隔離された第１の貯留部と第２の貯留部を含むハウジングと、細胞濃縮剤を第１の貯留部から第２の貯留部に移動させるための手段と、を含むキットを提供する。ハウジングの第１の貯留部は、試料を受容するように構成された開口部を含むことができる。第２の貯留部は、その中に配置された検出試薬を含むことができる。キットは、細胞濃縮剤を更に含むことができる。いくつかの実施形態において、細胞濃縮剤は、ハウジングの第１の貯留部内に配置される。いくつかの実施形態において、キットは、微生物細胞抽出剤を含む放出要素を更に含むことができる。いくつかの実施形態において、キットは、体細胞抽出剤を更に含むことができる。いくつかの実施形態において、キットは、試料取得装置を更に含むことができる。
別の態様において、本開示は、それらの間に通路を有する隔離された第１の貯留部と第２の貯留部を含むハウジングとを含むキットを提供する。ハウジング内の第１の貯留部は、試料を受容するように構成された開口部を含むことができる。ハウジング内の第２の貯留部は、その中に配置された検出試薬を含むことができる。キットは、細胞濃縮剤と、細胞濃縮剤を第１の貯留部から第２の貯留部に移動させるための手段と、を更に含むことができる。いくつかの実施形態において、細胞濃縮剤は、ハウジングの第１の貯留部の中に配置される。いくつかの実施形態において、キットは、微生物細胞抽出剤を含む放出要素を更に含むことができる。いくつかの実施形態において、キットは、体細胞抽出剤を更に含むことができる。いくつかの実施形態において、キットは、試料取得装置を更に含むことができる。
用語解説
本明細書で使用する「生物学的検体」とは、生物内に生ずる、又は生物によって生成される分子、又はその誘導体を指す。例えば、生物学的検体としては、これらに限定されるものではないが、アミノ酸、核酸、ポリペプチド、タンパク質、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、脂質、リン脂質、糖類、多糖類、及びこれらの組み合わせのうちの少なくとも１つを挙げることができる。生物学的検体の具体例としては、これらに限定されるものではないが、代謝産物（例えば、ＡＴＰなどの小分子、又はプロテインＡなどのポリペプチド）、アレルゲン（例えば、落花生アレルゲン）、ホルモン、毒素（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属下痢毒素、アフラトキシンなど）、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、全ＲＮＡ、ｔＲＮＡなど）、ＤＮＡ（例えば、プラスミドＤＮＡ、植物ＤＮＡなど）、タグ付きタンパク質、抗体、抗原、及びこれらの組み合わせを挙げることができる。
本明細書で使用する「液体試料」とは、液体を含む試料物質を指す。試料は、その元々の形態では、例えば、水、母乳、分泌液、血液、傷口の滲出液などの液体を含むものでよい。また、液体試料は、液体懸濁媒質（例えば、水、水性緩衝液など）中に固体を懸濁した懸濁液であることができる。例えば、固体、半固体、又はゼラチン状試料を試料取得装置によって採取し、液体に懸濁させて液体試料とすることができる。
「清澄化液体試料」とは、液体試料を細胞濃縮剤と接触させ、細胞濃縮剤を液体のバルクから分離した（例えば、沈降、濾過、遠心、又は沈殿により）後に残る液体試料のバルクを指す。
「試料取得装置」とは、本明細書では最も広い意味で使用され、液体、半固体、又は固体の試料物質を採取するために使用される器具を指す。試料取得装置の非限定的な例としては、スワブ、ワイプ、スポンジ、スクープ、スパチュラ、ピペット、ピペット先端、及びサイフォンホースが挙げられる。
本明細書で使用する「行き止まり弁」とは、検出装置のハウジング内の２つ以上の貯留部間の物質（例えば、液体、固体、又は液体中の固体の懸濁液）の移動を調節するために使用される弁の一種を指す。行き止まり弁は、物質の移動に使用される弁内のキャビティが、一度に１つの貯留部とのみ流体連通し得るような設計となっている。
本明細書で使用する用語「ヒドロゲル」は、親水性であり、極性溶媒によって膨潤しているかあるいは膨潤させることが可能なポリマー材料を指す。このポリマー材料は、通常、極性溶媒と接触すると膨潤するが溶解しない。即ち、ヒドロゲルは、極性溶媒に不溶である。膨潤したヒドロゲルは、乾燥させることで極性溶媒の少なくとも一部を除去することができる。
本明細書で使用する「細胞抽出剤」とは、細胞膜又は細胞壁の透過性を変化させるか、あるいは細胞（例えば、体細胞若しくは微生物細胞）の細胞膜及び／又は細胞壁の完全性を乱す（即ち、溶解又は孔を形成する）ことにより、生きた細胞に通常見られる生物学的検体を抽出又は放出させるような任意の化合物又は化合物の組み合わせを指す。
本明細書で使用する「検出系」とは、生物学的検体を検出するために使用される成分を指し、酵素、酵素基質、結合相手（例えば、抗体又は受容体）、標識、色素、並びに吸光度若しくは反射率、蛍光及び／又は発光（例えば、生物発光若しくは化学発光）を検出するための装置が挙げられる。
用語「好ましい」及び「好ましくは」は、特定の状況下で、特定の利点をもたらし得る本発明の実施形態を指す。しかしながら、同一の又は他の状況下で、他の実施形態もまた好ましい可能性がある。更に、１つ以上の好ましい実施形態の引用は、他の実施形態が有用でないことを含意するものではなく、本発明の範囲内から他の実施形態を排除することを意図するものではない。
用語「含む」及びその変化形は、これらの用語が説明文及び特許請求の範囲において現れる場合、限定的な意味を有するものではない。
本明細書で使用するとき、「１つの（a）」、「１つの（an）」、「その（the）」、「少なくとも１つの」及び「１つ以上の」は、同じ意味で使用される。したがって、例えば、「ａ」検出試薬を含むハウジングとは、ハウジングが「１つ以上の」検出試薬を含むことができることを意味するものとして解釈することができる。
「及び／又は」という用語は、記載した要素の一部若しくはすべて、又は記載した要素のうちの任意の２つ以上の組み合わせを意味する。
また本明細書において、端点による数の範囲の列挙には、その範囲内に包含されるすべての数（例えば、１〜５には、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５、等）が包含される。
本発明の上述の「課題を解決するための手段」は、本発明の開示されるそれぞれの実施形態又はすべての実施を記載することを目的としていない。以下の説明により、例示的な実施形態をより具体的に例示する。本出願のいくつかの箇所で、実施例の一覧として説明を提供するが、実施例は種々の組み合わせにて使用することが可能である。いずれの場合にも、記載した一覧は、代表的な群としてのみ役立つものであり、排他的な一覧として解釈されるべきではない。
２個の受容部を含むハウジングの一実施形態の断面図、及びハウジングと使用するために適合されたプランジャの断面図を示すものであり、これらはいずれも本開示に基づく試料調製及び検出装置の構成要素。 プランジャがハウジング内の第１の位置に配置され、ハウジングの第１の貯留部内に細胞濃縮剤を含む、組み立てられた状態の図１Ａの装置の断面図を示す。 プランジャがハウジング内の第２の位置に配置され、ハウジングの第１の貯留部内に液体試料を含む、図１Ｂの装置の断面図を示す。 プランジャが第１の位置にあり、細胞濃縮剤がハウジングの第２の貯留部内にある、図１Ｃの装置の断面図を示す。 破断可能なシールによって分離された３個の貯留部を含むハウジングの一実施形態の断面図、及びハウジングと使用するために適合されたプランジャの側面図を示すものであり、これらはいずれも本開示に基づく試料調製及び検出装置の構成要素。 キャップが取り付けられ、ハウジングの第１の貯留部内に液体試料が配置された、図２Ａのハウジングの断面図を示す。 キャップのない状態で、かつプランジャがハウジング内の第１の位置に配置された、図２Ｂのハウジングの断面図を示す。 プランジャがハウジング内の第２の位置に配置され、細胞濃縮剤がハウジングの第２の貯留部に移動された、図２Ｃの装置の断面図を示す。 本開示に基づく、ハウジング及び弁を含む試料調製及び検出装置の一実施形態の正面図を示す。 図３Ａの装置の側面図を示す。 液体試料及び細胞濃縮剤がハウジングの第１の貯留部内に配置され、弁が第１の位置にある、図３Ａの装置の断面図を示す。 弁が第２の位置にあり、細胞濃縮剤がハウジングの第２の貯留部に移動された、図３Ｃの装置の断面図を示す。 ２個の貯留部及びドレーン弁を含むハウジングの一実施形態の断面図、並びにプランジャの側面図を示すものであり、これらはいずれも試料調製及び検出装置の構成要素。 ドレーン弁が開いた配置にあり、プランジャがハウジング内の第１の位置に配置された、組み立てられた状態の図４Ａの装置の断面図を示す。 プランジャがハウジング内の第２の位置に配置され、細胞濃縮剤がハウジングの第２の貯留部に移された、組み立てられた状態の図４Ｂの装置の断面図を示す。 プランジャが破断可能なシールに穿孔して細胞濃縮剤を第２の貯留部に移動させた、図４Ｃの装置の断面図を示す。 ハウジングの一実施形態の断面図、及び部分的に断面にて示されたプランジャの側面図を示すものであり、これらはいずれも本開示に基づく試料調製及び検出装置の一実施形態の構成要素。 プランジャがハウジングの異なる深さに挿入された、組み立てられた状態の図５Ａの装置の断面図を示す。 プランジャがハウジングの異なる深さに挿入された、組み立てられた状態の図５Ａの装置の断面図を示す。 プランジャがハウジングの異なる深さに挿入された、組み立てられた状態の図５Ａの装置の断面図を示す。 図５Ａのプランジャの先端部の、部分的に断面にて示された分解側面図を示す。 組み立てられた状態の図６Ａの先端部の、部分的に断面にて示された側面図を示す。 ハウジングの一実施形態の断面図、及び部分的に断面にて示された中空のプランジャの側面図を示すものであり、これらはいずれも本開示に基づく試料調製及び検出装置の一実施形態の構成要素。 プランジャがハウジングの異なる深さに挿入された、組み立てられた状態の図７Ａの装置の側面図を示す。 プランジャがハウジングの異なる深さに挿入された、組み立てられた状態の図７Ａの装置の側面図を示す。 プランジャがハウジングの異なる深さに挿入された、組み立てられた状態の図７Ａの装置の側面図を示す。 図７Ａのプランジャの先端部の、部分的に断面にて示された分解側面図を示す。 組み立てられた状態の図８Ａの先端部の、部分的に断面にて示された側面図を示す。 本開示に基づく細胞濃縮剤回収要素の一実施形態を示す。 ハウジングの一実施形態の断面図、及び部分的に断面にて示されたプランジャの側面図を示すものであり、これらはいずれも本開示に基づく試料調製及び検出装置の一実施形態の構成要素。 組み立てられた状態の図１０Ａの装置の、部分的に断面にて示された側面図を示す。 その中に細胞抽出剤が分散されている放出要素の一実施形態の上面斜視図を示す。 空洞を有する基材を含む放出要素の一実施形態の平面図。 図１２ａの放出要素の断面図。 マイクロチャネル空洞を含む放出要素の一実施形態の上面斜視図。 ゲスト化合物を含むコアを有するシェル構造を含む放出要素の一実施形態の断面図。 ゲスト化合物を含むシェル構造を含む放出要素の一実施形態の断面図。 第１のゲスト化合物を含むコア、及び第２のゲスト化合物を含むシェル構造を有するシェル構造を含む放出要素の一実施形態の断面図。 連続した層で配列された複数のシェル構造を含む放出要素の一実施形態の断面図。 外側のシェル構造内に独立して配列された複数のシェル構造を含む放出要素の一実施形態の断面図。
本明細書に引用する特許、特許出願、政府刊行物、政府規制、及び参照文献はすべて、その全容を本明細書に援用する。記載の不一致の場合には、定義を含めた本明細書の記載内容が優先する。
本発明は、試料中の微生物を検出するための物品及び方法に一般的に関する。特定の好ましい実施形態では、本発明は試料中の生きた微生物の検出に関する。試料からの細胞を濃縮するための方法及び装置は、いずれも参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＰＣＴ国際公開特許ＷＯ ２０１０／０７８３９９、発明の名称「ＳＡＭＰＬＩＮＧ ＤＥＶＩＣＥＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＣＯＮＣＥＮＴＲＡＴＩＮＧ ＭＩＣＲＯＯＲＧＡＮＩＳＭＳ」、及びＰＣＴ国際公開特許ＷＯ ２０１０／０７８４０４、発明の名称「ＭＥＴＨＯＤＳ，ＫＩＴＳ ＡＮＤ ＳＹＳＴＥＭＳ ＦＯＲ ＰＲＯＣＥＳＳＩＮＧ ＳＡＭＰＬＥＳ」に記載されている。本明細書で開示する本発明の装置及び方法は、試料中に存在する少数の微生物を検出するための高い感度を与える。
生物学的検体を使用して、試料中の生きた細胞などの生物学的物質の存在を検出することができる。生物学的検体は、検体が関与し得る様々な反応によって検出することができる（例えば、結合反応、触媒反応など）。
様々な形態の化学発光反応を利用して、液体中及び加工処理された材料中の細菌細胞などの細胞を検出することができる。本開示のいくつかの実施形態では、酵素ルシフェラーゼの存在下でのアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）とルシフェリンとの反応に基づく化学発光反応による光の発生が、生物学的検体としてのＡＴＰを検出するためのシグナルの発生の化学的基礎を与える。ＡＴＰはすべての微生物細胞を含む、すべての生きた細胞中に存在することから、この方法は、試料中の生きた細胞の数を定量的又は準定量的に推定するための迅速なアッセイを提供することができる。基礎となる反応の性質、その発見の経緯、及びその一般的な応用分野に関する初期の論説が、Ｅ．Ｎ．Ｈａｒｖｅｙ（１９５７）、Ａ Ｈｉｓｔｏｒｙ ｏｆ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ：Ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｅａｒｌｉｅｓｔ Ｔｉｍｅｓ Ｕｎｔｉｌ １９００、Ａｍｅｒ．Ｐｈｉｌ．Ｓｏｃ．、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、Ｐａ．及びＷ．Ｄ．ＭｃＥｌｒｏｙ及びＢ．Ｌ．Ｓｔｒｅｈｌｅｒ（１９４９）、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２２：４２０〜４３３に述べられている。
細菌及びその他の微生物種はある程度のＡＴＰを含むため、ＡＴＰ検出は細菌及びその他の微生物種を検出するうえで信頼性の高い手段である。ＡＴＰから得られる化学結合エネルギーは、北米産ホタル（Photinus pyralis）の尾部で起こる生物発光反応に利用されている。この反応の生化学的成分はＡＴＰを含まずに単離することができ、その後これを他の供給源のＡＴＰを検出するために使用することができる。このホタルの生物発光反応の機構はよく特徴付けられている（ＤｅＬｕｃａ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．、１９７９ Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９５：１９４〜１９８）。
放出要素：
本開示による放出要素は、封入材料を含む。封入材料は、一般に、液体混合物（例えば、試料を含む水性混合物）の中への有効量の細胞抽出剤の即時溶解を所定の時間の間防止するための物理的バリア及び／又は拡散バリアとしての役割を果たす。
いくつかの実施形態において、封入材料は、封入材が活性化刺激に曝露された後に有効量の細胞抽出剤を放出するように活性化されてよい。活性化は、例えば、封入材料の溶解又は部分的な溶解、封入材料の透過化（例えば、部分的に脱水されたポリマーを膨潤させることによる）、封入材料の離解又は部分的な離解（例えば、ワックスなどの固形物を融解させることによる）を包含し得る。
いくつかの実施形態において、封入材料は、本明細書に記載のように、シェル構造（例えば、クロモニック物質）を含むことができる。
いくつかの実施形態において、封入材料は、マトリックスを含むことができる。好適なマトリックス材料の例は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＰＣＴ国際公開特許ＷＯ ２０１０／１２９７２６、発明の名称「ＡＲＴＩＣＬＥＳ ＷＩＴＨ ＭＡＴＲＩＸ ＣＯＭＰＲＩＳＩＮＧ Ａ ＣＥＬＬ ＥＸＴＲＡＣＴＡＮＴ ＡＮＤ ＢＩＯＤＥＴＥＣＴＩＯＮ ＭＥＴＨＯＤＳ ＴＨＥＲＥＯＦ」に見出すことができる。いくつかの実施形態において、マトリックスは、液体（例えば、試料を含む水性液体）に実質的に不溶性である材料（例えば、ポリマー材料又はセラミックなどの非ポリマー材料）を含む。いくつかの実施形態において、マトリックスは、周囲温度で水溶液に実質的に可溶性及び／又は分散性である賦形剤を含む。いくつかの実施形態において、マトリックスは、周囲温度で水溶液に実質的に不溶性及び非分散性である賦形剤を含む（即ち、賦形剤の溶解又は分散は、温度変化及び／又は化学的トリガの添加によって引き起こされることができる）。
いくつかの実施形態において、マトリックスは、予備形成されたマトリックス（即ち、マトリックスに細胞抽出剤が注入される前に形成されるマトリックス）であることができる。これらの実施形態では、細胞抽出剤を含有する液体の中にマトリックスを入れて、細胞抽出剤をマトリックス材料の中に拡散させることによって、細胞抽出剤をマトリックスに装填することができる。いくつかの実施形態において、マトリックス前駆体は、細胞抽出剤を有する溶液中で混合することができ、マトリックス内に分散した細胞抽出剤を有するマトリックスが形成される。別の実施形態において、細胞抽出剤は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００５／０１５２９９２号に記述されているように、ワックスの中に分散させることができる。
封入材料には、ヒドロゲルを含むことができる。物品におけるヒドロゲルの使用及び試料中の細胞の検出方法は、それぞれが参照によりその全体が本明細書に組み込まれる２００８年９月３０日出願のＰＣＴ国際公開特許ＷＯ ２０１０／０３９６２７及び米国特許出願第６１／１０１，５６３号、発明の名称「ＢＩＯＤＥＴＥＣＴＩＯＮ ＡＲＴＩＣＬＥＳ ａｎｄ ＢＩＯＤＥＴＥＣＴＩＯＮ ＭＥＴＨＯＤＳ」に記載されている。
ヒドロゲルは、架橋ヒドロゲル、膨潤ヒドロゲル、及び乾燥又は部分的に乾燥したヒドロゲルを広義に包含する。本開示の好適なヒドロゲルには、例えば、ヒドロゲル、及びそのヒドロゲルから製造されるポリマービーズが挙げられ、これらはＰＣＴ国際公開特許公報ＷＯ ２００７／１４６７２２に記述されており、この全体が参照により本明細書に組み込まれる。
その他の好適なヒドロゲルには、エチレン性不飽和カルボキシル含有モノマーとカルボン酸、ビニルスルホン酸、セルロースモノマー、ポリビニルアルコールから選択されるコモノマーとを含むポリマー（米国特許出願公開第ＵＳ２００４／０１５７９７１号に記載）；でんぷん、セルロース、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレングリコール、及びこれらのコポリマーを含むポリマー（米国特許出願公開第ＵＳ ２００６／００６２８５４号に記載）；分子量２０００ダルトン未満の、多官能基ポリ（アルキレンオキシド）のフリーラジカル重合性マクロモノマーを含むポリマー（米国特許第７，００５，１４３号に記載）；液体媒体にさらされると架橋するシラン官能化ポリエチレンオキシドを含むポリマー（米国特許第６，９６７，２６１号に記載）；ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、及びプロピレングリコールから選択される少なくとも１つのアルコールをともなうポリウレタンプレポリマーを含むポリマー（米国特許第６，８６１，０６７号に記載）；多糖類、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリウレタン、ポリアクリレート、ポリアクリルアミド、コラーゲン及びゼラチンから選択される親水性ポリマーを含むポリマー（米国特許第６，６６９，９８１号に記載）が挙げられ、これらの開示はすべてその全体が参照により本明細書に組み込まれる。その他の好適なヒドロゲルには、寒天、アガロース、ポリアクリルアミドヒドロゲル、及びこれらの誘導体が挙げられる。
本開示は、成形ヒドロゲルを含む物品及び方法を提供する。成形ヒドロゲルには、例えば、ビーズ、シート、リボン、及び繊維に成形したヒドロゲルが挙げられる。成形ヒドロゲルの更なる例、及び成形ヒドロゲルを製造することができる代表的なプロセスは、米国特許出願公開第２００８／０２０７７９４ Ａ１号、発明の名称「ＰＯＬＹＭＥＲＩＣ ＦＩＢＥＲＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＭＡＫＩＮＧ」、及び米国特許出願公開第第２０１０／０２９５２１９号、発明の名称「ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＭＡＫＩＮＧ ＳＨＡＰＥＤ ＰＯＬＹＭＥＲＩＣ ＭＡＴＥＲＩＡＬＳ」に開示されており、これらはともに参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
本開示のヒドロゲルは、細胞抽出剤を含むことができる。細胞抽出剤を含むヒドロゲルは、２つの基本的プロセスによって製造することができる。第一のプロセスでは、細胞抽出剤が、ヒドロゲルポリマーの合成中にヒドロゲル内に組み込まれる。第１のプロセスの例は、ＰＣＴ国際公開特許ＷＯ ２００７／１４６７２２に見出すことができる。第二のプロセスでは、細胞抽出剤が、ヒドロゲルポリマーの合成後にヒドロゲル内に組み込まれる。例えば、ヒドロゲルを細胞抽出剤の溶液に入れ、細胞抽出剤をヒドロゲルに吸収及び／又は吸着させる。第２のプロセスの更なる例は、ヒドロゲルにイオン性モノマーを組み込む、例えばカチオン性モノマーをヒドロゲルに組み込むことなどである。
いくつかの用途においては、細胞抽出剤を含む放出要素が、乾燥状態又は部分的乾燥状態であることが望ましい場合がある。例えば、蒸発プロセス、熱対流炉、電子レンジ、及び真空炉内での乾燥、並びに凍結乾燥などの、当業者に既知の方法によって、特定の放出要素（例えば、水膨潤ヒドロゲル）を乾燥させることができる。乾燥状態又は部分的乾燥状態である放出要素が液体又は水溶液に曝露されると、細胞抽出剤は放出要素から拡散することができる。細胞抽出剤は、液体又は水溶液に曝露されるまでは、放出要素内で本質的に休止状態に留まっていることができる。即ち、細胞抽出剤は、放出要素が液体に曝露されるまで、乾燥状態又は部分的乾燥状態である放出要素内に収納されることができる。この結果、必要でないときに細胞抽出剤が浪費又は損失されるのを防止することができ、かつ加水分解、酸化、又は他のメカニズムによって劣化する可能性がある水分に敏感な多数の細胞抽出剤の安定性を改善することができる。
いくつかの実施形態では、封入材料が圧力、剪断力、熱、光、ｐＨの変化、別の化学物質への曝露、イオン強度変化等の活性化刺激に曝露された後、封入材料は活性化されて、有効量の細胞抽出剤を放出することができる。活性化により、例えば、封入材料の溶解若しくは部分的な溶解、封入材料の透過化（例えば脂質二重層の破壊）、及び／又は封入材料の離解若しくは部分的な離解（例えば微結晶ワックスなどの固形物を破砕又は融解することによる）を引き起こすことができる。
放出要素は、本開示によると、細胞抽出剤を封入する錠剤を包含する。製薬学的組成物の放出を遅れさせる錠剤は、当該技術分野において既知である（例えば、ＰＣＴ国際公開特許ＷＯ ９７／０２８１２及びＷＯ ０８／１２９５１７を参照のこと）。「錠剤」は広義に用いられ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１０／０２０９９２７号、発明の名称「ＰＲＯＣＥＳＳＩＮＧ ＤＥＶＩＣＥ ＴＡＢＬＥＴ」で開示されているような微小錠剤を包含する。
錠剤は、本開示によると、賦形剤と混合された細胞抽出剤を含む。「賦形剤」は、例えば、結合剤、流動促進剤（例えば、流動補助剤）、潤滑剤、崩壊剤、及び前述の任意の２つ以上を包含して広く用いられる。いくつかの実施形態では、錠剤は、外側のコーティングを含むことができ、この外側のコーティングは、錠剤が液体（例えば、試料を含む水性液体）と接触した際の活性物質（例えば、細胞抽出剤）の放出に影響を与えることができる。いくつかの実施形態において、錠剤は、充填剤（例えば、ラクトース又はソルビトールなどの糖）を錠剤の充填剤として含むことができる。崩壊剤（例えば、デンプン又はセルロースなどの多糖類）は、錠剤の湿潤及び／又は膨潤を促進し、それによって、錠剤が液体と接触した際の活性物質の放出を容易にすることができる。ソルビトール及びマンニトールは、特定の細胞抽出剤（例えば、酵素）の安定性を促進することができる賦形剤である。マンニトールを使用して、細胞抽出剤の放出を遅らせることができる。いくつかの実施形態では、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、錠剤からの活性物質の放出を制御するのに好ましい賦形剤である。いくつかの実施形態では、３３００及び８０００ダルトンの分子量を有するＰＥＧ化合物を使用して、錠剤からの活性物質の放出を遅らせることができる。
錠剤の製造方法は当該技術分野において既知であり、例えば、直接圧縮、湿式造粒法、乾式造粒、及び流動層造粒が挙げられる。
放出要素は、本開示によると、細胞抽出剤を封入するワックスマトリックスを含む。いくつかの実施形態では、細胞抽出剤の複数の塊を、ワックスマトリックスに分散させることができる。ワックスが崩壊すると（例えば、熱融解又は機械的破砕によって）細胞抽出剤はワックスから放出される。好適なワックスの非限定的な例としては、天然若しくは合成ワックス又はワックス類似物、例えば、石蝋、モンタン蝋、カルナバ蝋、蜜蝋、スケールワックス、オゾケライト、ユタ蝋など、微結晶ワックス、例えば、プラスチック及びタンク底部から得られたワックスなど、ワックス代用品、例えば、フィッシャー・トロプシュワックスなど、ポリアルキレン、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレンなど、これらの混合物及びコポリマーが挙げられる。
いくつかの実施形態において、細胞抽出剤は、ワックスと不混和性の溶液（例えば、水溶液）の液滴としてワックス中に分散されることができる。いくつかの実施形態において、細胞抽出剤は、固体又は半固体の粒子又は凝集体としてワックス中に分散されることができる。このような液体又は固体の分散をワックス中に生じさせる方法は、当該技術分野において周知である。
図１１は、マトリックス材料１１９２を含む放出要素１１４０の一実施形態の斜視図を示す。図に示される実施形態では、マトリックス材料１１９２は、ワックスのフィルム又はブロックを含む。マトリックス材料１１９２中に分散しているのは、細胞抽出剤を含む空洞１１９４である。放出要素１１４０中に分散される細胞抽出剤の量及び／又は濃度、並びに放出要素１１４０の形状及び寸法は、所与の検出物品中で使用するために変更可能であることが認識される。
放出要素は、本発明によると、細胞抽出剤を含むマトリックス材料でコーティングされた基材を含む。細胞抽出剤でコーティングされた基材を含む放出要素は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ国際公開特許ＷＯ ２０１０／１２９７２７、発明の名称「ＣＯＡＴＥＤ ＳＵＢＳＴＲＡＴＥＳ ＣＯＭＰＲＩＳＩＮＧ Ａ ＣＥＬＬ ＥＸＴＲＡＣＴＡＮＴ ＡＮＤ ＢＩＯＤＥＴＥＣＴＩＯＮ ＭＥＴＨＯＤＳ ＴＨＥＲＥＯＦ」に開示されている。マトリックス材料は、本明細書に記載されるような任意の好適なマトリックス材料であることができる。
マトリックス材料は、例えば、ディップコーティング、ナイフコーティング、カーテンコーティング、吹付け塗り、キスコーティング、グラビアコーティング、オフセットグラビアコーティング、及び／又はスクリーン印刷及びインクジェット印刷などの印刷方式といった、当該技術分野において既知のコーティングプロセスを用いて、基材上にコーティングされることができる。いくつかの実施形態において、コーティングは、予め定められたパターンで塗布されることができる。コーティングプロセスの選択は、固体基材の形状及び寸法によって影響され、任意の所与の固体基材をコーティングするための好適なプロセスを判別することは、当業者の把握する範囲内である。
いくつかの実施形態では、マトリックス材料は、細胞抽出剤を含む予備形成されたマトリックス（例えば、ポリマーマトリックス）として基材上にコーティングされる。いくつかの実施形態では、マトリックス前駆体と細胞抽出剤とを含む混合物が基材上にコーティングされ、マトリックスは、例えば、当該技術分野において既知の及び／又は本明細書に記載される重合プロセスを用いて、基材上に形成される。いくつかの実施形態では、予備形成されたマトリックスが基材上にコーティングされるか又はマトリックスが基材上に形成された後、続いて当該技術分野において既知の及び／又は本明細書に記載されるプロセスを用いて、細胞抽出剤が基材に装填される。
いくつかの実施形態において、コーティング混合物は、コーティングプロセスを容易にする及び／又は基材に対するマトリックス材料の付着力を促進するために、添加剤（例えば、結合剤又は増粘剤）を含む。添加剤の非限定例としては、ガム（例えば、グアーガム、キサンタンガム、アルギン酸塩、カラギーナン、ペクチン、寒天、ジェラン、アガロース）、多糖類（例えば、デンプン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース）、及びポリペプチド（例えば、ゼラチン）が挙げられる。
コーティング添加剤は、試料中の細胞を検出するのに使用される検出系との適合性で選択される必要がある。この適合性は、本明細書に記載されるように、添加剤を検出系（例えば、ルシフェラーゼ及びルシフェリン）及び検出すべき検体（例えば、ＡＴＰ）と混合し、反応を測定し、かつ添加剤が検体の検出を実質的に阻害したしたかどうかを判定することによって試験されることができる。
マトリックス材料がコーティングされる基材は、様々な固体基材を包含する。細胞抽出剤を含むマトリックスがコーティングされる好適な基材材料の非限定例としては、プラスチック（例えば、ポリカーボネート、ポリエチレン及びポリプロピレンなどのポリアルキレン、ポリエステル、ポリアクリレート、並びにこれらの誘導体及び混合物）、金属（例えば、金、グラファイト、白金、パラジウム、ニッケル）、ガラス、セルロース及びセルロース誘導体（例えば、濾紙）、セラミック材料、開放セル発泡体（例えば、ポリウレタンフォーム）、不織布材料（例えば、膜、ＰＴＦＥ膜）、並びにこれらの組み合わせ（例えば、プラスチックコーティング金属箔）が挙げられる。基材は、例えば、繊維、不織布材料（例えば、セルロース、ガラス、ポリエステル、ポリアルキレン、ポリスチレン、及びこれらの誘導体又はこれらの組み合わせを含む繊維性材料から製造される不織布材料）、粒子（例えば、ビーズ）、シート、フィルム、及び膜などを含む様々な形態で構成されることができる。
いくつかの実施形態において、基材は、フィルタ、例えばグレード４の２０〜２５μｍの定性濾紙、グレード３０のガラス繊維濾紙、グレードＧＢ００５の厚い（１．５ｍｍ）吸収性の極めて高い吸い取り紙（すべてＷｈａｔｍａｎ，Ｉｎｃ（Ｆｌｏｒｈａｍ Ｐａｒｋ，ＮＪ）より入手）、Ｚｅｔａ Ｐｌｕｓ Ｖｉｒｏｓｏｒｂ １ＭＤＳディスク（ＣＵＮＯ，Ｉｎｃ，Ｍｅｒｉｄｅｎ，ＣＴ）及び０．４５μｍのＭＦ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）などであることができる。上記基材のうちの任意の１つに、ポリビニルアルコールを含有する細胞抽出剤溶液を装填することができる。上記基材のうちの任意の１つに、ＶＡＮＴＯＣＩＬ（Ａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）を含有する細胞抽出剤溶液を装填することができる。上記基材のうちの任意の１つに、ＣＡＲＢＯＳＨＩＥＬＤ（Ｌｏｎｚａ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を含有する細胞抽出剤溶液を装填することができる。上記基材のうちの任意の１つに、５％塩化ベンザルコニウム溶液を含有する細胞抽出剤溶液を装填することができる。
マトリックス材料、細胞抽出剤、及び基材は、試料中の細胞を検出するのに使用される検出系との適合性で選択される必要がある。この適合性は、１）検出系中の検体の量を検出する（例えば、本明細書に記載されるように、ＡＴＰをルシフェリン及びルシフェラーゼと混合し、照度計で発光量を測定する）、２）マトリックス材料、細胞抽出剤、又は基材を用いた検出工程を繰り返す、３）工程１の結果と工程２の結果とを比較して、マトリックス材料、細胞抽出剤、又は基材が反応中の検体の検出及び／又は測定を実質的に阻害したかどうかを判定することによって、試験されることができる。
いくつかの実施形態において、放出要素は、コーティングされた基材を含む。コーティング、基材及び／又はコーティングされた基材は、有効量の細胞抽出剤が水性混合物中に即時溶解するのを短時間の間妨げるための、物理的バリア及び／又は拡散バリアとしての役割を果たすように適合される。
コーティングされた基材は、コーティングと基材とを含む。コーティングは細胞抽出剤を含む。コーティングは、例えば、ディップコーティング、ナイフコーティング、カーテンコーティング、吹付け塗り、キスコーティング、グラビアコーティング、オフセットグラビアコーティング、及び／又はスクリーン印刷及びインクジェット印刷などの印刷方式といった、当該技術分野において既知のコーティングプロセスを用いて、基材上に塗布されることができる。いくつかの実施形態では、コーティングは、予め定められたパターン（例えば、ストライプ、格子、斑点）で塗布されることができる。コーティングプロセスの選択は、固体基材の形状及び寸法によって影響され、任意の所与の固体基材をコーティングするための好適なプロセスを判別することは、当業者の把握する範囲内である。
コーティングが塗布される基材は、様々な基材材料を包含する。本開示のコーティングを塗布することができる好適な基材材料の非限定例としては、プラスチック（例えば、ポリカーボネート、ポリエチレン及びポリプロピレンなどのポリアルキレン、ポリエステル、ポリアクリレート、並びにこれらの誘導体及び混合物）、金属（例えば、金、グラファイト、白金、パラジウム、ニッケル）、ガラス、セルロース及びセルロース誘導体（例えば、濾紙）、セラミック材料、開放セル発泡体（例えば、ポリウレタンフォーム）、不織布材料（例えば、膜、ＰＴＦＥ膜）、並びにこれらの組み合わせ（例えば、プラスチックコーティング金属箔）が挙げられる。基材は、例えば、繊維、不織布材料、シート、及びフィルムなどを含む様々な形態で構成されることができる。
いくつかの実施形態では、基材の表面は、比較的滑らかであることができる。いくつかの実施形態では、基材の少なくとも一部は、空洞を含むことができる。図１２ａは、空洞１２９４を有する基材１２９２を含む放出要素１２４０の一実施形態の平面図を示す。図に示される実施形態では、基材１２９２はフィルム基材であってよい。図１２ｂは、図１２ａの放出要素１２４０の断面図を示す。図で示した実施形態は、空洞１２９４ａを含む基材１２９２を示しており、空洞開口部１２９５ａの断面積は、空洞１２９４ａの最大断面積にほぼ等しい。基材１２９２は空洞１２９４ｂも含み、空洞開口部１２９５ｂの断面積は、空洞１２９４ｂの最大断面積よりも小さい。理論に束縛されるものではないが、空洞開口部の面積と空洞容積の比は、細胞抽出剤の放出要素からの放出速度を制御する１つの手段として用いられることができると予想される。図で示した実施形態は、比較的均一な球形又は半球形の空洞を含むが、好適な空洞は、不均一で不規則な形状といった様々な形状を包含すると予想される。
基材は、本明細書で使用する場合、マイクロ複製された基材を包含する。マイクロ複製又は「マイクロ複製された」とは、構造化面の特徴部が、製造中に製品毎に、約５０マイクロメートルを超えて変化しない個々の特徴部の忠実度を保持するプロセスを介した、微小構造化表面（例えば、マイクロチャンネル）の形成を意味する。マイクロ複製された表面は、好ましくは、製造中に製品毎に、２５マイクロメートルを超えて変化しない個々の特徴部の忠実度を構造化面の特徴部が保持するように製造される。本発明によると、微小構造化表面は、約５０マイクロメートル〜０．０５マイクロメートル、より好ましくは２５マイクロメートル〜１マイクロメートルの解像度に維持された個々の特徴部の忠実度を有するトポグラフィー（物体、その場所又はその領域の表面特徴）を有する表面を含む。好適なマイクロ複製された基材は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００７／０２１２２６６ Ａ１号に記載されている。
図１３は、マイクロ複製された空洞を含む放出要素１３４０の一実施形態の上面斜視図を示す。放出要素１３４０は、それらの間にチャネル１３０４を形成する離間したピーク１３０２を含む基材１３９２を含む。本明細書に記載されるように、基材１３９２は、細胞抽出剤を含む組成物でコーティングされることができる。任意に、カバー１３０６（例えば、プラスチック又は金属フィルム）を基材１３９２に取り付けて（例えば、図示されていない接着剤によって）、覆われたチャネル１３０５を形成することができる。任意に、２つ以上の基材１３９２を（図のように）積み重ねて、覆われたチャネル１３０５の１つ以上の層を形成することができる。基材１３９２は、細胞抽出剤でコーティングされた後に積み重ねられることができる、又は細胞抽出剤でコーティングされる前に積み重ねられることができる。基材１３９２がコーティングの前に積み重ねられる実施形態では、覆われたチャネル１３０５の末端部に細胞抽出剤を適用することによって個々のチャネルをコーティングすることができ、毛管現象によって覆われたチャネルを満たすことができる。
覆われたチャネル１３０５は、その中に放出要素１３４０が懸濁された液体と接触する比較的小さな開口部（即ち、チャネルの一方又は両方の末端部）を提供し、それによって、覆われたチャネル１３０５から出た有効量の細胞抽出剤が液体の中に拡散するのを制限する及び／又は遅らせることができる。
マイクロチャンネル又は空洞を細胞抽出剤組成物で充填するように、マイクロ複製された表面及び／又は空洞を有する放出要素をコーティングすることができる。細胞抽出剤組成物は、液体、固体、半固体、又はこれらの任意の２つ以上の組み合わせであってよい。
いくつかの実施形態において、基材は、フィルタ、例えばグレード４の２０〜２５μｍの定性濾紙、グレード３０のガラス繊維濾紙、グレードＧＢ００５の厚い（１．５ｍｍ）吸収性の極めて高い吸い取り紙（すべてＷｈａｔｍａｎ，Ｉｎｃ（Ｆｌｏｒｈａｍ Ｐａｒｋ，ＮＪ）より入手）、Ｚｅｔａ Ｐｌｕｓ Ｖｉｒｏｓｏｒｂ １ＭＤＳディスク（ＣＵＮＯ，Ｉｎｃ，Ｍｅｒｉｄｅｎ，ＣＴ）、及び０．４５μｍのＭＦ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）などであることができる。上記基材のうちの任意の１つに、ポリビニルアルコールを含有する細胞抽出剤溶液を装填することができる。上記基材のうちの任意の１つに、ＶＡＮＴＯＣＩＬ（Ａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）を含有する細胞抽出剤溶液を装填することができる。上記基材のうちの任意の１つに、ＣＡＲＢＯＳＨＩＥＬＤ（Ｌｏｎｚａ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を含有する細胞抽出剤溶液を装填することができる。上記基材のうちの任意の１つに、５％塩化ベンザルコニウム溶液を含有する細胞抽出剤溶液を装填することができる。
いくつかの実施形態において、基材は、本明細書に記載されるような、細胞抽出剤を含むマトリックス材料でコーティングされることができる。いくつかの実施形態において、マトリックス材料（例えば、ポリマー材料又はセラミックなどの非ポリマー材料）は、液体（例えば、試料を含む水性液体）に実質的に不溶性であることができる。これに加えて、あるいは別の方法として、マトリックス材料は、有機溶媒に実質的に不溶性であることができる。いくつかの実施形態では、マトリックス材料は、周囲温度で試料を含む液体混合物（例えば、水溶液）に実質的に可溶性及び／又は分散性である賦形剤を含むことができる。いくつかの実施形態では、マトリックス材料は、周囲温度で水溶液に実質的に不溶性及び非分散性である賦形剤を含むことができる（即ち、賦形剤の溶解又は分散は、温度変化及び／又は化学的トリガの添加によって引き起こされることができる）。
いくつかの実施形態では、基材をコーティングするのに使用するマトリックス材料は、細胞抽出剤を含む予備形成されたマトリックス（例えば、ポリマーマトリックス）であることができる。いくつかの実施形態では、マトリックス前駆体と細胞抽出剤とを含む混合物が基材上にコーティングされ、マトリックスは、続いて、例えば、当該技術分野において既知の及び／又は本明細書に記載される重合プロセスを用いて、基材上に形成される。いくつかの実施形態では、予備形成されたマトリックスは、基材上にコーティングされるか又はマトリックスが基材上に形成された後、続いて、当該技術分野において既知の及び／又は本明細書に記載されるプロセスを用いて、細胞抽出剤が基材に装填される。
マトリックスは、本開示によると、賦形剤と混合された細胞抽出剤を含むことができる。「賦形剤」は、例えば、結合剤、流動促進剤（例えば、流動補助剤）、潤滑剤、崩壊剤、及び前述の任意の２つ以上を包含して広く用いられる。いくつかの実施形態では、コーティングされた基材は外側のコーティングを含むことができ、この外側のコーティングは、コーティングされた基材が液体（例えば、試料を含む水性液体）と接触した際の活性物質（例えば、細胞抽出剤）の放出に影響を与えることができる。いくつかの実施形態では、マトリックスは、充填剤（例えば、ラクトース又はソルビトールなどの糖）をマトリックスの増量剤として含むことができる。崩壊剤（例えば、デンプン又はセルロースなどの多糖類）は、マトリックスの湿潤及び／又は膨潤を促進し、それによって、マトリックスが液体と接触した際の活性物質の放出を容易にすることができる。ソルビトール及びマンニトールは、特定の細胞抽出剤（例えば、酵素）の安定性を促進することができる賦形剤である。マンニトールを、細胞抽出剤の放出を遅れさせるために使用することができる。いくつかの実施形態において、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、マトリックスからの活性物質の放出を制御するのに好ましい賦形剤である。いくつかの実施形態では、３３００及び８０００ダルトンの分子量を有するＰＥＧ化合物を使用して、マトリックスからの活性物質の放出を遅らせることができる。
いくつかの実施形態では、コーティング混合物は、コーティングプロセスを容易にするため、及び／又は基材に対するマトリックス材料の付着力を促進するために、添加剤（例えば、結合剤又は増粘剤）を含む。添加剤の非限定例としては、ガム（例えば、グアーガム、キサンタンガム、アルギン酸塩、カラギーナン、ペクチン、寒天、ジェラン）、多糖類（例えば、デンプン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アガロース）、及びポリペプチド（例えば、ゼラチン）が挙げられる。
マトリックス材料、細胞抽出剤、基材、及びコーティング添加剤は、試料中の細胞を検出するのに使用される検出系との適合性で選択される必要がある。この適合性は、１）検出系中の検体の量を検出する（例えば、ＰＣＴ国際公開特許ＷＯ ２０１０／１２９７２７の実施例６に記載されるように、ＡＴＰをルシフェリン及びルシフェラーゼと混合し、照度計で発光量を測定する）、２）マトリックス材料、細胞抽出剤、基材又はコーティング添加剤を用いた検出工程を繰り返す、３）工程１の結果と工程２の結果とを比較して、添加剤が反応中の検体の検出及び／又は測定を実質的に阻害したかどうかを判定することによって、試験されることができる。
いくつかの実施形態において、基材をコーティングするのに使用する材料は、本明細書に記載されるような、細胞抽出剤を含むシェル構造を含んでよい。特定のシェル構造と特定の検出系との適合性は、本明細書に記載されるように判定されることができる。
いくつかの実施形態において、コーティングされた基材は、バリア層を更に含んでよい。バリア層は、コーティングされた基材からの細胞抽出剤の放出を遅らせるための手段としての機能を果たすことができる。バリア層は、例えば、錠剤又はカプセル薬物からの活性成分の放出を制御する及び／又は遅れさせるための、当該技術分野において既知のもののような浸食性コーティングを包含する。バリア層はまた、物理的又は機械的操作によって崩壊し得る層（例えば、高温で崩壊し得るワックス層）も包含する。
いくつかの実施形態では、封入材料が圧力、剪断力、熱、光、ｐＨの変化、別の化学物質への曝露、イオン強度の変化等の活性化刺激に曝露された後、封入材料は、活性化されて、有効量の細胞抽出剤を放出してよい。活性化により、例えば、封入材料の溶解若しくは部分的な溶解、封入材料の透過化、及び／又は封入材料の離解若しくは部分的な離解（例えば、例えば微結晶ワックスなどの固形物を破砕又は融解することによる）を引き起こしてよい。
いくつかの実施形態において、放出要素は、細胞抽出剤を保持する及び／又は含む封入材料を含む。好適な封入材料は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ国際公開特許ＷＯ ２０１０／１２９７２８、発明の名称「ＡＲＴＩＣＬＥＳ ＷＩＴＨ ＳＨＥＬＬ ＳＴＲＵＣＴＵＲＥＳ ＩＮＣＬＵＤＩＮＧ Ａ ＣＥＬＬ ＥＸＴＲＡＣＴＡＮＴ ＡＮＤ ＢＩＯＤＥＴＥＣＴＩＯＮ ＭＥＴＨＯＤＳ ＴＨＥＲＥＯＦ」に記載されている。封入材料は、液体混合物（例えば、試料を含む水性混合物）の中への有効量の細胞抽出剤の即時溶解及び／又は分散を、所定の時間の間防止するための物理的バリア及び／又は拡散バリアとしての役割を果たすことができる。
いくつかの実施形態において、封入材料は、本明細書に記載されるようなマトリックス材料を含むことができる。
いくつかの実施形態では、封入材料が圧力、剪断力、熱、光、ｐＨの変化、別の化学物質への曝露、イオン強度の変化等の活性化刺激に曝露された後、封入材料は、活性化されて、有効量の細胞抽出剤を放出してよい。活性化により、例えば、封入材料の溶解若しくは部分的な溶解、封入材料の透過化（例えば、脂質二重層の破壊）、及び／又は封入材料の離解若しくは部分的な離解（例えば、例えば微結晶ワックスなどの固形物を破砕又は融解することによる）を引き起こしてよい。
いくつかの実施形態において、放出要素は、シェル構造を形成する。図１４は、本開示による放出要素１４４０の実施形態を示す。放出要素１４４０は、シェル構造１４０１とコア１４０４とを有する。コア１４０４の中に位置決めされているのは、ゲスト化合物１４０５（例えば、本明細書に記載されるような細胞抽出剤）である。コア１４０４は、液体、固体、半固体又はこれらの組み合わせを含むことができる。ゲスト化合物１４０５は、その中に溶解及び／又は分散されてよい。
いくつかの実施形態において、放出要素のシェル構造は、細胞抽出剤を含むことができる。図１５は、本開示による放出要素１５４０の実施形態を示す。放出要素１５４０は、ゲスト化合物１５０５（例えば、本明細書に記載されるような細胞抽出剤）を含むシェル構造１５０１を有する。放出要素１５４０は、液体、固体、半固体、又はこれらの組み合わせを含むことができるコア１５０４を更に含む。
いくつかの実施形態において、放出要素は、２つ以上のゲスト分子を含むことができる。図１６は、本開示による複合体放出要素１６４０の実施形態を示す。複合体放出要素１６４０は、第１のゲスト分子１６０６を含むシェル構造１６０２と、第２のゲスト分子１６０５を含むコア１６０４とを有する。いくつかの実施形態において、第１及び第２のゲスト化合物（それぞれ１６０４及び１６０５）は、同じ化合物であることができる。いくつかの実施形態において、第１及び第２のゲスト化合物（それぞれ１６０６及び１６０５）は、異なる化合物であることができる。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのゲスト化合物は、細胞抽出剤であることができる。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのゲスト化合物は、本明細書に記載されるような検出試薬であることができる。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのゲスト化合物は、細胞抽出剤であることができ、少なくとも１つのゲスト化合物は、検出試薬であることができる。
いくつかの実施形態において、放出要素は、２つ以上のシェル構造を含むことができる。図１７は、第１のシェル構造１７０１と、第２のシェル構造１７０２と、第３のシェル構造１７０３とを含む放出要素１７４０の実施形態を示す（放出要素１７４０のコアは、この図示せず）。この実施形態では、第２のシェル構造１７０２は、第１のゲスト化合物１７０５を含み、第３のシェル構造１７０３は、第２のゲスト化合物１７０６を含む。この実施形態では、それぞれの連続したシェル構造は、タマネギのような様式で次のシェル構造によって封入される。いくつかの実施形態において、第１及び第２のゲスト化合物（それぞれ１７０５及び１７０６）は、同じ化合物であることができる。いくつかの実施形態において、第１及び第２のゲスト化合物（それぞれ１７０５及び１７０６）は、異なる化合物であることができる。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのゲスト化合物は、細胞抽出剤であることができる。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのゲスト化合物は、本明細書に記載されるような検出試薬であることができる。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのゲスト化合物は細胞抽出剤であることができ、少なくとも１つのゲスト化合物は、検出試薬であることができる。
図１８は、２つ以上のシェル構造を含む放出要素１８４０の代替実施形態を示す。放出要素１８４０は、第１のシェル構造１８０１と、第２のシェル構造１８０２と、第３のシェル構造１８０３とを有する。第２のシェル構造１８０２は、第１のゲスト化合物１８０５を含み、第３のシェル構造は、第２のゲスト化合物１８０６を含む。この実施形態では、第２のシェル構造１８０２及び第３のシェル構造１８０３の両方が、第１のシェル構造１８０１によって封入されている。いくつかの実施形態において、第１及び第２のゲスト化合物（それぞれ１８０５及び１８０６）は、同じ化合物であることができる。いくつかの実施形態において、第１及び第２のゲスト化合物（それぞれ１８０５及び１８０６）は、異なる化合物であることができる。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのゲスト化合物は、細胞抽出剤であることができる。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのゲスト化合物は、本明細書に記載されるような検出試薬であることができる。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのゲスト化合物は、細胞抽出剤であり、少なくとも１つのゲスト化合物は、検出試薬であることができる。
本開示の好適なシェル構造としては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第７，４８５，６０９号に記載されているような、例えば、セルロース、セルロース誘導体（例えば、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、セルローストリアセテート、セルロースアセテートフタレート、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、及びヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート）；アクリレートのポリマー若しくはコポリマー、又はアクリレート誘導体のコポリマー（例えば、ポリアクリレート、ポリメチルアクリレート、ポリ（ポリアクリレート−メタクリレート）、ポリ（メタクリレート−メチルメタクリレート）、ポリエチルアクリレート−メチルメタクリレート、ポリ（エチルアクリレート−メチルメタクリレート−トリメチルアンモニオエチルメタクリレートクロリド）、及びポリ（エチルアクリレート−メチルメタクリレート−トリメチルアンモニオエチルメタクリレートクロリド））；タンパク質（例えば、アルブミン、ゼラチン、ゼイン、カゼイン、コラーゲン、及びフィブリノゲン）；ビニルポリマー（例えば、ポリ塩化ビニル、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリスチレン、及びポリアクリロニトリル）；ガム（例えば、グアーガム、アラビアガム、キサンタンガム、ローカストビーンガム）；天然又は加工デンプン；デキストリン；デキストラン；キトサン；アルギン酸塩；並びに前述の任意の２つ以上の組み合わせを含むポリマーシェルが挙げられる。
これに加えて又は代わりに、本開示の好適なシェル構造は、クロモニック物質を含むシェル構造を包含する。好適なクロモニック物質としては、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第７，８２４，７３２号に記載されているようなシェル層を形成するものが挙げられる。
クロモニック物質からなるシェル層は、ゲスト化合物（例えば、細胞抽出剤）の封入及び制御放出のために、特に有用であることができる。例えば、細胞抽出剤は、米国特許第７，８２４，７３２号に記載のクロモニックナノ粒子の中に封入されることができる。クロモニックスは、細胞抽出剤を特定の環境条件から保護した後、細胞抽出剤を他の環境条件下で制御可能に送達することができる。しかしながら、クロモニック物質と、多価カチオンと、ＨＣＯ３ −、ＰＯ４ ３−、ＣＨ３ＣＨＯＨＣＯＯ−、Ｃ３Ｈ５Ｏ（ＣＯＯ）３ ３−、ＢＯ３ ３−、及びＳＯ４ ２−からなる群から選択される酸性アニオンとを含む複合体を含むシェル（「複合シェル」）は、クロモニックス単独と比較して、特定の環境条件からの保護の増大を提供することが可能である。
クロモニック物質の１つ以上のシェル層の中に封入されたクロモニックナノ粒子を含む多層クロモニック構造は、当該技術分野において既知である。細胞抽出剤は、クロモニックナノ粒子の中に、及び／又は、ナノ粒子を封入している１つ以上のクロモニックシェル層の中に封入されることができる。複合シェルは、１つ以上のクロモニックシェル層と組み合わされて使用されることができる（例えば、複合シェルは、最も内側のシェル層、中間のシェル層、最も外側のシェル層、又はこれらの任意の組み合わせであることができる）。複合シェル層は、細胞抽出剤の制御放出に増大した柔軟性を提供することができる（例えば、徐放）。
本開示によるシェル層はまた、細胞抽出剤を実質的に包囲するワックス構造（例えば、カプセル）を包含する。いくつかの実施形態において、細胞抽出剤の概ね一体型の塊（例えば液体、固体、粒子などの複数の固体、半固体、又はこれらの組み合わせ）は、外側のワックスシェル内部に配置されることができる。ワックスが崩壊すると（例えば、熱融解又は機械的破砕によって）、細胞抽出剤は、ワックスから放出される。好適なワックスとしては、石蝋、微結晶ワックス、並びにこれらの誘導体及び／又は組み合わせが挙げられる。
本開示によるシェル層はまた、脂質二重層（例えば、リポソーム）を包含する。リポソームは、当該技術分野において既知のリポソーム形成技術によって形成されることができる。リポソームは、細胞抽出剤の少なくとも一部がリポソームのコアに閉じ込められるように、細胞抽出剤を含有する溶液から形成されることができる。任意のタイプの脂質二重層を分裂させる可能性のある細胞抽出剤を含むことができる他の種類の放出要素とは大きく異なり、リポソーム放出要素は、リポソームの脂質二重層の一体性を実質的に損なわない細胞抽出剤を含有することができる。このような細胞抽出剤の非限定例としては、リゾチーム及びリソスタフィンなどのポリペプチド、及びリポソームを実質的に損なわない抗生物質が挙げられる。
リポソームが液体（例えば、試料を含有する水性液体）と接触すると、細胞抽出剤は、例えば、脂質二重層を通る拡散によってリポソームから放出されてよい。いくつかの実施形態では、リポソームの全内容物（例えば、細胞抽出剤溶液）は、熱又は機械的エネルギー（例えば、熱、凍結融解、又は音波破砕）を用いて脂質二重層の一体性を分裂させる放出因子で、あるいは脂質二重層を透過性にする及び／又は可溶化するための化学物質放出因子を添加することにより、「破裂」して放出されてもよい。いくつかの実施形態では、リポソームの破壊は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ国際公開特許ＷＯ ２００９／１０２８５９、発明の名称「ＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥＳ ＦＯＲ ＭＩＣＲＯＢＩＡＬ ＤＥＴＥＣＴＩＯＮ」に記載のように、細胞溶解性ペプチドを使用して引き起こされることができる。
いくつかの実施形態では、本開示の放出要素は、基材上にコーティングされた細胞抽出剤を含むシェル構造を包含することができる。
細胞抽出剤：
いくつかの実施形態において、化学的細胞抽出剤には、タンパク質（例えば、細胞溶解性ペプチド及び酵素）などの生化学物質が含まれる。いくつかの実施形態において、細胞抽出剤は、細胞の浸透性を高め、これにより細胞内部からの生物学的検体の放出を起こす。いくつかの実施形態において、細胞抽出剤は、細胞の溶解（例えば破裂又は部分的破裂）を起こすか又は促進することができる。
いくつかの実施形態において、細胞抽出剤には、当該技術分野において既知の化学物質及び化学物質混合物が挙げられ、例えば、界面活性剤及び第四級アミン、ビグアニド、界面活性剤、フェノール類、細胞溶解性ペプチド、並びに酵素が挙げられる。典型的には、細胞抽出剤は、放出要素に（共有的又は非共有的のいずれかで）強く結合せず、放出要素が水性液体と接触すると、放出要素から放出されることができる。
界面活性剤は、一般に、親水基及び疎水基の両方を含有する。放出要素は、アニオン性、非イオン性、カチオン性、両性、両性及び双極イオン性界面活性剤並びにこれらの混合物から選択される１種以上の界面活性剤を含有してよい。水中で解離し、カチオン及びアニオンを放出する界面活性剤は、イオン性と称される。存在する場合には、両性、両性及び双極性界面活性剤は、一般に、１つ以上のアニオン性及び／又は非イオン性界面活性剤と組み合わせて使用される。好適な界面活性剤及び第四級アミンの非限定的な例には、ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０（ＮＰ−４０）、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ、サルコシル、Ｔｗｅｅｎ、ＳＤＳ、Ｉｇｅｐａｌ、サポニン、ＣＨＡＰＳＯ、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、「セトリミド」（ドデシル−、テトラデシル−、及びヘキサデシル−トリメチルアンモニウムブロミドの混合物）、塩化セチルピリジウム、メタ（アクリルアミドアルキルトリメチルアンモニウム塩（例えば、３−メタクリルアミドプロピルトリメチルアンモニウムクロリド、及び３−アクリルアミドプロピルトリメチルアンモニウムクロリド）、並びに（メタ）アクリロキシアルキルトリメチルアンモニウム塩（例えば、２−アクリロキシエチルトリメチルアンモニウムクロリド、２−メタクリロキシエチルトリメチルアンモニウムクロリド、３−メタクリロキシ−２−ヒドロキシプロピルトリメチルアンモニウムクロリド、３−アクリロキシ−２−ヒドロキシプロピルトリメチルアンモニウムクロリド、及び２−アクリロキシエチルトリメチルアンモニウムメチル硫酸塩）が挙げられる。他の好適なモノマーの第四級アミノ塩には、ジメチルアルキルアンモニウム基として、アルキル基が２〜２２個の炭素原子又は２〜２０個の炭素原子を有するものが挙げられる。即ち、モノマーは、式：
−Ｎ（ＣＨ３）２（ＣｎＨ２ｎ＋１）＋の基を含む（式中、ｎは、２〜２２の値の整数である）。代表的なモノマーには、以下の式のモノマーが挙げられるが、これらに限定されない。
式中、ｎは、２〜２２の範囲の整数である。
好適なビグアニド（ビス−ビグアニドを含む）の非限定的な例には、ポリヘキサメチレンビグアニド塩酸塩、ｐ−クロロフェニルビグアニド、４−クロロ−ベンズヒドリルビグアニド、アレキシジン、ハロゲン化ヘキシジン（例えばクロルヘキシジン（１，１’−ヘキサメチレン−ビス−５−（４−クロロフェニルビグアニド）を含むがこれに限定されない）、及びこれらの塩が挙げられる。
好適なフェノール類の非限定的な例には、フェノール、サリチル酸、２−フェニルフェノール、４−ｔ−アミルフェノール、クロロキシレノール、ヘキサクロロフェン、４−クロロ−３，５−ジメチルフェノール（ＰＣＭＸ）、２−ベンジル−４−クロロフェノール、トリクロサン、ブチル化ヒドロキシトルエン、２−イソプロピル−５−メチルフェノール、４−ノニルフェノール、キシレノール、ビスフェノールＡ、オルトフェニルフェノール、並びにフェノチアジン類（クロルプロマジン、プロクロルペラジン、及びチオリジジンなど）が挙げられる。
好適な細胞溶解性ペプチドの非限定例には、Ａ−２３１８７（カルシウムイオノフォア）、デルマセプチン、リステリオリシン、レナレキシン、アエロリシン、デルマトキシン、マクラチン、ラナテウリン、アンホテリシンＢ、動物毒液由来の直接溶解因子、マガイニン、ルゴシン、アスカフィン、ジフテリア毒素、マキシミン、サポニン、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属溶血素、ジスチンクチン、メリチン、黄色ブドウ球菌毒素（α、β、χ、δ）、アラメシチン、エスクレチン、メトリジオリシン、ストレプトリシンＯ、アポリポタンパク質、フィリピン、ニゲリシン、ストレプトリシンＳ、ＡＴＰトランスロカーゼ、ガエグリン、ナイスタチン、シネキシン、ボンビニン、ＧＡＬＡ、オセラチン、スルファクチン、ブレビニン、グラミシジン、Ｐ２５、ツブリン、ブフォリン、らせん構造赤血球溶解ペプチド、パルストリン、バリノマイシン、カエリン、溶血素、ホスホリパーゼ、ビブリオリシン、セレオリシン、イオノマイシン、フィロキシン、コリシン、ＫＡＬＡ、ポリエン抗生物質、デルマジスチンクチン、ＬＡＧＡ、ポリミキシンＢが挙げられる。
好適な酵素の非限定的な例には、リゾチーム、リソスタフィン、バクテリオファージ溶解素、アクロモペプチダーゼ、ラビアーゼ、ムタノリジン、ストレプトリジン、テタノリジン、ａ−ヘモリジン、リチカーゼ、菌類由来の溶解酵素、セルラーゼ、ペクチナーゼ、Ｄｒｉｓｅｌａｓｅ（登録商標）、Ｖｉｓｃｏｚｙｍｅ（登録商標）Ｌ、ペクトリアーゼが挙げられる。
放出要素がヒドロゲルであるいくつかの実施形態では、ヒドロゲルが形成される前駆体組成物は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ＷＯ ２００７／１４６７２２に記載されているようなアニオン性又はカチオン性モノマーを含有することができる。アニオン性又はカチオン性モノマーは、ヒドロゲルに組み込まれ、それ自体は細胞抽出剤活性を保持することができる。いくつかの実施形態において、アニオン性又はカチオン性モノマーは、ヒドロゲルの表面に架橋されることができる。ヒドロゲルのビーズ又は繊維をカチオン性モノマーの溶液に短時間浸してからすぐに取り出し、化学線（例えば、紫外線、電子線）を使用して架橋させることができる。これにより、カチオン性モノマーが、ヒドロゲルのビーズ又は繊維の外表面に化学的に結合する。
いくつかの実施形態において、細胞抽出剤の様々な組み合わせが、前駆体組成物（これからヒドロゲルが合成される）中、又はソルビン酸塩（ヒドロゲルの合成後にヒドロゲル内に装填される）中に使用できる。前駆体組成物又はその結果として生じるヒドロゲルと相溶する任意の他の既知の細胞抽出剤を用いることができる。これらのものとしては、クロルヘキシジン塩、例えば、グルコン酸クロルヘキシジン（ＣＨＧ）、パラクロロメタキシレノール（ＰＣＭＸ）、トリクロサン、ヘキサクロロフェン、グリセリン及びプロピレングリコールの脂肪酸モノエステル及びモノエーテル、例えばモノラウリン酸グリセロール、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）、モノカプリル酸グリセロール、モノカプリン酸グリセロール、モノラウリン酸プロピレングリコール、モノカプリル酸プロピレングリコール、モノカプリン酸プロピレングリコール、（Ｃ１２〜Ｃ２２）疎水性物質及び四級アンモニウム基又はプロトン化三級アミノ基を含むフェノール類、界面活性剤及びポリマー、四級シラン及びポリ四級アミンのような四級アミノ含有化合物、例えばポリヘキサメチレンビグアニド、遷移金属イオン、例えば銅含有化合物、亜鉛含有化合物、及び銀含有化合物、例えば金属銀、銀塩、例えば塩化銀、酸化銀、及びスルファジアジン銀、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベン、オクテニデン、２−ブロモ−２−ニトロプロパン−１，３ジオール、又は上記の任意の２つ以上の混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
好適な細胞抽出剤には、ジアルキルアンモニウム塩（Ｎ−（ｎ−ドデシル）−ジエタノールアミンなど）；カチオン性エトキシル化アミン（「Ｇｅｎａｍｉｎｏｘ Ｋ−１０」、Ｇｅｎａｍｉｎｏｘ Ｋ−１２、「Ｇｅｎａｍｉｎ ＴＣＬ０３０」、及び「Ｇｅｎａｍｉｎ Ｃ１００」など）；アミジン（プロパミジン及びジブロモプロパミジンなど）；ペプチド抗生物質（ポリミキシンＢ及びナイシンなど）；ポリエン抗生物質（ナイスタチン、アンホテリシンＢ、及びナタマイシンなど）；イミダゾール類（エコナゾール、クロトラミゾール及びミコナゾールなど）；酸化剤（安定な形態の塩素及びヨウ素など）；並びに米国特許第７，４２２，８６８号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記述されている細胞抽出剤が更に挙げられる。
細胞抽出剤は、本発明の検出系（例えば、ルシフェラーゼ酵素などの検出試薬）を不活性化しないよう選択されるのが好ましい。強い細胞抽出剤（例えば、イオン性洗剤など）を必要とする微生物については、改善された検出系（例えば、これら試薬の存在下で強化された安定性を示すルシフェラーゼなどで、これらは米国特許出願第２００３／０１０４５０７号に開示されているものが挙げられ、この全体が参照により本明細書に組み込まれる）が特に好ましい。
本発明の方法は、放出要素から有効量の細胞抽出剤を放出させることにより、生きた細胞からの生物学的検体の放出を引き起こす。本開示には、当該技術分野において既知のさまざまな細胞抽出剤が含まれ、これらそれぞれは、放出要素から異なる速度で放出されてよく、かつ他とは異なる濃度で生きた細胞に対して影響を及ぼしてよい。以下は、細胞抽出剤の選択、及び放出要素中に含める有効量の決定の際に、考慮すべき要素に関するガイダンスを提供する。
いずれの細胞抽出剤の有効性も、濃度及び曝露時間という主に２つの要素によって決定されることは、当該技術分野において既知である。即ち、一般に、細胞抽出剤の濃度が高いほど、生きた細胞にもたらす効果（例えば、細胞膜の浸透化及び／又は細胞からの生物学的検体の放出）は大きくなる。また、任意の所定の濃度の細胞抽出剤において、一般に、細胞抽出剤に生きた細胞をさらす時間が長いほど、細胞抽出剤の効果は大きくなる。他の付帯的な要素（例えば、ｐＨ、共溶媒、イオン強度、及び温度）は、特定の細胞抽出剤の有効性に影響を与えることが当該技術分野において既知である。これらの付帯的要素は、例えば、温度制御器、緩衝液、試料調製などによって制御できることが知られている。これらの要素並びに細胞抽出剤はまた、生物学的検体の検出に使用される検出系に対して影響を与えることもできる。いくつかの単純な実験を実施することによって、本開示の物品を生成し、本開示の方法を実行するのに有効な量の細胞抽出剤を決定することは、当業者の把握する領域内である。
細胞及び／又は検出系に対する、様々な濃度の細胞抽出剤の効果を判定するための初期実験を実施することができる。最初に、候補放出要素を、生物学的検体の検出系に与える影響に関してスクリーニングすることができる。例えば、本明細書に記載されるように放出要素に細胞抽出剤を注入することができる。続いて、細胞抽出剤を含む放出要素を（細菌性細胞なしに）ＡＴＰアッセイに入れることができる。このアッセイを試薬等級ＡＴＰ溶液（例えば約０．１〜約１００ピコモルのＡＴＰ）で実行することができ、放出要素をともなう試料中のルシフェラーゼ反応によって発光する生物発光量を、放出要素のない試料によって発光する生物発光量と比較することができる。好ましくは、放出要素を有する試料中の生物発光量は、放出要素を有さない試料中の生物発光量の５０％超過である。好ましくは、放出要素を有する試料中の生物発光量は、放出要素を有さない試料中の生物発光量の９０％超過である。最も好ましくは、放出要素を有する試料中の生物発光量は、放出要素を有さない試料中の生物発光量の９５％超過である。
加えて、細胞からの生物学的検体の放出に細胞抽出剤が与える影響を、ＰＣＴ国際公開特許ＷＯ ２０１０／１２９７２６の実施例２１に記載されているのと同様に、実験的に判定することができる。例えば、細胞（例えば、黄色ブドウ球菌などの微生物細胞）の懸濁液を、比較的幅広い範囲の濃度の細胞抽出剤（例えば、ＢＡＲＤＡＣ ２０５Ｍ）に、検出系の存在下で、一定時間（例えば数分以内）さらすことにより、細胞からの生物学的検体を検出することができる（例えば、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、及びｐＨ約７．６〜７．８の緩衝液を含むＡＴＰ検出系）。この生物学的検体を定期的に測定し、第一測定は通常、細胞抽出剤を混合液に加えた直後に行い、これにより、細胞からの生物学的検体（この例では、ＡＴＰ）の放出が検出できるかどうかを調べることができる。この結果は、その細胞から放出される生物学的検体を検出するための最適条件（即ち、細胞抽出剤の液体濃度及び曝露時間）を示すことができる。ＰＣＴ国際公開特許ＷＯ ２０１０／１２９７２６の表２６に示されるように、この結果は、より高濃度の細胞抽出剤では、細胞抽出剤は、生物学的検体（例えば、ＡＴＰ）の放出において効果が弱い可能性がある、及び／又は検出系に干渉する可能性がある（即ち、検出試薬によって生成された光又は色を吸収する可能性がある）ことも示すことができる。
液体混合物中の有効量の細胞抽出剤を決定した後、本明細書に記述されている方法によって放出要素に組み込む細胞抽出剤の量を考慮すべきである。放出要素が液体混合物（例えば、水性懸濁液中の試料）と接触すると、細胞抽出剤は放出要素から放出されることができ（例えば、拡散により）、液体混合物中の細胞抽出剤の濃度は、平衡に達するまで増加する。理論に束縛されるものではないが、平衡に達するまで、細胞抽出剤の濃度勾配が液体中に存在し、放出要素の近くにある液体部分ではより高濃度の抽出剤が存在すると推定できる。細胞抽出剤の濃度が、細胞を含む液体部分で有効濃度に達すると、細胞は生物学的検体を放出する。放出された生物学的検体は、ここで、検出系によって検出することができるようになる。
試料を含む液体中で細胞抽出剤を有効濃度にするのは、いくつかの要素によって制御することができる。例えば、放出要素に搭載された細胞抽出剤の量は、平衡に達した液体中での細胞抽出剤の最終濃度に影響を与える。加えて、液体混合物中の放出要素の量、及びいくつかの実施形態では、放出要素の表面積の量は、放出要素からの細胞抽出剤の放出速度、及び平衡に達した液体中の細胞抽出剤の最終濃度に影響を与えることができる。更に、水性媒体の温度は、放出要素が細胞抽出剤を放出する速度に影響を与えることができる。他の要素、例えば細胞抽出剤及び放出要素のイオン特性及び／又は疎水性特性が、放出要素から放出される細胞抽出剤の量、及び細胞抽出剤が放出要素から放出される速度に影響を与えることができる。これらの要素のすべてを、試料中の細胞の検出のために、望ましいパラメータ（例えば、その物品の製造時の検討事項及びその方法の結果を得るまでの時間など）を達成するよう、当業者が定期的に実験を行うことにより最適化することができる。一般に、細胞抽出剤が放出要素と試料物質を含む液体の容積との間の平衡に達したときに、有効量（放出要素のない細胞抽出剤を使用した実験により決定される）を達成するのに少なくとも充分な細胞抽出剤を、放出要素に組み込むのが望ましい。放出要素が有効量の細胞抽出剤を放出するのに要する時間を短くするために、（放出要素のない細胞抽出剤を使用した実験により決定された量よりも）多くの量の細胞抽出剤を放出要素に加えるのが望ましいことがある。
放出要素がマトリックスを含むいくつかの実施形態では、細胞抽出剤は、マトリックスの中に拡散する、マトリックスから外へ拡散する、又はその両方であることができる。拡散速度は、例えば、マトリックス材料及び／又は架橋密度を変えること、マトリックスが作製される極性溶媒を変えること、マトリックスが作製される極性溶媒中の細胞抽出剤の溶解度を変えること、及び／又は細胞抽出剤の分子量を変えることによって、制御可能であるべきである。拡散速度はまた、マトリックスの形状、サイズ、及び表面トポグラフィーを変えることによっても改善することができる。
理論に束縛されるものではないが、放出要素からの細胞抽出剤の移動は、放出要素と液体（例えば、試料を含む水性液体）が接触した際に、自然発生的に（例えば、拡散によって）起こることができると考えられている。いくつかの実施形態において、細胞抽出剤の放出要素からの移動は、促進されることができる。
いくつかの実施形態では、細胞抽出剤の放出要素からの移動は、化学的促進剤を提供することによって促進される。化学的促進剤は、例えば、酸又は塩基であることができる。混合物のｐＨを変化させることにより、放出要素と細胞抽出剤との間のイオン相互作用を妨げ、それによって放出要素からの細胞抽出剤の移動を促進してよい。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ国際公開特許ＷＯ２００５／０９４７９２、発明の名称「ＡＮＩＯＮＩＣ ＨＹＤＲＯＧＥＬ ＭＡＴＲＩＣＥＳ ＷＩＴＨ ＰＨ ＤＥＰＥＮＤＥＮＴ ＭＯＤＩＦＩＥＤ ＲＥＬＥＡＳＥ ＡＳ ＤＲＵＧ ＣＡＲＲＩＥＲＳ」は、薬物又は殺菌剤がｐＨ依存的に調整されて放出されるヒドロゲル組成物を開示している。いくつかの実施形態では、細胞抽出剤の移動は、（例えば、塩を添加又は除去することによって）液体のイオン強度を変化させることで促進されることができる。
いくつかの実施形態では、放出要素からの細胞抽出剤の移動は、機械的処理によって促進される。好適な機械的処理の非限定例には、放出要素を振動させる、撹拌する、又は圧縮することを含む。
放出要素は、液体試料材料と静的に接触させるか、動的に接触させる（即ち、例えば振動、攪拌、エアレーション又は圧縮によって混合）か、あるいはこれらの組み合わせで接触させることができる。ＰＣＴ国際公開特許ＷＯ ２０１０／１２９７２６の実施例１６は、混合することで、有効量の細胞抽出剤の放出要素からのより迅速な放出を引き起こすことができることを示している。ＰＣＴ国際公開特許ＷＯ ２０１０／１２９７２６の実施例１７は、放出要素を圧縮することにより、いくつかの実施形態で、有効量の細胞抽出剤の放出要素からのより迅速な放出をもたらすことができることを示している。放出要素を圧縮することは、例えば、放出要素を表面に押し付けること及び／又放出要素を圧壊することを包含することができる。したがって、いくつかの実施形態において、混合することにより、細胞抽出剤のより迅速な放出を有利にもたらし、これにより試料中の生物学的検体（例えば、生きた細胞から）のより迅速な検出をたらすことができる。いくつかの実施形態において、放出要素の圧縮（例えば、スワブ若しくはスパチュラ、キャリア（後述）、又は他の好適な用具などの試料取得装置を使用して放出要素に対し圧力を加えることによって）により、細胞抽出剤のより迅速な放出を有利にもたらし、これにより試料中の生物学的検体のより迅速な検出をもたらすことができる。加えて、放出要素圧縮の工程は、操作者に便利な時点で細胞抽出剤の放出を加速させるために行うことができる。
いくつかの実施形態において、静的な接触は、有効量の細胞抽出剤放出を遅らせることがあるため、生物学的検体の検出の前に、操作者が他の処理（例えば試薬の追加、装置の較正、及び／又は検体の輸送など）を実施するための追加の時間を提供することができる。いくつかの実施形態において、最初の生物学的検体測定が行われるまでは、混合物を静的に保持し、それから、有効量の細胞抽出剤放出に必要な時間を短縮するために動的に試料を混合することが有利な場合がある。
本発明の方法において機能的な最も好ましい濃度又は濃度範囲は、異なる微生物及び異なる細胞抽出剤によって異なり、本明細書に記述されている方法、又は当業者に周知の方法を用いて経験的に決定され得ることが、充分に予測される。
試料及び試料取得装置：
本開示の物品及び方法は、試料中の生物学的検体の検出法を提供する。いくつかの実施形態では、本物品及び方法は、試料中の生きた細胞からの生物学的検体の検出法を提供する。特定の実施形態では、本物品及び方法は、試料中の生きた微生物細胞の検出法を提供する。特定の好ましい実施形態では、本物品及び方法は、試料中の生きた細菌細胞の検出法を提供する。
本明細書で使用する用語「試料」は、その最も広い意味で使用される。試料は、本発明を用いて分析される生物学的検体（例えば、ＡＴＰ）を含む可能性のある組成物である。生物学的検体は、試料中の細胞（例えば、細菌）内に存在してよい。更に多くの場合、試料は、（任意に培地中の）細胞又は細胞集団、あるいは細胞可溶化物を含むことが知られている又は含むことが疑われる。試料はまた、表面に吸着細胞又は細胞集団を有してよい固体表面（例えば、スワブ、膜、フィルタ、粒子）であってもよい。こうした固体試料では、本発明に基づく細胞濃縮剤と混合することが可能な液体（例えば、水溶液）と固体を接触させることによって水性試料を調製することが考えられる。
好適な試料としては、固体物質（例えば、粒子、フィルタ）、半固体物質（例えば、ゲル、固体の懸濁液、又はスラリー）、液体、又はこれらの組み合わせが挙げられる。好適な試料としては、固体、液体、又はこれらの組み合わせを含む表面残留物が更に挙げられる。表面残留物の非限定的な例としては、環境表面（例えば、床、壁、天井、媒介物、機器、水、及び水容器、エアフィルタ）、食品表面（例えば、野菜、果物、及び肉の表面）、食品加工表面（例えば、食品加工装置及びまな板）、並びに臨床表面（例えば、組織試料、皮膚、及び粘膜）からの残留物が挙げられる。試料にはまた、原油若しくは粗精製油、ガソリン、又は塗料などの混合物を含むことができる。
生物学的検体の検出のための試料物質（表面残留物を含む）の採取法は、当該技術分野では周知である。ピペット、スパチュラ、スポンジ、スワブなどを含むそれぞれの種の試料取得装置がこれまでに述べられており、本発明の方法において使用することができる。
細胞濃縮剤：
本開示の方法では、液体試料中に存在する細胞と結合する細胞濃縮剤を使用する。細胞濃縮剤を液体試料と所定の時間接触させる。細胞は、共有結合又は非共有結合（例えば、疎水性又はイオン性相互作用）によって、あるいは共有結合と非共有結合との組み合わせによって細胞濃縮剤と結合することができる。細胞が細胞濃縮剤と結合した後、例えば、沈降、凝集、遠心、濾過、又はこれらの任意の組み合わせによって細胞濃縮剤を液体試料から除去することができる。
「細胞濃縮剤」とは、液体に懸濁可能であることによって液体中に存在する微生物を捕捉かつ保持することができる物質（例えば、粒子、繊維）を含む広い意味で使用される。細胞濃縮剤は、濾過処理によって回収することができるが、微生物を捕捉するうえで必ずしも濾過処理を必要としない。
特定の細胞濃縮剤が当該技術分野において知られており、本開示の方法における使用に適している。好適な細胞濃縮剤の非限定的な例としては、ヒドロキシアパタイト（Ｂｅｒｒｙら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．；６３：４０６９〜４０７４；１９９７）、磁気ビーズ（Ｏｓｔｅｒら、Ｊ．Ｍａｇｎｅｔｉｓｍ ａｎｄ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｍａｔ．；２２５：１４５〜１５０；２００１）、フェリ磁性鉱物、マグネタイト、キトサン、及び親和性支持物質が挙げられる。試料から微生物を捕捉又は濃縮するための固定化金属支持物質を含む組成物の使用は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１０／００６２４２１号、発明の名称「ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ，ＭＥＴＨＯＤＳ，ＡＮＤ ＤＥＶＩＣＥＳ ＦＯＲ ＩＳＯＬＡＴＩＮＧ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＭＡＴＥＲＩＡＬＳ」に記載されている。
濃縮剤の例示的な種類の１つとしては、珪藻土及び表面処理した珪藻土が挙げられる。こうした濃縮剤の具体例は、その開示内容が参照により本明細書に組み込まれる、同一出願人による米国特許出願公開第２０１０／０２０９９６１号、発明の名称「ＭＩＣＲＯＯＲＧＡＮＩＳＭＳ ＣＯＮＣＥＮＴＲＡＴＩＯＮ ＰＲＯＣＥＳＳ ＡＮＤ ＡＧＥＮＴ」に見出すことができる。無機材料は、水系に分散又は懸濁されると、その物質及び水系のｐＨに特徴的な表面電荷を示す。物質−水の界面の両側の電位は「ゼータ電位」と呼ばれ、電気泳動における移動度から（即ち、水系中に置かれた帯電電極間を物質の粒子が移動する速度から）計算することができる。一実施形態では、濃縮剤は、非処理の珪藻土のゼータ電位よりも少なくともある程度正のゼータ電位を有してよく、こうした濃縮剤は、その表面が一般的に負に帯電する傾向を有する細菌などの微生物を濃縮するうえで非処理の珪藻土と比較して驚くほど顕著に効果的となりうる。
濃縮剤の代表的な種類の１つとして珪藻土がある。濃縮剤の別の代表的な種類として、表面処理した珪藻土がある。代表的な表面処理としては、二酸化チタンなどの表面改質剤、微細なナノスケールの金若しくは白金、又はこれらの組み合わせがある。こうした表面処理は、微生物を濃縮するうえで非処理の珪藻土と比較して驚くほど顕著に効果的となり得る。表面処理としてはまた、酸化第二鉄、酸化亜鉛、酸化アルミニウム、及びこれらに類するもの、並びにこれらの組み合わせから選択される金属酸化物が挙げられる。一実施形態では、酸化第二鉄が使用される。金などの貴金属は抗微生物特性を示すことが知られているが、金含有濃縮剤は、微生物を結合するうえで有効であるばかりでなく、検出又はアッセイ用に微生物を生存状態に維持するうえでも有効である。
有用な表面改質剤としては、微細なナノスケールの金、微細なナノスケールの白金、少なくとも１つの金属酸化物（例えば、二酸化チタン、酸化第二鉄、又はこれらの組み合わせ）と組み合わせた微細なナノスケール金、二酸化チタン、少なくとも１つの他の（即ち、二酸化チタン以外）金属酸化物と組み合わせた二酸化チタン、及びこれらに類するもの、並びにこれらの組み合わせが挙げられる。一実施形態では、微細なナノスケール金、微細なナノスケール白金、少なくとも酸化第二鉄若しくは二酸化チタンと組み合わせた微細なナノスケール金、二酸化チタン、少なくとも酸化第二鉄と組み合わせた二酸化チタン、又はこれらの組み合わせのような表面改質剤を使用することができる。
一実施形態では、以下のような表面改質剤を使用することができる：微細なナノスケール金、微細なナノスケール白金、酸化第二鉄又は二酸化チタンと組み合わせた微細なナノスケール金、二酸化チタン、酸化第二鉄と組み合わせた二酸化チタン、及びこれらの組み合わせ。一実施形態では、微細なナノスケール金、酸化第二鉄又は二酸化チタンと組み合わせた微細なナノスケール金、酸化第二鉄と組み合わせた二酸化チタン、及びこれらの組み合わせを使用することができる。一実施形態では、微細なナノスケール金、酸化第二鉄又は二酸化チタンと組み合わせた微細なナノスケール金、及びこれらの組み合わせを使用することができる。
濃縮剤の別の代表的な種類として、γ−ＦｅＯ（ＯＨ）（レピドクロサイトとしても知られる）がある。こうした濃縮剤の具体例は、同一出願人による米国特許出願公開第２０１０／０２４８２１４号、発明の名称「ＭＩＣＲＯＯＲＧＡＮＩＳＭ ＣＯＮＣＥＮＴＲＡＴＩＯＮ ＰＲＯＣＥＳＳ」に見出すことができ、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。こうした濃縮剤は、食品及び水によって媒介される疾患及びヒトの細菌感染において重大な問題となりうるグラム陰性菌を捕捉するうえで他の鉄含有濃縮剤と比較して、驚くほど効果的であることが見出されている。濃縮剤は、他の成分（例えば、ベーマイト（α−ＡｌＯ（ＯＨ）、粘土、酸化鉄、及び酸化ケイ素など）を（γ−ＦｅＯ（ＯＨ）以外に）更に含んでよい。このような他の成分が含まれる実施形態では、他の成分は試料と濃縮剤との密接な接触を一般的に大きく妨げない。
γ−ＦｅＯ（ＯＨ）は既知の物質であり、公知の方法によって化学的に合成することができる（例えば、米国特許第４，７２９，８４６号（Ｍａｔｓｕｉら）（この記載内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に磁気テープ製造を目的として述べられているように、中性又は弱酸性ｐＨで水酸化第一鉄の酸化によって）。γ−ＦｅＯ（ＯＨ）はまた、市販されている（例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｍａｔｔｈｅｙ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｗａｒｄ Ｈｉｌｌ，ＭＡ）グループの一企業であるＡｌｆａ Ａｅｓａｒ及びＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）。
γ−ＦｅＯ（ＯＨ）を濃縮剤として使用する一実施形態では、γ−ＦｅＯ（ＯＨ）は、一般的に微粒子の形態である。一実施形態では、γ−ＦｅＯ（ＯＨ）は、約３マイクロメートル（他の実施形態では、約５マイクロメートル、又は約１０マイクロメートル）〜約１００マイクロメートル（他の実施形態では、約８０マイクロメートル、又は約５０マイクロメートル、又は約３５マイクロメートル、ただし任意の下限値を範囲の任意の上限値と組み合わせることができる）の範囲の粒径（最大の寸法）を有する微粒子の形態である。一実施形態では、粒子は、より小さな粒子の凝集体である。粒子は、粒径約１マイクロメートル未満（一実施形態では粒径約０．５マイクロメートル未満）の微結晶を含むことができる。微結晶は、針状微結晶として、針状微結晶を含むいかだ状構造として、又は針状微結晶といかだ状構造との組み合わせとして存在することができる。
一実施形態では、濃縮剤は、ＢＥＴ（ブルナウアー・エメット・テラー）法（窒素ガス分子の物理的吸着による固体の表面積計算）によって測定される表面積が、１グラム当たり約２５平方メートル（ｍ２／ｇ）よりも大きく、一実施形態では約５０ｍ２／ｇよりも大きく、更に別の実施形態では約７５ｍ２／ｇよりも大きい。
粒子の凝集形態は、微粒子にしばしばともなう取扱い及びその他の危険性をともなわずに、微粒子システムの吸着能を与え得るものである。加えて、そのような凝集体粒子は液体中で容易に沈殿し得るものであり、このため液相から微生物を速やかに分離することが可能となる（同時に、濾過時の背圧が低くて済む）。
濃縮剤の別の代表的な種類としては、金属ケイ酸塩がある。こうした濃縮剤の具体例は、その開示内容が参照により本明細書に組み込まれる、同一出願人による米国特許出願公開第２０１０／０１９０１７１号、発明の名称「ＭＩＣＲＯＯＲＧＡＮＩＳＭ ＣＯＮＣＥＮＴＲＡＴＩＯＮ ＰＲＯＣＥＳＳ」に見出すことができる。代表的な金属ケイ酸塩は、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）で測定した場合に、金属原子とケイ素原子の比が約０．５以下（ある実施形態では、約０．４以下、別の実施形態では、０．３以下、更に別の実施形態では、約０．２以下）の表面組成を有することができる。ある実施形態では、表面組成はまた、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）で測定した場合に、少なくとも平均１０原子パーセントの炭素（ある実施形態では、少なくとも平均約１２原子パーセントの炭素、更に別の実施形態では、少なくとも平均約１４原子パーセントの炭素）を含む。ＸＰＳは、試料表面の最も外側のほぼ３〜１０ナノメートル（ｎｍ）の元素組成を定量することができ、水素及びヘリウムを除いて周期率表中のすべての元素に感度のある手法である。ＸＰＳは、大多数の元素に対して０．１〜１原子パーセント濃度範囲の検出限界を持つ定量的な手法である。ＸＰＳの代表的な表面組成の評価条件としては、受光立体角±１０°で試料表面に対して測定される取り出し角９０°がある。
金属ケイ酸塩などの無機材料は、水系に分散又は懸濁されると、その材料及び水系のｐＨに特徴的な表面電荷を示す。物質−水の界面の両側の電位は「ゼータ電位」と呼ばれ、電気泳動における移動度から（即ち、水系中に置かれた帯電電極間を物質の粒子が移動する速度から）計算することができる。代表的な濃縮剤は、例えば、普通のタルクなどの一般的な金属ケイ酸塩のゼータ電位よりも負のゼータ電位を有することができる。それにも関わらず、こうした濃縮剤は、表面が一般的に負に帯電する傾向を有する細菌などの微生物を濃縮するうえでタルクと比較して驚くほど効果的である。一実施形態では、濃縮剤は、ｐＨ約７において負のゼータ電位（一実施形態では、ｐＨ約７において約−９ミリボルト〜約−２５ミリボルトの範囲のスモルコフスキーゼータ電位、別の実施形態では、ｐＨ約７において約−１０ミリボルト〜約−２０ミリボルトの範囲のスモルコフスキーゼータ電位、更に別の実施形態では、ｐＨ約７において約−１１ミリボルト〜約−１５ミリボルトの範囲のスモルコフスキーゼータ電位）を有する。
有用な金属ケイ酸塩としては、これらに限定されるものではないが、マグネシウム、カルシウム、亜鉛、アルミニウム、鉄、チタン、及びこれらに類するもの、並びにこれらの組み合わせなどの金属の非晶質ケイ酸塩が挙げられる。一実施形態では、マグネシウム、亜鉛、鉄、チタン、又はこれらの組み合わせを使用することができる。更に別の実施形態では、マグネシウムを使用することができる。一実施形態では、少なくとも部分的に融合した粒子の形態の非晶質金属ケイ酸塩を使用することができる。一実施形態では、非晶質の球状化された金属ケイ酸塩を使用することができる。更に別の実施形態では、球状化された非晶質ケイ酸マグネシウムを使用することができる。金属ケイ酸塩は既知であり、公知の方法によって化学的に合成するか、又は天然に生じる未加工鉱石の採鉱及び処理によって入手することができる。
いくつかの非晶質金属ケイ酸塩は、市販されている。例えば、球状化された非晶質ケイ酸マグネシウムは、化粧品の処方における使用を目的として市販されている（例えば、３Ｍ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ）より販売されるＣｏｓｍｅｔｉｃ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ ＣＭ−１１１として）。
非晶質金属ケイ酸塩に加えて、濃縮剤が上記の表面組成を有するかぎりにおいて、濃縮剤は、金属（例えば、鉄又はチタン）の酸化物、結晶性金属ケイ酸塩、他の結晶性物質、及びこれらに類するものを含む他の物質を更に含んでよい。一実施形態では、濃縮剤は結晶性シリカを基本的に含まない。
濃縮剤は、試料の接触及び微生物の捕捉に適した任意の形態で使用することができる。一実施形態では、濃縮剤は粒子の形態で使用される。一実施形態では、濃縮剤は微粒子の形態である。一実施形態では、濃縮剤は約１マイクロメートル（一実施形態では、約２マイクロメートル）〜約１００マイクロメートル（一実施形態では、約５０マイクロメートル、別の実施形態では、約２５マイクロメートル、更に別の実施形態では、約１５マイクロメートル、ただし任意の下限値を範囲の任意の上限値と組み合わせることができる）の範囲の粒径を有する微粒子の形態である。
濃縮剤を使用した微生物の濃縮又は捕捉は、微生物の特定の株、種又はタイプに特異的なものではなく、したがって試料中の一般的な微生物の集団を濃縮するものである。次いで、株特異的なプローブによる任意の公知の検出方法を用いて、捕捉された微生物の集団から微生物の特定の株を検出することができる。したがって、この濃縮剤は、臨床試料、食品試料、環境試料、又は他の試料中の汚染微生物又は病原体（特に細菌などの食品によって媒介される病原体）の検出に使用することができる。
本発明のプロセスを実施するうえで、濃縮剤は、試料との接触及び微生物の捕捉に適した任意の形態で使用することができる（例えば、粒子の形態で使用するか、あるいは微小流体装置のディップスティック、フィルム、フィルタ、チューブ、ウェル、プレート、ビーズ、膜、若しくはチャネル、又はこれらに類するものなどの支持体に塗布して）。好ましくは、濃縮剤は、粒子の形態で使用される。
必要に応じて、細胞濃縮剤は、微生物と結合することが可能な結合相手（例えば、抗体、抗体フラグメント、抗原結合ドメイン、レクチン（例えば、コンカナバリンＡ）、受容体、ファージ受容体、又はこれらに類するもの）を含んでよい。結合は、直接的なものであっても、間接的なものであってもよい。結合は、特定の微生物の種類に対して選択的であってもよく、あるいは非選択的あってもよい。
試料から微生物を捕捉するために使用される濃縮剤の量は、使用される濃縮剤の種類、試料のサイズ、貯留部の種類及びサイズ、試料の混合、特定の用途、本明細書では詳細に考察されない他の因子、又はこれらの組み合わせに少なくとも一部よって決まる。捕捉効率（濃縮剤と結合した試料中の微生物の比率）は、微生物を濃縮剤と長時間かけて接触させることによって一般的に高めることができる。捕捉効率は、濃縮剤の濃度を高くすることによって高めることもでき、高濃度の濃縮剤は、微生物が捕捉されるまでに移動する平均拡散距離を小さくすることから、インキュベーション時間が短縮される。したがって、一般論として、より多くの濃縮剤を加えるほど、同じ量の微生物を捕捉するために必要とされるインキュベーション時間は短くなる。
一実施形態では、濃縮剤の適切な量は、微生物が濃縮剤に結合するのを待つのに要する時間（「捕捉時間」と呼ぶ）に応じて変化することができる。例えば、１分間の捕捉時間では、試料１０ｍＬ当たり１０００ｍｇの濃縮剤が適切であり、１０分間の捕捉時間では、試料１０ｍＬ当たり１００ｍｇの濃縮剤が適切であり、６０分間の捕捉時間では、試料１０ｍＬ当たり１０ｍｇの濃縮剤が適当であり得る。一実施形態では、試料１０ｍＬ当たり約１ｍｇ〜約１００ｍｇの濃縮剤を使用することができる。一実施形態では、試料１０ｍＬ当たり約１ｍｇ〜約５０ｍｇの濃縮剤を使用することができる。一実施形態では、試料１０ｍＬ当たり約１０ｍｇ〜約２５ｍｇの濃縮剤を使用することができる。例えば、金属ケイ酸塩濃縮剤を使用する一実施形態では、試料１０ｍＬ当たり約１０ｍｇの金属ケイ酸塩濃縮剤を使用することができる。例えば、金属ケイ酸塩濃縮剤を使用する一実施形態では、試料１０ｍＬ当たり約２５ｍｇの金属ケイ酸塩濃縮剤を使用することができる。
検出装置：
本開示は、試料中の微生物を検出するために使用することができる装置を提供する。装置は、少なくとも２個の貯留部を含み、その間に通路を有するハウジングと、ハウジングの第１の貯留部内に配置された任意の細胞濃縮剤と、ハウジング内の少なくとも２個の貯留部を隔離するための手段と、ハウジングの第１の貯留部から第２の貯留部へと細胞濃縮剤を移動させるための手段とを含むことができる。いくつかの実施形態では、ハウジングは、２個の貯留部を隔離するための手段（例えば、破断可能なシール）を含むことができる。いくつかの実施形態において、ハウジングは、細胞濃縮剤をハウジングの第１の貯留部から第２の貯留部へと移動させるための手段（例えば、弁）を含むことができる。いくつかの実施形態では、装置は、微生物を検出するための試薬を更に含むことができる。特定の実施形態では、装置は、細胞抽出剤を含む放出要素を更に含むことができる。細胞抽出剤は、微生物からの生物学的検体の検出を促進することができる。
ここで図１Ａを参照すると、本開示に基づく検出装置１００の一実施形態の構成要素の断面図が示される。検出装置の構成要素は、ハウジング１１０とプランジャ１５０とを含む。ハウジング１１０は、下側部分１１４に隣接した上側部分１１２を含む。上側部分１１２と下側部分１１４とは、型成形などの当該技術分野では周知の方法によって、ポリエチレン又はポリプロピレンなどのポリマー材料から別々に形成することができる。それぞれの部分は、実質的に液密な結合を与えるように一体に圧入されるような寸法とするか、あるいは当該技術分野において知られる手段（例えば、接着剤、超音波溶接など）によって一体に結合することができる。また、ハウジングは、例えば、中空体を押し出し成形し、通路を型成形し、熱を用いたプロセスによってハウジングの底をシールするなど、当該技術分野において知られるプロセスによって単一のユニットとして形成することもできる。他の実施形態では、狭い通路を含む挿入部材を一体型ハウジング内に配置して、第１及び第２の貯留部（それぞれ１２０及び１２４）を形成することができる。
上側部分１１２の、下側部分１１４からみて遠位となる端部には、プランジャ１５０を受容するような寸法の開口部１１３が形成される。上側部分１１２の反対側の端部には、ハウジング１１０の下側部分１１４内に開口する通路１１６が形成される。図に示される実施形態では、第１の貯留部１２０の断面積よりも小さい断面積を有する通路１１６が、上側部分１１２を形成する壁の内向きの延長部として示される。あるいは、通路１１６は、上側部分１１２の壁の内側にハウジング１１０の下側部分１１４に隣接して嵌まる挿入要素によって形成されてよい（図に示されていない）。挿入要素は、ハウジング１１０の下側部分１１４に隣接した通路１１６を形成することができる。図１Ａの上側部分１１２、下側部分１１４、及び通路１１６の相対的比率はあくまで例示的なものであって、試料の体積及び／又は器具の制限条件などの異なるパラメータに対応するうえで必要に応じて適合させることができる。
プランジャ１５０は、一端にハンドル１５２を、他端に複数のシール（第１の下側シール１５６及び第２の下側シール１５７）を有するシャフト１５１を含む。必要に応じて、プランジャ１５０は１つ以上の上側シール１５４及び／又はインデックスマーク１５３を含むことができる。ハンドル１５２、第１の下側シール１５６、及び第２の下側シール１５７間の相対的な距離については後述する。図１Ａに更に示されているのは、任意の検出試薬１６５及び任意の放出要素１６２である。
「検出試薬」とは、本明細書ではその最も広い意味で使用される。検出試薬とは、生物学的検体を検出するために反応中で使用することのできる試薬である。検出反応の非限定的な例としては、結合相手間の相互作用（例えば、抗原−抗体、受容体−リガンド、プローブ−標的分子、及びハイブリダイゼーション結合相互作用など）、及び／又は酵素反応（例えば、蛍光発生反応、色素生成反応、光発生反応、又は重合反応などの酵素媒介反応）が挙げられる。検出試薬は検出反応に関与する（例えば、結合相手、酵素、酵素基質、又は指示薬として）ものでもよく、かつ／又は検出反応を促進する（例えば、緩衝剤、補因子、又は共役反応の成分として）ものでもよい。検出試薬の例としては、例えば、ルシフェラーゼ、アデニル酸キナーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、アピラーゼなどの酵素、例えば、ルシフェリン、リン酸メチルウンベリフェリル、ｏ−ニトロフェニルリン酸、ｐ−ニトロフェニルリン酸、及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−リン酸塩などの酵素基質、例えば、リン酸緩衝液、ＴＲＩＳ緩衝液、及びＨＥＰＥＳ緩衝液などの緩衝液、並びに、ＦＡＤＨ、ＮＡＤＨ、補酵素Ａなどの補因子が挙げられる。
検出試薬は、様々な形態でハウジング１１０内に含まれることができる。例えば、検出試薬１６５は、図１Ａに示されるような乾燥した又は部分的に乾燥したコーティングからなることができる。検出試薬１６５に適した別の形態（図に示されていない）は当該技術分野では周知のものであり、例えば、液体試薬（必要に応じて、アンプルのような破断可能な区画内に入った）、粉末、ゲル、錠剤、凍結乾燥試薬、コーティングされたフィルム、ケーキ、及び、完全乾燥試薬などが挙げられる。
図１Ｂは、図１Ａのプランジャ１５０を有するハウジング１１０を含む検出装置１００の断面図を示す。この図は、装置１００を使用前に保管することができるような形態を示す。プランジャ１５０は、ハウジング１１０内に完全に挿入されている。この位置では、ハンドル１５２の下縁部がハウジング１１０の上側部分１１２の開口部１１３を封鎖することによって、ハウジング１１０への物質の出入りが防止されている。必要に応じて用いられる上側シール１５４も、ハウジング１１０への物質の出入りを防止するうえで機能することができる。上側シール１５４はハウジング１１０の上側部分１１２の壁の内表面と接触するような寸法に構成され、バリア、好ましくは液密バリアを形成するのに適した材料（例えば、ポリプロピレン、ブチルゴムなど）で形成される。
プランジャ１５０が図１Ｂに示される位置にある場合、第１の下側シール１５６が通路１１６を封鎖することにより、ハウジング１１０の第１の貯留部１２０が第２の貯留部１２４から隔離される。プランジャ１５０が図１Ｂに示される位置にある場合、プランジャ１５０の第２の下側シール１５７を含む部分が第２の貯留部１２４内に延びており、この部分はハウジング１１０の下側部分１１４の壁と接触していない。第１の下側シール１５６及び第２の下側シール１５７は通路１１６の壁と接触するような寸法となっており、第１の貯留部１２０と第２の貯留部１２４との間において通路１１６内にバリア、好ましくは液密バリアを形成するのに適した材料（例えば、ポリプロピレン、ブチルゴム）で形成される。また、図１Ｂには、第１の貯留部１２０内に位置決めされた、任意の濃縮剤１３０が示される。
図１Ｃは、プランジャ１５０が第２の位置にある図１Ｂの装置１００の断面図を示す。このプランジャ１５０は、例えばハウジング１１０内に試料を装填するために使用できる。プランジャ１５０は、ハンドル１５２を把持して、第２の下側シール１５７が通路１１６の上端に近くなる位置にまで引き出すことができる。必要に応じて用いられるプランジャシャフト１５１上のインデックスマーク１５３を用いて（例えば、インデックスマーク１５３が開口部１１３と整列した時点で）、この位置に達するためのプランジャ１５０の適切な位置を示すことができる。図１Ｃは、第１の貯留部１２０内の濃縮剤１３０と接触している液体試料１４０を更に含む。使用時には、装置１００を、例えば、ボルテックスにかける又は振動させることによって濃縮剤１３０と液体試料１４０とを混合することができる。所定の時間の後、濃縮剤１３０は、図１Ｃに示すように第１の貯留部１２０の底に沈殿することができる。いくつかの実施形態では、必要に応じて用いられるテーパ領域１１８が通路１１６に隣接して配置される。テーパ領域１１８は、ハウジング１１０の上側部分１１２及び／又は通路１１６と同じ材料及び／又はプロセスによって形成することができる。使用時には、テーパ領域１１８は、ハウジング１１０の内部において通路１１６の方向に沈降する、液体に懸濁された粒子（例えば、細胞濃縮剤１３０）を通路１１６の方向に向かわせることができる。
図１Ｄは、図１Ｂに示される第１の位置にプランジャ１５０が戻された、図１Ｃの装置１００の断面図を示す。ハンドル１５２の下縁部は開口部１１３に近い位置にあり、液体試料の、濃縮剤１３０を含む部分１４２が第２の貯留部１２４に移され、そこで部分１４２は検出試薬１６５（図１Ａに示される）が存在する場合に試薬１６５と相互作用することができる。部分１４２と検出試薬１６５との間の相互作用の非限定的な例としては、検出試薬の溶解及び／又は懸濁、検出試薬と部分中に存在する生物学的検体との間の結合相互作用、及び／又は酵素反応が挙げられる。図１Ｄはまた、液体試料の部分１４２が第２の貯留部１２４内の放出要素１６２と接触している状態を示しており、これにより放出要素１６２から細胞抽出剤が放出されることができる。
図１に示す実施形態では、第２の貯留部１２４から第１の貯留部１２０を隔離するための手段は、プランジャ１５０の第１の下側シール１５６及び／又は第２の下側シール１５７と通路１１６との組み合わせから構成される。図１に示す実施形態では、濃縮剤１３０を第１の貯留部１２０から第２の貯留部１２４に移動させるための手段は、通路１１６と、プランジャ１５０の第１の下側シール１５６及び第２の下側シール１５７とを含む。
図２Ａは、本発明に基づく検出装置２００の一実施形態の構成要素であるプランジャ２５０の断面図、及びハウジング２１０の部分分解断面図である。ハウジング２１０は、下側部分２１４に隣接した上側部分２１２を含む。上側部分２１２及び下側部分２１４は、上記に述べたように形成することができる。
上側部分２１２の、下側部分２１４からみて遠位となる端部には、プランジャ２５０を受容するような寸法の開口部２１３が形成される。上側部分２１２の反対側の端部には、上記に述べたような通路２１６が形成される。必要に応じて用いられる上記に述べたようなテーパ領域２１８が、通路２１６に隣接して形成される。破断可能なシール２６０ａ及び２６０ｂによって、ハウジングが第１の貯留部２２０、第２の貯留部２２４、及び第３の貯留部２２６に分割される。この実施形態では、第３の貯留部２２６は、第１の貯留部２２０と第２の貯留部２２４との間に配置される。破断可能なシール２６０ａ及び２６０ｂは耐水性材料（例えば、薄いポリマーフィルム、ポリマーコーティングされた紙、薄い箔など）で形成されることが好ましく、当該技術分野では周知の材料及び／又はプロセス（例えば、接着剤、熱シール、超音波接着）を用いて耐水性の破断可能なバリアを形成するようにハウジング２１０の壁に固定することができる。
第３の貯留部２２６内に位置決めされているのは、細胞抽出剤を含む放出要素２６２である。いくつかの実施形態において、放出要素は、ヒドロゲルを含むことができる。細胞抽出剤を含むヒドロゲルの好適な例は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ国際公開特許ＷＯ ２０１０／０３９６２７、発明の名称「ＢＩＯＤＥＴＥＣＴＩＯＮ ＡＲＴＩＣＬＥＳ」に述べられている。
図２Ａの３個の貯留部の相対的比率はあくまで例示的なものであって、試料の体積及び／又は器具の制限条件などの異なるパラメータに対応するうえで必要に応じて適合させることができる。図２Ａには更に、必要に応じて用いられる濃縮剤２３０、本明細書で述べるような必要に応じて用いられる検出試薬２６５、及び必要に応じて用いられる着脱式キャップ２７８が示されている。キャップ２７８は、当該技術分野では周知のプロセス（例えば、型成形）を用いてポリマー材料（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレンなど）から形成することができ、ハウジング２１０の液密カバーを形成するような寸法とすることができる。
プランジャ２５０は、一方の端部にハンドル２５２を、反対側の端部に下側シール２５６及び穿孔端２５９を有するシャフト２５１を含む。好ましくは、下側シール２５６は通路２１６の壁と接触するような寸法となっており、通路２１６内にバリア、好ましくは液密バリアを形成するのに適した材料（例えば、ポリプロピレン、ブチルゴムなど）で形成される。必要に応じて、プランジャ２５０は、上記に述べたような１つ以上の上側シール２５４を含んでよい。ハンドル２５２、下側シール２５６、及び穿孔端２５９間の相対距離については後述する。
図２Ｂは、図２Ａの装置２００の断面図を示す。この図では、ハウジング２１０は第１の貯留部２２０内に液体試料２４０を更に含む。キャップ２７８はハウジング２１０上にしっかりと着座しているため、ハウジング２１０をボルテックス、振動、振盪、又は反転するなど、当該技術分野では周知のプロセスによって液体試料２４０を細胞濃縮剤２３０と混合することができる。混合の後、細胞濃縮剤２３０を通路２１６内の破断可能なシール２６０ａ上に沈殿させることができる。
図２Ｃは、プランジャ２５０が部分的に挿入された図２Ｂのハウジング２１０を含む装置２００の断面図を示す。この位置では、プランジャ２５０の下側シール２５６が通路２１６の壁と接触することにより、通路２１６内において少なくとも部分２４２を液体試料２４０の残りの部分から隔離している。通路２１６内には、細胞濃縮剤２３０が更に隔離されている。
図２Ｄは、プランジャ２５０が完全に挿入された図２Ｃの装置２００の断面図を示す。プランジャ２５０の下側シール２５６が通路２１６の壁に接触し、穿孔端２５９が破断可能なシール２６０ａ及び２６０ｂに穿孔していることにより、液体試料の部分２４２、細胞濃縮剤２３０、及び放出要素２６２が第２の貯留部２２４内に移され、そこで任意の検出試薬２６５（図２Ａに示される）が存在する場合に部分２４２が検出試薬２６５と相互作用することができる。部分２４２と検出試薬２６５との間の相互作用の非限定的な例としては、検出試薬の溶解及び／又は懸濁、検出試薬と部分中に存在する生物学的検体との間の結合相互作用、及び／又は酵素反応が挙げられる。
図２に示される実施形態では、第２の貯留部２２４から第１の貯留部２２０を隔離するための手段には、破断可能なシール２６０ａ及び２６０ｂが含まれる。第２の貯留部２２４から第１の貯留部２２０を隔離するための手段には、プランジャ２５０の下側シール２５６と通路２１６との組み合わせが更に含まれることができる。図２に示される実施形態では、第１の貯留部２２０から第２の貯留部２２４に細胞濃縮剤２３０を移動させるための手段には、プランジャ２５０の穿孔端２５９及び下側シール２５６と、通路２１６とが含まれる。
図３Ａは、本開示に基づく検出装置３００の一実施形態の正面図を示す。装置３００は、ハウジング３１０及び必要に応じて用いられるキャップ３７８を含む。ハウジング３１０は、上記に述べたように上側部分３１２、通路３１６、及び下側部分３１４を有するように構成することができる。必要に応じて用いられるキャップ３７８は、上記に述べたように構成することができる。装置３００は、図３Ａの第１の位置に示される弁アクチュエータ３７２を有する行き止まり弁３７０を更に含む。図３Ｂは、図３Ａの装置３００及び弁アクチュエータ３７２の側面図である。
図３Ｃは、図３Ａに示される装置３００の断面図を示す。装置３００は、キャップ３７８及びハウジング３１０を含む。ハウジング３１０は、上側部分３１２及び下側部分３１４を含む。上側部分３１２は、内部に行き止まり弁３７０が配置された通路３１６を含む。行き止まり弁３７０は、弁がこの第１の位置にある場合に第１の貯留部３２０と流体連通する弁キャビティ３７４を含む。弁キャビティ３７４は、第１の貯留部３２０内の液体試料３４０と接触する、任意の細胞濃縮剤３３０を含む。第２の貯留部３２４は、ともに本明細書に記載されているような、任意の放出要素３６２及び／又は任意の検出試薬３６５を収容する。また、図３Ｃには、本明細書で述べるような、必要に応じて用いられるテーパ領域３１８が示されている。
図３Ｄは、弁３７０が第２の位置にある図３Ｃの装置３００の断面図を示す。弁３７０が第２の位置にある場合、液体試料の、細胞濃縮剤３３０を含む部分３４２は隔離されて第２の貯留部３２４に移され、そこで部分３４２は、本明細書で述べるような放出要素３６２が存在する場合にはヒドロゲル３６２と接触し、検出試薬３６５が存在する場合には検出試薬３６５と相互作用することができる。
弁キャビティ３７４の寸法が既知の所定の量を与え、そのため弁３７０を１回以上使用して所定量の液体試料３４０を第１の貯留部３２０から第２の貯留部３２４に移動させることが可能であることが認識される。更に、液体試料の部分３４２が第１の貯留部３２０から第２の貯留部３２４に移された後、第１の貯留部３２０内の液体試料３４０の残部を捨てることができ、異なる物質（例えば、希釈剤、緩衝剤、液体及び／又は粉末試薬）を第１の貯留部３２０内に入れることができ、その後弁３７０を使用して所定量を第２の貯留部３２４に移すことが可能であることが認識される（図示せず）。
図３に示される実施形態では、ハウジングの第１の貯留部３２０と第２の貯留部３２４とを隔離するための手段は、弁３７０を含む。図３に示される実施形態では、第１の貯留部３２０から第２の貯留部３２４に細胞濃縮剤３３０を移動するための手段には、通路３１６及び弁３７０を含む。
図４Ａは、いずれも本開示に基づく検出装置４００の構成要素である、プランジャ４５０の側面図及びハウジング４１０の断面図を示す。プランジャは、シャフト４５１、必要に応じて用いられるＯリング４５５、及び穿孔端４５９を含む。Ｏリングは、ハウジング４１０との液密なシールを与えるように柔軟性のある材料（例えば、ブチルゴム）で形成することができる。ハウジング４１０は、上記に述べたように上側部分４１２及び下側部分４１４を有するように構成することができる。必要に応じて用いられるキャップ４７８は、上記に述べたように構成することができる。破断可能なシール４６０は、ハウジング４１０を、３つの貯留部、即ち第１の貯留部４２０、第２の貯留部４２４、及び第１の貯留部４２０と第２の貯留部４２４との間に配置される第３の貯留部４２６に分割する。この図では、破断可能なシール４６０は、第１の貯留部４２０の第２の貯留部４２４に近い方の端部に位置決めされている。破断可能なシール４６０間の空間によって第３の貯留部４２６が画定されている。第３の貯留部４２６内に位置決めされているのは、細胞抽出剤を含む放出要素４６２である。代替構成（図示せず）は、第２の貯留部４２４の近くに破断可能なシール４６０を１個だけ有し、図３Ｃに示されるように放出要素４６２が第２の貯留部４２４内に位置決めされてよい。
第１の貯留部４２０内の破断可能なシール４６０の近くに位置決めされているのは、閉位置で示されている弁ゲート４８２を有するドレーン弁４８０である。同様に第１の貯留部４２０内内に位置決めされているのは、液体試料４４０及び任意の細胞濃縮剤４３０である。任意の検出試薬４６５が第２の貯留部４２４内に示されている。
図４Ｂは、図４Ａのハウジング４１０及びプランジャ４５０を含む組み立てられた状態の検出装置４００の断面図を示す。細胞濃縮剤４３０は、第１の貯留部４２０の底に沈殿している。ドレーン弁４８０の弁ゲート４８２は開位置にあり、矢印によって示される方向に力が作用する（例えば、指又は手からの圧力によって）と、清澄化した液体試料４４５がドレーン弁４８０から排出される。また、図４Ｂに示されているのは、第２の貯留部４２４の壁にコーティングされた検出試薬４６５である。
図４Ｃは、図４Ｂの検出装置４００の断面図を示す。この図では、プランジャ４５０のＯリング４５５及び穿孔端４５９が、ドレーン弁４８０の、最も近くの破断可能なシール４６０に近い方の側でハウジング４１０内に挿入されている。この位置では、プランジャ４５０によって、液体試料の細胞濃縮剤４３０を含む部分４４２がプランジャ４５０と最も近くの破断可能なシール４６０との間に閉じ込められる。
図４Ｄは、図４Ｃの検出装置４００の断面図を示す。この図では、プランジャ４５０の穿孔端４５９が破断可能なシール４６０の両方を穿孔しており、液体試料の部分４４２が第２の貯留部４２４へと移動しており、第２の貯留部４２４において部分４４２が検出試薬（図４Ｃに示される）を溶解し、細胞抽出剤を含む放出要素４６２と接触している。
図５Ａは、いずれも検出装置５００の構成要素であるプランジャ５５０及びハウジング５１０の断面図を示す。プランジャ５５０は、必要に応じて用いられるハンドル５５２及び先端部５９０を備えるシャフト５５１を含む。任意の実施形態において、ハンドル５５２は、任意のＯリング５５５を更に含んでよい。
ハウジング５１０は、上記に述べたように上側部分５１２及び下側部分５１４を有するように構成することができる。破断可能なシール５６０ａ及び５６０ｂは、ハウジング５１０を、３つの貯留部、即ち第１の貯留部５２０、第２の貯留部５２４、及び第１の貯留部５２０と第２の貯留部５２４との間に配置される第３の貯留部５２６に分割している。この図では、破断可能なシール５６０ａ及び５６０ｂは、第１の貯留部５２０の第２の貯留部５２４に近い方の端部に位置決めされている。破断可能なシール５６０ａと５６０ｂとの間の空間によって、第３の貯留部５２６が画定される。第３の貯留部５２６内に位置決めされているのは、本明細書で述べるような細胞抽出剤を含む放出要素５６２である。図に示される実施形態では、第２の貯留部５２４は、任意の検出試薬５６５を含む。代替構成（図示せず）は、第２の貯留部の近くに破断可能なシールを１個だけ有し、図３Ｃに示されるように放出要素が第２の貯留部内に位置決めされてよい。
ハンドル５５２は、例えば、プラスチック、木材、金属、及びこれらの組み合わせなどのそれぞれの種の材料から、当該技術分野では周知のプロセスを用いて作製することができる。必要に応じて用いられるＯリング５５５は、ハンドル５５２の切り欠き５５４内に配置されている。ハンドル５５２は、プランジャ５５０がハウジング５１０に完全に挿入される際に、ハンドル５５２の少なくとも一部がハウジング５１０に挿入されうるような形状及び寸法とすることができる。一実施形態では、ハンドル５５２は、ハウジング５１０の開口部と係合して、ハンドル５５２がハウジング５１０に完全に挿入されることを防止するリム５５４を更に含む。
プランジャ５５０のシャフト５５１は、例えば、プラスチック、木材、金属、及びこれらの組み合わせなどのそれぞれの種の材料で形成することができる。シャフト５５１の一端は、例えば、凹部（図５に示される）に圧入することにより、超音波溶接により、又は接着剤を使用することによりハンドル５５２に対して結合される。シャフト５５１の他端は、例えば、圧入により、超音波溶接により、又は接着剤を使用することにより先端部５９０に対して結合される。
プランジャ５５０の先端部５９０の細部が図６Ａ及び６Ｂに示されている。
図６Ａは、部分的に断面にて示された図５Ａの先端部５９０の部分分解側面図を示す。先端部６９０は、本体６９１、一方向弁６９７、及びフィルタ６９６を含む。
本体６９１は、第１の端部６９１ａ、第２の端部６９１ｂ、及び第１の端部６９１ａから第２の端部６９１ｂへと本体６９１を通じて延びる導管６９２を含む。第１の端部６９１ａにおいて、導管６９２は、プランジャのシャフト６５１によってシールされる。第２の端部６９１ｂにおいて、導管６９２は陥凹した開口部６９４内に開口する。２本のドレーン通路６９５が、本体６９１の第１の端部６９１ａから導管６９２へと延びる。したがって、それぞれのドレーン通路は、導管６９２及び陥凹開口部６９４に流体接続される。更に、陥凹開口部６９４、導管６９２、及びプランジャの先端部６９０を通過する流体経路のためのドレーン通路６９５に接続される。このように、この実施形態では、プランジャは流体経路を含む。
一実施形態（図示せず）では、先端部６９０は、１本のみのドレーン通路６９５を含んでよい。複数のドレーン通路６９５は、背圧を低くでき、先端部６９０を通じた流体の輸送速度が大きくなり、有利である。
本体６９１は、例えば、型成形することなどによりプラスチック（例えば、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリテトラフルオロエチレンなど）から作製することができる。本体６９１は、ハウジング（例えば、図５Ａのハウジング５１０）内に嵌合するような形状及び寸法に構成される。任意の実施形態において、本体６９１又はＯリング６８６は、本体６９１がハウジングに挿入される際に、ハウジングの壁と実質的に液密なシールを形成できる。Ｏリング６８６を含む任意の実施形態では、Ｏリング６８６は液密なシールを形成することと、Ｏリング６８６がハウジングの壁に対して動かされる際に、ハウジングの壁から粒子状物質（例えば、細胞濃縮剤）を拭い取ることとの両方の機能を有してよい。シャフト６５１は、当該技術分野では周知の手段によって（例えば、接着剤、圧入などにより）導管６９２と連結することができる。必要に応じて用いられるＯリング６８６は、本体６９１の切り欠き６８９内に配置される。
先端部６９０は、フィルタ６９６を更に含む。フィルタ６９６は、本体６９１に対して結合されている。図に示される実施形態では、フィルタ６９６は、陥凹開口部６９４に圧入及び／又は接着剤により結合することが可能な多孔質材料で形成される。いくつかの実施形態では、多孔質材料は、半剛性の多孔質材料（例えば、Ｐｏｒｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｆａｉｒｂｕｒｎ，ＧＡ）により部品番号Ｘ６８５４として販売されるＰＯＲＥＸ濾過媒質）であってよい。フィルタ６９６は、比較的角張った、あるいは尖った端部を有するように構成することにより、端部が破断可能なシールを容易に貫通することができる。代替的な実施形態（図示せず）では、フィルタは、本体に対して結合された膜フィルタからなるものでよい。膜フィルタは、本体と結合すると、導管及びドレーン通路を含む流体経路の一部を形成する。
いくつかの実施形態では、フィルタ６９６の多孔度は、フィルタ６９６が比較的大きな粒子（例えば、＞１μｍ、＞５μｍ、又は＞１０μｍ）の通過のみを防止するように選択することができる。比較的大きな粒子には、例えば、本明細書で述べるような細胞濃縮剤が含まれる。これらの実施形態では、細菌、酵母、及び／又は真菌類（カビ）の糸状体などの微生物は、フィルタ６９６を通過することができる。
いくつかの実施形態では、フィルタ６９６の多孔度は、フィルタ６９６が比較的小さな粒子（例えば、＜１μｍ、＜０．４５μｍ、又は＜０．２μｍ）の通過のみを防止するように選択することができる。これらの実施形態では、細菌、酵母、及び／又は真菌類（カビ）の糸状体などの微生物はフィルタ６９６によって保持され得る。
先端部６９０は、陥凹開口部６９４内においてフィルタ６９６と導管６９２との間に配置される一方向弁６９７を更に含む。必要に応じて用いられる、一方向弁６９７を定位置に保持する機能を有する保持ワッシャ６９８も更に示されている。一方向弁６９７は、プラスチック（例えば、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリエステルなど）又はゴムで形成することができ、例えば、ダックビル弁として構成することができる。使用時には、一方向弁６９７は、フィルタ６９６を通過した液体の流れがフィルタ６９６を通じて逆方向に戻ることを実質的に防止する。
図６Ｂは、組み立てられた状態の図６Ａの先端部６９０の、部分的に断面にて示された側面図を示す。一方向弁６９７、必要に応じて用いられる保持ワッシャ６９８、及びフィルタ６９６が陥凹した開口部内に配置され、導管６９２及びドレーン通路６９５と流体接続している。シャフト６５１は、先端部６９０の本体６９１に対して結合されている。
図５Ａを再び参照すると、ハウジング５１０及びプランジャ５５０を含む検出装置５００は、微生物、特に生きた微生物を検出するための方法において使用される。
使用時には、液体試料は、ハウジング５１０の第１の貯留部５２０内に移され、そこで細胞濃縮剤５３０と接触させられる。液体試料５４０がハウジング５１０に加えられた後、プランジャ５５０の先端部がハウジング５１０に挿入され、図５Ｂに示されるようにハウジング５１０の第２の貯留部５２４の方向に付勢される（例えば、手動により、又は機械的に）。プランジャ５５０の先端部５９１が液体試料５４０と接触すると、図５Ｂに示されるように液体は先端部５９０を通過してハウジング５１０内に戻る。このプロセスでは、細胞濃縮剤５３０、及びいくつかの実施形態では遊離微生物が、液体試料の第３の貯留部５２６に近い部分５４２内に保持される。
プランジャ５５０の先端部５９０が図示されていない破断可能なシール５６０ａを貫通すると、液体試料の細胞濃縮剤５３０を含む部分５４２が放出要素５６２と接触する。プランジャ５５０が更に動く（図５Ｄに示されるように）と、破断可能なシール５６０ｂを貫通し、これにより液体試料の部分５４２及び放出要素５６２が第２の貯留部５２４に移動し、そこで検出試薬５６５と接触する。
図７Ａは、本開示に基づく検出装置７００の別の実施形態の側断面図を示す。検出装置７００は、プランジャ７５０及びハウジング６１０を含む。
ハウジング７１０は、上記に述べたようにして上側部分７１２及び下側部分７１４を有するように構成することができる。破断可能なシール７６０ａ及び７６０ｂは、ハウジング７１０を、３つの貯留部、即ち第１の貯留部７２０、第２の貯留部７２４、及び第１の貯留部７２０と第２の貯留部７２４との間に配置される第３の貯留部７２６に分割する。この図では、破断可能なシール７６０ａ及び７６０ｂは、第１の貯留部７２０の第２の貯留部７２４に近い方の端部に位置決めされている。破断可能なシール７６０ａと７６０ｂとの間の空間によって第３の貯留部７２６が画定されている。第３の貯留部７２６内に位置決めされているのは、細胞抽出剤を含む放出要素７６２である。図に示される実施形態では、第２の貯留部７２４は、任意の検出試薬７６５を含む。代替構成（図示せず）は、第２の貯留部７２４の近くに破断可能なシール７６０を１個だけ有し、図３Ｃに示されるように放出要素７６２が第２の貯留部７２４内に位置決めされてよい。
プランジャ７５０は、ハンドル７５２及び先端部７９０に連結されたシャフト７５１を含む。この実施形態では、シャフト７５１は、中空であり、ハンドルは、シャフト７５１の内部と外部との間で圧力を等しくするための通気口７４８を含む。プランジャは、必要に応じて用いられるドレーン管７５３を更に含む。ドレーン管７５３は先端部７９０から液体濾液を受けて、この濾液をシャフト７５１の内部に分配する。ドレーン管７５３はまた、オーバーフロー弁として機能することによって逆方向に先端部７９０を通じて逆流する濾液の量を低減させる。
プランジャ７５０の先端部７９０の細部が図８に示されている。
図８Ａは、部分的に断面にて示された図７Ａの先端部７９０の部分分解側面図を示す。先端部８９０は、本体８９１、必要に応じて用いられる一方向弁８９７、及びフィルタ８９６を含む。また、図８Ａには、プランジャ８５０の、中空シャフト８５１及びドレーン管８５３を含む部分も示されている。
本体８９１は、第１の端部８９１ａ、第２の端部８９１ｂ、及び第１の端部８９１ａから第２の端部８９１ｂへと本体８９１を通じて延びる導管８９２を含む。第１の端部８９１ａにおいて、導管８９２は、プランジャのドレーン管８５３と連結されている（例えば、圧入、及び接着剤、又はネジによる連結により）。第２の端部８９１ｂにおいて、導管８９２は、陥凹した開口部８９４内に開口している。したがって、陥凹開口部８９４は、導管８９２及びドレーン管８５３と流体連結される。
本体８９１は、例えば、型成形することなどによりプラスチック（例えば、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリテトラフルオロエチレンなど）から作製することができる。本体８９１は、ハウジング（例えば、図７Ａのハウジング７１０）内に嵌合するような形状及び寸法に構成される。任意の実施形態において、本体８９１又はＯリング８８６は、本体８９１がハウジングに挿入される際に、ハウジングの壁と実質的に液密なシールを形成することができる。Ｏリング８８６を含む任意の実施形態では、Ｏリング８８６は、液密なシールを形成することと、Ｏリング８８６がハウジングの壁に対して動かされる際に、ハウジングの壁から粒子状物質（例えば、細胞濃縮剤）を拭い取ることとの両方の機能を有してよい。シャフト８５１は、当該技術分野では周知の手段によって（例えば、接着剤、圧入などにより）導管８９２と連結することができる。必要に応じて用いられるＯリング８８６は、本体８９１の切り欠き８８９内に配置される。
先端部８９０は、フィルタ８９６を更に含む。フィルタ８９６は、陥凹開口部８９４において本体８９１に対して結合されている。図に示される実施形態では、フィルタ８９６は、陥凹開口部８９４に圧入及び／又は接着剤により結合することが可能な多孔質材料で形成されている。いくつかの実施形態では、多孔質材料は、半剛性の多孔質材料（例えば、Ｐｏｒｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｆａｉｒｂｕｒｎ，ＧＡ）により部品番号Ｘ６８５４として販売されるＰＯＲＥＸ濾過媒質）であってよい。フィルタ８９６は、比較的角張った、あるいは尖った端部を有するように構成することにより、端部が破断可能なシールを容易に貫通することができる。代替的な実施形態（図示せず）では、フィルタは、本体に対して結合された膜フィルタからなるものでよい。膜フィルタは、本体と結合すると、導管及びドレーン通路を含む流体経路の一部を形成する。
いくつかの実施形態では、フィルタ８９６の多孔度は、フィルタ８９６が比較的大きな粒子（例えば＞、１μｍ、＞５μｍ、又は＞１０μｍ）の通過のみを防止するように選択することができる。比較的大きな粒子には、例えば、本明細書で述べるような細胞濃縮剤が含まれる。これらの実施形態では、細菌、酵母、及び／又は真菌類（カビ）の糸状体などの微生物はフィルタ８９６を通過することができる。
いくつかの実施形態では、フィルタ８９６の多孔度は、フィルタ８９６が比較的小さな粒子（例えば、＜１μｍ、＜０．４５μｍ、又は＜０．２μｍ）の通過のみを防止するように選択することができる。これらの実施形態では、細菌、酵母、及び／又は真菌類（カビ）の糸状体などの微生物はフィルタ８９６によって保持され得る。
先端部８９０は、陥凹開口部８９４内においてフィルタ８９６と導管８９２との間に配置される、必要に応じて用いられる一方向弁８９７を更に含んでよい。必要に応じて用いられる一方向弁８９７を定位置に保持する機能を有する保持ワッシャ８９８もまた、示されている。一方向弁８９７は、プラスチック（例えば、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリエステルなど）又はゴムで形成することができ、例えば、ダックビル弁として構成することができる。使用時には、一方向弁８９７は、フィルタ８９６を通過した液体の流れがフィルタ８９６を通じて逆方向に戻ることを実質的に防止する。
図８Ｂは、組み立てられた状態の図７Ａの先端部７９０の、部分的に断面にて示された側面図を示す。一方向弁８９７、必要に応じて用いられる保持ワッシャ８９８、及びフィルタ８９６が陥凹した開口部内に配置され、導管８９２及びドレーン管８５３と流体接続している。シャフト８５１は、先端部８９０の本体８９１に対して結合されている。
図７Ａを再び参照すると、ハウジング７１０及びプランジャ７５０を含む検出装置７００は、微生物、特に生きた微生物を検出するための方法において使用される。
使用時には、液体試料は、ハウジング７１０の第１の貯留部７２０内に移され、そこで細胞濃縮剤７３０と接触させられる。液体試料７４０がハウジング７１０に加えられた後、プランジャ７５０の先端部７９０がハウジング７１０に挿入され、図７Ｂに示されるようにハウジング７１０の第２の貯留部７２４の方向に付勢される（例えば、手動により、又は機械的に）。プランジャ７５０の先端部７９１が液体試料７４０と接触すると、図７Ｂに示されるように液体は、先端部７９０を通過して、ドレーン管７５３を通過して、プランジャ７５０の中空シャフト内に通る。このプロセスでは、細胞濃縮剤７３０、及びいくつかの実施形態では、遊離微生物が、液体試料の第３の貯留部７２６に近い部分７４２内に保持される。
プランジャ７５０の先端部７９０が図示されていない破断可能なシール７６０ａを貫通すると、液体試料の細胞濃縮剤７３０を含む部分７４２が放出要素７６２と接触する。プランジャ７５０が更に動く（図７Ｄに示されるように）と、破断可能なシール７６０ｂを貫通し、これにより液体試料の部分７４２及び放出要素７６２が第２の貯留部７２４に移動し、そこで検出試薬７６５と接触する。
本開示の装置は、ハウジング内に破断可能なシールを含む。破断可能なシールが穿孔されることによって、装置の１つの区画から別の区画へと細胞濃縮剤が輸送される。いくつかの実施形態では、このプロセスで移動させられる細胞濃縮剤の量を、破断可能なシールの比較的面積に細胞濃縮剤を集めることによって大きくすることができる。図９は、細胞濃縮剤の回収率を高めるための回収要素９６７の一実施形態を示す。回収要素９６７は、本開示に基づく検出装置のハウジング内に嵌合するような寸法に構成されている。回収要素９６７は、細胞濃縮剤（図示せず）を含む試料の方向に向けられる、面取りされた縁部９６８を含む。通常、面取りされた縁部９６８は、重力によって沈降する粒子を回収するように上側を向いている。また、面取りされた縁部９６８を、例えば、遠心力又は流体力の方向に向けることによって、重力以外の力が作用する粒子を回収することもできる。回収要素９６７は、必要に応じて用いられる破断可能なシール９６９を更に含む。
回収要素９６７は、例えば、ポリマー（例えば、ポリエステル、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ナイロン、並びにこれらの組み合わせ及び誘導体）、ガラス、及び金属などのそれぞれの種の材料で形成することができる。回収要素９６７は、その表面に対する粒子の接着を阻止するための潤滑性コーティングを更に含んでよい。面取りされた縁部９６８は、その斜面に沿った粒子の運動を促進するために角度（例えば、４５°の角度、＞４５°よりも大きな角度）が付けられていてもよい。破断可能なシール９６９は本明細書に述べられるように作製し、本明細書に述べられるような手段によって回収要素９６７に結合することができる。
図１０Ａは、回収要素１０６７を含む検出装置１０００の一実施形態を示す。装置１０００は、ハウジング１０１０及びプランジャ１０５０を含む。ハウジング１０１０は、上側部分１０１２及び下側部分１０１４を含む。上側部分１０１２の内部かつ下側部分１０１４の近くに、破断可能なシール１０６９が結合された回収要素１０６７が配置されている。破断可能なシール１０６９は、回収要素１０６７の下側部分１０１４に面した側面に結合されている。したがって、破断可能なシール１０６９は、ハウジング１０１０を、第１の貯留部１０２０及び第２の貯留部１０２４の２個の隔離された貯留部に分割する。
プランジャ１０５０は、ハンドル１０５２、シャフト１０５１、及び先端部１０９０を含む。ハンドル１０５２は、上記に述べたように形成することができ、プランジャ１０５０がハンドル１０１０内に過度に深く挿入されることを防止するための、ハウジング１０１０と係合する、必要に応じて用いられるリム１０５４を含むことができる。ハンドル１０５２は、ネジ嵌め又は他の連結手段（例えば、圧入、接着剤）によってシャフト１０５１に対して連結することができる。先端部１０９０は、本明細書で述べる他の先端部の実施形態について述べられるプロセス及び材料を用いて作製することができる。先端部１０９０は、１つ以上のガイド１０８３を含んでよい。それぞれのガイドは、ハウジング１０１０の内部にゆるく嵌まるような寸法に構成され、先端部１０９０がハウジング１０１０を通じて長手方向に動く際に、先端部１０９０の横方向の運動を低減させる機能を有する。
先端部１０９０は、先端部１０９０上の固定位置に保持されたスクレーパー１０８６を更に含む。図の実施形態では、スクレーパー１０８６は、保持部材１０８７によって固定位置に保持される。保持部材１０８７は、先端部１０９０の一部として成形又は機械加工するか、あるいは先端部１０９０に結合されたブラケット又は複数のブラケットからなるものでよい。また、スクレーパー１０８６を先端部１０９０に直接結合する（例えば、接着剤により結合する）こともできる。
スクレーパー１０８６は、ディスク形状をしており、ハウジング１０１０の内部に比較的緊密な嵌合を形成するような寸法である。いくつかの実施形態では、スクレーパーは、Ｏリングを含むことができる。スクレーパー１０８６は、水性の液体に浸漬される際に、その形状をほぼ維持する必要がある。スクレーパーは、ハウジングの内部に比較的緊密な嵌合を形成するような寸法でなければならないが、スクレーパーは、プランジャがハウジング１０１０内の液体試料を通じて押されるにしたがって液体がその縁部を回り込んで流れることができるように比較的可撓性のものでなければならない。スクレーパー１０８６を作製するのに適した材料としては、例えば、ポリウレタンゴムが挙げられる。
使用時には、図１０Ｂに示すように、液体試料１０４０と細胞濃縮剤１０３０は、装置のハウジング１０１０内で接触させられる。プランジャ１０５０がハウジング１０１０内に挿入され、プランジャ１０５０の先端部１０９０がハウジング１０１０の底の方向に押される。先端部１０９０が液体試料１０４０を通過するにしたがって、スクレーパー１０８６によって細胞濃縮剤１０３０がハウジング１０１０の底の方向に押されるのと同時に、液体試料１０４０がスクレーパー１０８６の縁部を回り込んで流れる。有利な点として、この装置によって使用者は、細胞濃縮剤１０３０が重力によってハウジング１０１０の底へと沈降させられる場合に、可能であるよりも大幅に短い時間で細胞濃縮剤１０３０を回収かつ濃縮することができる。更に、可撓性のスクレーパーによって、スクレーパーがなければハウジングの壁に接着し得る細胞濃縮剤１０３０の部分の回収が容易となる。したがって、本発明の装置１０００は、細胞濃縮剤の回収率を高め、これにより微生物を濃縮するために細胞濃縮剤を使用する方法の感度を高める。
細胞濃縮剤が強磁性材料（例えば、粒子）を含む試料調製及び検出装置では、磁石又は電磁石を装置の近傍に配置することによって粒子（及び粒子に結合した微生物）を、粒子を回収し、かつ／又は粒子を別の貯留部に移すための所望の位置に引き寄せることができる点は認識されるはずである。いくつかの実施形態では、細胞濃縮剤が液体試料中の微生物のほぼすべてを結合するだけの充分な時間の後に、磁石を装置の近傍（例えば、装置の底の近傍）に配置することができる。
生きた細胞からの生物学的検体の検出方法：
本開示の方法は、有効量の細胞抽出剤への曝露後に、例えば、生きた微生物などの、生きた細胞から放出される生物学的検体を検出するための方法を含む。
本開示の方法は、試料と細胞抽出剤を含む放出要素とを含む液体混合物を形成することを含む。本開示の方法は、生物学的検体を検出する工程を更に含む。生物学的検体を検出する工程は、試料中の生物学的検体の量を定量することを更に含むことができる。
一態様では、本開示は、試料中の細胞を検出する方法を提供する。本方法は、細胞濃縮剤、細胞抽出剤を含む放出要素、及び液体試料を提供することを含む。好適な細胞濃縮剤が、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１０／０１９０１７１号、発明の名称「ＭＩＣＲＯＯＲＧＡＮＩＳＭ ＣＯＮＣＥＮＴＲＡＴＩＯＮ ＰＲＯＣＥＳＳ」に記載されている。
本方法は、液体試料を細胞濃縮剤と所定の時間にわたって接触させる工程を更に含む。細胞濃縮剤は、粒子、繊維、粒子を含むマトリクス（例えば、繊維状マトリクス）、又は上記の２つ以上のものの任意の組み合わせを含むことができる。細胞濃縮剤は、接触時間の間に液体試料に懸濁することができる。懸濁液は試験管、試験管、フラスコ、ビーカー又は本明細書で述べる検出装置のいずれかのような容器に入れることができる。特定の好ましい実施形態では、液体試料は、例えば、懸濁液を攪拌、ボルテックス、又は振動することによって、所定の時間にわたって細胞濃縮剤と混合される。細胞濃縮剤が液体試料と接触させられている間に、液体試料からの細胞が細胞濃縮剤と結合する。
本方法は、液体試料の少なくとも一部から細胞濃縮剤を分離する工程を更に含む。このプロセスにおいて、細胞濃縮剤を最初の液体試料よりも小さな体積に濃縮することができる。細胞濃縮剤は、様々な手段によって液体試料の少なくとも一部から単離することができる。例えば、細胞濃縮剤が液体試料よりも大きな比重を有する場合、細胞濃縮剤は懸濁液の底に沈降し得る。液体試料の少なくとも一部を除去する（例えば、ピペッティング又はデカンテーションにより）ことができる。これに代えるか、又はこれに加えて、液体試料の少なくとも一部を遠心分離又は濾過によって除去することもできる。
フィルタはその孔径によって（例えば、その泡立ち点の孔径によって）定義することができる。フィルタの泡立ち点の孔径は、一般的にフィルタの孔の最大径の平均である。いくつかの実施形態では、フィルタは、細胞濃縮剤の平均径よりも小さい平均孔径を有することができる。これらの比較的大きな孔径を有するフィルタを利用することができるために、本明細書で開示される方法は、水試料などの試料から微生物を分離するための他の方法と比較した場合に大きな利点を有する。
一実施形態では、フィルタは、少なくとも約１マイクロメートル（μｍ）以上の平均孔径を有することができる。一実施形態では、フィルタは、少なくとも約１．５μｍ以上の平均孔径を有することができる。一実施形態では、フィルタは、少なくとも約５μｍ以上の平均孔径を有することができる。一実施形態では、フィルタは、少なくとも約１０μｍ以上の平均孔径を有することができる。より大きな孔径のフィルタを利用すると、孔径が大きくなるにつれて背圧が低くなるために、試料はより容易かつ迅速に濾過される。
試料の濾過は、公知の方法によって行うことができる。一実施形態では、選択される濾過方法は、その方法の特定の用途の少なくとも一部によって決定され得る。例えば、試料は、重力によって陽圧を作用させることにより、負の真空を用いて濾過することができる。試料を濾過するために使用される特定の方法は、本方法を実行するために利用される装置の種類の少なくとも一部によって決定され得る。例えば、負の真空を利用するためには、装置を真空源に取り付ける、あるいは逆向きに取り付けることができるポートを有するように構成することが可能であり、陽圧を作用させるためには、使用者が手で力を加えることによって陽圧を作用させることができるように装置を構成することが可能である。一実施形態では、試料は、陽圧を作用させることによって濾過することができる。陽圧を利用した（又は重力を利用した）濾過によれば、真空ポンプなどの更なる機器を一切使用することなく、現場で本方法を容易に行うことができるという利点が与えられる。
いくつかの実施形態では、遠心分離工程において、細胞濃縮剤は液体から分離する（例えば、沈降によって）が、細胞濃縮剤に結合しない微生物（例えば、細菌、酵母カビ、胞子）は、液体中に浮遊したままとなるような比較的低速の遠心分離を使用することができる。
必要に応じて、細胞濃縮剤を洗浄液（例えば、水又は緩衝溶液）に再懸濁し、洗浄液の少なくとも一部から細胞濃縮剤を単離することができる。洗浄工程が増殖及び／又は検出プロセスを妨害し得る夾雑物を液体試料から除去する機能を有し得る点は、認識されるであろう。
本方法は、分離された細胞濃縮剤と放出要素とを含む液体混合物を形成することを更に含み、この工程において放出要素から細胞抽出剤が放出される。いくつかの実施形態では、細胞濃縮剤が液体試料の少なくとも一部から分離される際に、細胞濃縮剤が液体の残部に残る。必要に応じて更なる液体（例えば、水又は緩衝溶液）を細胞濃縮剤に加えることができる。細胞濃縮剤が液体試料から濾過される実施形態では、細胞濃縮剤を所定の体積の液体（例えば、水又は緩衝溶液）に再懸濁することができる。細胞濃縮剤を含む液体懸濁液を放出要素と接触させることにより、細胞抽出剤を液体混合物中に放出させる。細胞濃縮剤を回収するためにフィルタを使用する方法では、細胞濃縮剤を含む液体懸濁液がフィルタを含むこともできる。混合物中に細胞が存在する場合に、細胞から生物学的検体を放出させるうえで有効量の細胞抽出剤を放出要素から放出させることができる。有効量の細胞抽出剤の放出は、所定の時間にわたって起こりうる（例えば、最大で数秒間、最大で数分間、最大で数時間、又はそれよりも長時間）。
本方法は、検体を検出する工程を更に含む。生物学的検体の検出では、検出系を使用することができる。ヌクレオチド（例えば、ＡＴＰ、ＮＡＤＨ、ＮＡＤ）、ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）又は酵素（例えば、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、又はアデニル酸キナーゼ）などの特定の生物学的検体の検出系は当該技術分野では周知のものであり、本開示に従って使用することができる。本開示の方法には、生物学的検体を検出するための公知の検出系が含まれる。この検出系の精度及び感度は、細胞抽出剤によって大きく低減されないことが好ましい。検出系は、均一アッセイを含むことがより好ましい。
いくつかの実施形態において、生物学的分析物を検出することは、容器（例えば、試験管、多穴プレート、及び本明細書に記載の検出装置）中の検体を直接検出することを含むことができ、この工程では、試料と細胞抽出剤を含む放出要素とを含む液体混合物が形成される。いくつかの実施形態において、生物学的検体を検出することは、液体混合物の少なくとも一部を、試料と細胞抽出剤を含む放出要素とを含む液体混合物がその中で形成される容器以外の容器に移すことを含むことができる。いくつかの実施形態では、生物学的検体を検出する工程には、例えばｐＨ調整、希釈、濾過、遠心分離、抽出などの１つ以上の試料調製プロセスが含まれてよい。
いくつかの実施形態では、検出系は検出試薬を含む。検出試薬としては、例えば、色素、酵素、酵素基質、結合相手（例えば、抗体、モノクローナル抗体、レクチン、受容体など）、標識された結合相手、及び／又は、補因子が挙げられる。いくつかの実施形態において、検出試薬は、ＰＣＴ国際公開特許ＷＯ ２０１０／０３９６２７号、発明の名称「ＢＩＯＤＥＴＥＣＴＩＯＮ ＡＲＴＩＣＬＥＳ」に記載されるように、酵素又は酵素基質を含むヒドロゲルといったヒドロゲルを含む。いくつかの実施形態では、検出系は、器具を含む。検出器具の非限定的な例としては、分光光度計、ルミノメーター、プレートリーダー、サーモサイクラー、インキュベーターが挙げられる。
検出系は、検出器具を含むことができる。検出器具は、当該技術分野では周知のものであり、比色測定法（即ち、光の吸光度及び／又は散乱により）、蛍光測定法、又は光量測定法によって生物学的検体を検出するために使用することができる。発光による生体分子検出の例は、Ｆ．Ｇｏｒｕｓ及び、Ｅ．Ｓｃｈｒａｍ（Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｂｉｏ−ａｎｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９７９、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．２５：５１２〜５１９）に述べられている。
生物学的検体の検出系の一例としては、ＡＴＰ検出系がある。ＡＴＰ検出系は、酵素（例えば、ルシフェラーゼ）及び酵素基質（例えば、ルシフェリン）を含むことができる。ＡＴＰ検出系は、ルミノメーターを更に含むことができる。いくつかの実施形態では、ルミノメーターには、例えば、ＦＢ−１２シングルチューブ型ルミノメーター（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＵＳＡ，Ｏａｋ Ｒｉｄｇｅ，ＴＮ）のようなベンチトップ型のルミノメーターを含むことができる。いくつかの実施形態において、照度計は、例えば、３Ｍ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ）から入手可能な、ＮＧ照度計、ＵＮＧ２又はＵＮＧ３などの小型照度計を含むことができる。
いくつかの実施形態では、生物学的検体は、単一の時点において検出される。いくつかの実施形態では、生物学的検体は、２つ以上の時点において検出される。２つ以上の時点で生物学的検体が検出される場合、第１の時点（例えば、試料の少なくとも一部の生きた細胞から生物学的検体を放出させるうえで有効量の細胞抽出剤が放出要素から放出される前）において検出された生物学的検体の量を、第２の時点（例えば、試料の少なくとも一部の生きた細胞から生物学的検体を放出させるうえで有効量の細胞抽出剤が放出要素から放出された後）において検出された生物学的検体の量と比較することができる。いくつかの実施形態では、１つ以上の時点における生物学的検体の測定は、処理装置を備えた器具によって行われる。特定の好ましい実施形態では、第１の時点における生物学的検体の量と、第２の時点における生物学的検体の量との比較は処理装置によって行われる。
例えば、操作者は、試料と、細胞抽出剤を含む放出要素とを含む液体混合物を形成した後の試料において、生物学的分析物の量を測定する。この第１の測定における生物学的検体の量（Ｔ１）は、「遊離した」（即ち、非細胞性）生物学的検体、及び／又は、試料中の非生存細胞からの生物学的検体の存在を示すことができる。いくつかの実施形態において、第１の測定は、試料と細胞抽出剤を含む放出要素とを含む液体混合物が形成された直後（例えば、約１秒後）に行うことができる。いくつかの実施形態において、第一測定は、試料と細胞抽出剤を含む放出要素とを含む液体混合物を形成してから少なくとも約５秒後、少なくとも約１０秒後、少なくとも約２０秒後、少なくとも約３０秒後、少なくとも約４０秒後、少なくとも約６０秒後、少なくとも約８０秒後、少なくとも約１００秒後、少なくとも約１２０秒後、少なくとも約１５０秒後、少なくとも約１８０秒後、少なくとも約２４０秒後、少なくとも約５分後、少なくとも約１０分後、少なくとも約２０分後に行うことができる。これらの時間は例示的なものであり、生物学的検体の検出が開始されるまでの時間のみを挙げたものである。生物学的検体の検出を開始することには、試料を希釈すること、及び／又は細胞抽出剤の活性を阻害する試薬を添加することが含まれる。特定の検出系（例えば、核酸の増幅又はＥＬＩＳＡ）は、通常、完了までに数分〜数時間を要する点は認識されるであろう。
操作者は、生物学的検体の第１の測定を行った後、細胞抽出剤を含む放出要素に試料を所定の時間にわたって接触させる。試料を一定時間放出要素と接触させた後、生物学的分析物の第２の測定が行われる。いくつかの実施形態では、第２の測定は、生物学的検体の第１の測定後の約０．５秒以内、約１秒以内、約５秒以内、約１０秒以内、約２０秒以内、約３０秒以内、約４０秒以内、約６０秒以内、約９０秒以内、約１２０秒以内、約１８０秒以内、約３００秒、少なくとも約１０分、少なくとも約２０分、少なくとも約６０分以内、又はそれ以降に行うことができる。これらの時間は例示的なものであり、生物学的検体を検出するための第１の測定が開始されてから生物学的検体を検出するための第２の測定が開始されるまでの時間間隔のみを挙げたものである。生物学的検体の検出を開始することには、試料を希釈すること、及び／又は細胞抽出剤の活性を阻害する試薬を添加することが含まれる。
好ましくは、生物学的検体の第１の測定は、試料と細胞抽出剤を含む放出要素とを含む液体混合物が形成された約１秒後〜約２４０秒後に行われ、第１の測定の後に行われる第２の測定は、液体混合物が形成された約１．５秒後〜約５４０秒後に行われる。より好ましくは、生物学的検体の第１の測定は、液体混合物が形成されてから約１秒後〜約１８０秒後に行われ、第１の測定の後に行われる第２の測定は、液体混合物が形成されてから約１．５秒後〜約１２０秒後に行われる。最も好ましくは、生物学的検体の第１の測定は、液体混合物が形成されてから約１秒後〜約５秒後に行われ、第１の測定の後に行われる第２の測定は、液体混合物が形成されてから約１．５秒後〜約１０秒後に行われる。
操作者は、第１の測定において検出された生物学的検体の量を、第２の測定において検出された生物学的検体の量と比較する。第２の測定において検出された生物学的検体の量が増加している場合、試料中に１つ以上の生きた細胞が存在することを示す。
特定の方法では、生きた体細胞（例えば、非微生物細胞）の存在を検出することが望ましい場合がある。これらの実施形態では、放出要素は、体細胞から生物学的検体を選択的に放出させる細胞抽出剤を含む。体細胞の抽出剤の非限定的な例としては、これらに限定されるものではないが、例えば、エトキシル化オクチルフェノールであるＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（ＴＸ−１００）及びその他のエトキシル化アルキルフェノールを含む非イオン性エトキシル化アルキルフェノールなどの非イオン性洗剤；例えば、カルボキシプロピルベタイン（ＣＢ−１８）、ＮＰ−４０、ＴＷＥＥＮ、タージトール、イゲパール、市販のＭ−ＮＲＳ（Ｃｅｌｓｉｓ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ））、Ｍ−ＰＥＲ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）、ＣｅｌＬｙｔｉｃ Ｍ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）などのベタイン洗剤が挙げられる。細胞抽出剤は、検体及びその検出試薬を不活性化しないように選択されることが好ましい。
特定の方法では、生きた微生物細胞の存在を検出することが望ましい場合がある。これらの実施形態において、放出要素は、微生物細胞から生物学的分析物を選択的に放出させる細胞抽出剤を含むことができる。微生物細胞抽出剤の非限定的な例には、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、「セトリミド」（ドデシル−、テトラデシル−、及びヘキサデシル−臭化トリメチルアンモニウムの混合物）、塩化セチルピリジウムなどの四級アンモニウム化合物；トリエチルアミン（ＴＥＡ）及びトリエタノールアミン（ＴｅｏｌＡ）などのアミン；クロルヘキシジン、アレキシジン及びポリヘキサメチレンビグアニドなどのビス−ビグアニド；Ｎ−（ｎ−ドデシル）−ジエタノールアミンなどのジアルキルアンモニウム塩；ポリミキシンＢ（例えば、ポリミキシンＢ１及びポリミキシンＢ２）、ポリミキシン−β−ノナペプチド（ＰＭＢＮ）などの抗生物質；オクチル−β−Ｄ−１−チオグルコピラノシド（本明細書にその全容を援用する米国特許第６，１７４，７０４号を参照）などのアルキルグルコシド又はアルキルチオグルコシド；エトキシル化オクチルフェノールであるＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（ＴＸ−１００）及びその他のエトキシル化アルキルフェノール類を含むがこれらに限定されない非イオン性エトキシル化アルキルフェノールなどの非イオン性洗剤；カルボキシプロピルベタイン（ＣＢ−１８）などのベタイン洗剤；並びに、ポリリシン、ナイシン、マガイニン、メリチン、ホスホリパーゼＡ２、ホスホリパーゼＡ２活性化ペプチド（ＰＬＡＰ）などのカチオン性、抗細菌性、孔形成性、膜活性、及び／又は細胞壁活性であるポリマー；バクテリオファージ；並びにこれらに類するものが挙げられる。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、イオン性界面活性化合物を開示するＭｏｒｂｅら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．（１９９７）ｖｏｌ．１５２，ｐｐ．３８５〜３９４、及び米国特許第４，３０３，７５２号を参照されたい。細胞抽出剤は、生物学的検体、及び／又は生物学的検体を検出するために使用される検出試薬を不活性化しないように選択されることが好ましい。
試料中の生きた微生物細胞の存在を検出するための特定の代替的方法では、試料を所定の時間にわたって体細胞抽出剤で前処理することができる（例えば、試料と、微生物細胞抽出剤を含む放出要素とを含む液体混合物を形成する前に、体細胞を抽出するうえで充分な時間にわたって試料を体細胞抽出剤と接触させる）。この代替的な実施形態では、第１の測定において検出される生物学的検体の量には、体細胞から放出されたすべての生物学的検体が含まれ、第２の測定で検出される更なる生物学的検体（検出される場合）の量には、試料中の生きた微生物細胞からの生物学的検体が含まれることになる。
試料中の微生物の存在を検出するための方法では、本明細書で開示される検出装置を使用することができる。特定の実施形態では、本方法は、ｉ）試料、ｉｉ）第１及び第２の貯留部を備えたハウジングと試料を受容するように構成された開口部とを備える検出物品、ｉｉｉ）細胞濃縮剤、及び、ｉｖ）細胞濃縮剤を隔離して、ハウジングの第１の（例えば、上側）貯留部から第２の（例えば、下側）貯留部へと移動させるための手段、及び、ｖ）細胞抽出剤を含む放出要素を提供することを含む。これらの実施形態では、検出装置は、図１〜４に示される検出装置１００、２００、３００、又は４００のいずれか１つのものを含むことができる。任意に、検出装置は、細胞濃縮剤及び／又は放出要素を含むことができる。
本方法は、ハウジングの第１の貯留部内に試料を移動させることを更に含み、この工程では液体媒質中で試料物質を細胞濃縮剤と接触させる。試料は、ハウジングの第１の貯留部に移動させられる液体、固体、半固体、又はこれらの組み合わせを含むことができる。試料が液体媒質を含んでいない場合には、液体媒質（例えば、水又は緩衝溶液）を第１の貯留部に加えることができる。細胞濃縮剤を液体試料に加える。細胞濃縮剤を、所定の時間にわたって液体試料と接触させる。必要に応じて、ハウジングを例えば振盪、攪拌、ボルテックス、及び／又は振動することによって、接触時間の間に混合物を混合することができる。試料及び／又は細胞濃縮剤の損失を防止するために、ハウジングは接触時間の間、閉鎖される（例えば、必要に応じて用いられるキャップによって）ことが好ましい。
方法は、液体媒質の少なくとも一部から細胞濃縮剤を隔離することを更に含み、細胞濃縮剤を隔離する工程は、細胞濃縮剤をハウジングの第２の貯留部に移動させることを含む。本明細書で述べるように、細胞濃縮剤を隔離するためのそれぞれの種の手段がある。細胞濃縮剤を隔離及び移動するための手段の非限定的な例には、プランジャを用いて通路を通じて細胞濃縮剤を分割及び移動すること（図１及び２を参照）、一方向弁のキャビティ内に細胞濃縮剤を回収及び移動すること（図３を参照）、並びに、ドレーン弁及びプランジャを用いて細胞濃縮剤を濃縮及び移動すること（図４を参照）が含まれる。
本方法は、分離された細胞濃縮剤と放出要素とを含む液体混合物を形成することを更に含み、細胞抽出剤は、混合物中に放出される。細胞濃縮剤を含む液体混合物は、細胞抽出剤を含む放出要素と接触させられる。放出要素（例えば、ヒドロゲルビーズ）は、ハウジングの第１の貯留部及び／又は第２の貯留部内の液体混合物と接触させられることができる。いくつかの実施形態では、ハウジングの第２の貯留部は放出要素を含み（図１及び図３参照）、混合物が第２の貯留部の中に移動したときに、液体混合物は放出要素と接触させられる。いくつかの実施形態において、放出要素は第３の貯留部内に配置され（図２及び図４を参照）、液体試料が第１の貯留部から第２の貯留部に移される際に、第３の貯留部を液体試料が通過する（これにより液体試料が放出要素と接触する）。
図２及び図４では、破断可能なシールに穿孔して細胞濃縮剤を第２の貯留部に移動させるためのプランジャの使用が示されているが、プランジャの代わりに代替的な器具（例えば、スワブ、ピペット、フィルタなど）を使用することも可能であることが認識される。このような代替的な器具が使用される方法では、破断可能なシールが代替的器具によって穿孔される際に液体試料の全体が第２の貯留部に移されないように、液体試料の少なくとも一部を除去する（例えば、デカンテーション、ピペッティング、濾過により又はドレーン弁が設けられている場合にはドレーン弁を開放することにより）ことが好ましい。
本方法は、生物学的検体を検出する工程を更に含む。生物学的検体は、放出要素から有効量の細胞抽出剤が細胞濃縮剤を含む液体混合物中に放出される前に、検出装置の第２の貯留部内で、本明細書で記載されるように、検出することができる。生物学的検体は、放出要素から有効量の細胞抽出剤が細胞濃縮剤を含む液体混合物中に放出された後で、検出装置の第２の貯留部内で、本明細書で記載されるように、検出することができる。生物学的検体は、放出要素から有効量の細胞抽出剤が細胞濃縮剤を含む液体混合物中に放出される前及び後で、検出装置の第２の貯留部内で、本明細書で記載されるように、検出することができる。
本明細書で開示される方法のいずれも、生物学的な増殖工程を更に含むことができることは予想されることである。増殖工程は、微生物の増殖を支持する栄養培地を与えることによって促進される。栄養培地は、細胞濃縮剤による微生物の濃縮の前、その間、又はその後に試料と混合することができる。いくつかの実施形態では、生物学的増殖工程は、細胞濃縮剤によって微生物が濃縮された後であるが、生物学的検体が検出される前に行われる。いくつかの実施形態では、栄養培地は、試料中に存在し得る他の微生物よりも特定の種類の微生物の増殖にとって有利な栄養素及び／又は選択物質（例えば、塩、抗生物質）を含有してよい。
粒子状細胞濃縮剤を濃縮する方法：
本開示は、粒子状の細胞濃縮剤を濃縮するための装置を提供する。本方法は、液体試料の一部を液体試料中への粒子状物質の懸濁液から分離する装置を提供する工程を含む。好適な装置としては、例えば、図２Ａ、図３Ａ、図４Ａ、図５Ａ、図７Ａ、及び図１０Ａに図示及び説明される装置が挙げられる。それぞれの装置は、粒子状の細胞濃縮剤を含む液体試料を収容するためのハウジングと粒子状細胞濃縮剤を液体試料の少なくとも一部から分離するための手段とを含む。
図２Ａでは、粒子状細胞濃縮剤を分離するための手段は、テーパ領域２１８、及び下側シール２５６を含むプランジャを含む。図３Ａでは、粒子状細胞濃縮剤を分離するための手段は、行き止まり弁３７０及び弁アクチュエータ３７２を含む。図４Ａでは、粒子状細胞濃縮剤を分離するための手段は、ドレーン弁４８０及び弁ゲート４８２を含む。図５Ａ及び７Ａでは、粒子状細胞濃縮剤を分離するための手段は、フィルタ５９６が内部に配置された流体経路を含むプランジャを含む。図１０Ａでは、粒子状細胞濃縮剤を分離するための手段は、スクレーパーの縁部とハウジングとの間で液体を通過させるように構成されたスクレーパーを備えるプランジャを含む。
本方法は、液体試料中への粒子状細胞濃縮剤の懸濁液を形成する工程を更に含む。懸濁液は、ハウジング内において形成するか、あるいはハウジングの外部で形成することができる。懸濁液がハウジングの外部で形成される場合、本方法は、ハウジング内に懸濁液を移動する工程を更に含む。本方法は、微生物を捕捉するだけの充分な時間にわたって、粒子状細胞濃縮剤を液体試料と接触させる工程を更に含む。接触は、ハウジング内で起こってよい。接触は、ハウジングの外部で起こってよい。接触は、ハウジングの外部及び内部の両方で起こってよい。本方法は、図２Ａ、３Ａ、４Ａ、５Ａ、７Ａ及び１０Ａの装置について上記に述べたように、液体試料中への粒子状物質の懸濁液から液体試料の一部を分離する工程を更に含む。
試料の調製及び検出キット：
本開示の構成要素及び／又は装置は、使用説明書及び必要に応じて付属物品又は試薬とともにパッケージングすることによって、試料の調製及び検出キットとすることができる。したがって、一態様において、本開示は、ｉ）少なくとも２個の貯留部を含み、その間に通路を有するハウジングと、ｉｉ）ハウジングの第１の貯留部を第２の貯留部から隔離するための手段と、ｉｉｉ）細胞濃縮剤と、ｉｖ）細胞濃縮剤を第１の貯留部から第２の貯留部に移動させるための手段とを備えるキットを提供する。第１の貯留部は、試料を受容するように構成された開口部を含む。第２の貯留部は、その内部に配置された検出試薬を含む。いくつかの実施形態において、ハウジングは、本明細書で記載されるように、第１の貯留部を第２の貯留部から隔離するための手段を更に含むことができる。いくつかの実施形態において、ハウジングは、細胞濃縮剤を第１の貯留部から第２の貯留部に移動させるための手段を更に含むことができる。いくつかの実施形態において、細胞濃縮剤は、ハウジングの第１の貯留部の中に配置される。
いくつかの実施形態では、本開示のキットには、試料調製及び検出装置とともに使用することができる付属物品及び試薬を含む。付属物品の非限定的な例としては、試料取得装置、フィルタ、グローブ、培養装置（例えば、ペトリ皿、培養試験管、３Ｍ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ）より入手されるＰＥＴＲＩＦＩＬＭプレートなど）、核酸の単離又は増幅試薬、ラテラルフロー装置、ＥＬＩＳＡプレート及び試薬などの免疫アッセイ装置、又は上記の物品の２つ以上のものの任意の組み合わせが挙げられる。付属試薬の非限定的な例としては、水、緩衝剤、指示薬（例えば、ｐＨ指示薬）、色素、体細胞抽出剤、細胞抽出剤を含む放出要素、本明細書で記載されるような結合パートナー、酵素、酵素基質、オリゴヌクレオチド、対照試料、又は上記の試薬の２つ以上のものの任意の組み合わせが挙げられる。
ここで、本発明について、実施できる説明を行うために、本発明者が予見するいくつかの特定の実施形態を説明している。本発明の想像上の修正形態がそれでもなお、現在は予見されない修正形態を含めて、それらの等価物をなし得る。したがって、本発明の範囲は、本明細書に記載した細部及び構造によってではなく、以下の「特許請求の範囲」及びその等価物によってのみ限定されるべきである。
材料：
細菌培養は、特に断らないかぎり、すべてＴｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）より入手した。
水はすべて、特に指定のない限り、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）より販売されるＭｉｌｌｉ−Ｑ（商標）勾配脱イオンシステムを使用して１８メガオームの滅菌脱イオン水として入手した。
ＣＭ−１１１：球状化された非晶質ケイ酸マグネシウム：マイクロスフェアを３Ｍ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ）より販売される３Ｍ（商標）Ｃｏｓｍｅｔｉｃ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ ＣＭ１１１として入手した。粒子は、２．３ｇ／ｃｃの粒子密度を有する中実の球として成形したものであり、約３．３ｍ２／ｇの表面積を有していた。粒子の９９％は、約１１マイクロメートル未満であった。粒子の５０％は、約５マイクロメートル未満であった。粒子の１０％は、約２マイクロメートル未満であった。ＣＭ−１１１マイクロスフェアは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２００９年１２月２２日出願の米国特許出願第６１／２８９，２１３号、発明の名称「ＭＩＣＲＯＯＲＧＡＮＩＳＭ ＣＯＮＣＥＮＴＲＡＴＩＯＮ ＰＲＯＣＥＳＳ ＡＮＤ ＣＯＮＣＥＮＴＲＡＴＩＯＮ ＡＧＥＮＴ ＦＯＲ ＵＳＥ ＴＨＥＲＥＩＮ」に述べられるようにして調製した。
５００ｍＭのＫＣｌ、１００ｍＭのＣａＣｌ２、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、及び１００ｍＭのＫ２ＨＰＯ４を含むｐＨ ７．２の１００倍の吸着緩衝液を調製し、使用前にフィルタ滅菌した。
表面を滅菌したそれぞれの構成要素を、７０％イソプロピルアルコールと接触させた（イソプロピルアルコールで拭くか又はイソプロピルアルコールに浸漬した）。余分なアルコールを流れ落とし、それぞれの構成要素を使用前に少なくとも３０分間風乾した。
化学物質はすべて、特に断らないかぎり、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）より入手した。
（実施例１）
ヒドロゲルの重合後のヒドロゲルビーズへの細胞抽出剤の取り込み
国際特許出願公開第２００７／１４６７２２の実施例１に述べられるようにしてヒドロゲルビーズを調製した。国際特許出願公開２００７／１４６７２２の実施例１９に述べられるようにして乾燥させた後、実施例２３に述べられるようにして活性溶液中に浸漬することによって活性ビーズを調製した。１ｇのビーズを６０℃で２時間乾燥させて、ビーズから水を除去した。乾燥したビーズを２ｇのＢＡＲＤＡＣ ２０５Ｍ（Ｌｏｎｚａ Ｇｒｏｕｐ Ｌｔｄ．（Ｖａｌａｉｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））の５０％（ｗ／ｖ）水溶液中に少なくとも３時間〜一晩、室温で浸漬した。浸漬後、ビーズをブフナー漏斗に注いでビーズの水分を切り、次いで１０〜２０ｍＬの蒸留水ですすいだ。ペーパータオルを押し付けることによって余分な水をビーズ表面から除去した。使用する前に、ビーズを室温で少なくとも２週間、ジャーに保存した。
（実施例２）
微小粒子の使用による細胞濃縮、並びに細胞抽出剤を充填したヒドロゲル及びＡＴＰ生物発光を利用した検出
３Ｍ（商標）ＣＬＥＡＮ−ＴＲＡＣＥ表面ＡＴＰシステムを３Ｍ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ）より入手した。大腸菌ＡＴＣＣ ５１１８３の純粋培養物をトリプシン処理した大豆ブロス中に植菌して、３７℃で一晩増殖させた。細菌培養物をＢｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ緩衝液（ｐＨ ７．２±０．２；リン酸二水素カリウム緩衝液；ＶＷＲ，Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）中で約１０６又は１０５ＣＦＵ／ｍＬに希釈する。
「捕捉」反応（表１）では、１００マイクロリットルの希釈細菌懸濁液を、１０ｍＬの脱イオン水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ Ｂｉｏｃｅｌ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＭＡ）試料の入った個々の試験管に直接加えて、それぞれ１０ｍＬ中に約１０５ＣＦＵ又は１０４ＣＦＵを得た。１０ｍｇのオートクレーブしたＣＭ−１１１ ３Ｍ（商標）Ｃｏｓｍｅｔｉｃ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ（か焼した非晶質の球状化ケイ酸マグネシウム粉末、３Ｍ Ｃｏｍｐａｎｙ；Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ）を細胞の入った試験管に加え、室温で約１５分間混合した。粒子を沈降させ、上清を除去した。粒子を１００μＬのＢｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ緩衝液に懸濁し、１．５ｍＬの微量遠心管に移した。４００マイクロリットルのＣＬＥＡＮ−ＴＲＡＣＥ表面ＡＴＰシステムからのルシフェラーゼ／ルシフェリン液体試薬溶液を遠心管に加えた。
コントロール反応（対照、表１）として、１００μＬの約１０６又は１０５ＣＦＵ／ｍＬの細胞懸濁液を１．５ｍＬの微小遠心管に加え、４００μＬのＣＬＥＡＮ−ＴＲＡＣＥ表面ＡＴＰシステムからのルシフェラーゼ／ルシフェリン液体試薬溶液を遠心管に加えた。試薬を加えた直後に、細胞抽出剤を含むヒドロゲルビーズ（約１１ｍｇ）を個々の遠心管に加え、相対発光量（ＲＬＵ）の測定値をベンチトップ型ルミノメーター（Ｔｕｒｎｅｒ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）より販売される２０／２０ｎシングルチューブ型ルミノメーター）で１０秒間隔で記録した。発光量の測定値は、ルミノメーターとともに提供される２０／２０ｎ ＳＩＳソフトウェアを使用してルミノメーターから得た。光信号を１秒間にわたって積分し、ＲＬＵで表される結果を表１に示した。
データは、同様の数の非希釈細胞とのコントロール反応と比較した場合、本明細書に記載のプロトコルを使用すると、微小粒子は、細胞を捕捉することができ、ヒドロゲルビーズから放出された細胞抽出剤は、より大きな（１０ｍＬ）容積に希釈された微生物細胞からＡＴＰの約半分を抽出することができたことを示している。この結果は、細胞から放出されたＡＴＰがＡＴＰ検出試薬と反応し、測定可能な生物発光を生じたことを更に示している。
（実施例３）
ＡＴＰ生物発光検出系を利用した一体型試料調製及び検出装置による微生物細胞の検出
この実施例では、図２に示されるような一体型の試料調製及び検出装置２００を使用する。装置は、第１の貯留部２２０に約１０ｍｇのオートクレーブしたＣＭ−１１１ ３Ｍ Ｃｏｓｍｅｔｉｃ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓを備える。第２の貯留部２２４は、約０．６ミリリットルのＣＬＥＡＮ−ＴＲＡＣＥ表面ＡＴＰシステムからのルシフェラーゼ／ルシフェリン液体試薬溶液からなる液体検出試薬２６５を備える。第３の貯留部２２６は、ＰＣＴ国際公開特許ＷＯ ２０１０／０３９６２７の調製例５に従って作製された２つのＢＡＲＤＡＣ ２０５Ｍビーズを備える。１０ミリリットルの滅菌脱イオン水を、使用直前に一体型装置２００の第１の貯留部２２０に加える。
大腸菌の一晩培養物を実施例２で述べたようにして調製する。この細菌培養物を、Ｂｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ緩衝液中で約１０６又は１０５ＣＦＵ／ｍＬに希釈する。１００マイクロリットルの希釈懸濁液を一体型装置２００の上側貯留部２２０に直接ピペットで加えることによって、それぞれ１０ミリリットル中に約１０５ＣＦＵ又は１０４ＣＦＵの懸濁液を得る。キャップ２７８を使用してハウジング２１０を閉鎖し、細菌懸濁液を室温でマイクロスフェア（細胞濃縮剤２３０）と混合して通路２１６内に沈降させる。キャップ２７８を外して、プランジャ２５０を挿入することにより沈降したマイクロスフェアを含む液体試料の部分及びヒドロゲルビーズをＡＴＰ検出試薬の入った第２の貯留部２２４内に移す。一体型装置を直ちにルミノメーター（例えば、ＮＧルミノメーターＵＮＧ２）の読み取りチャンバに挿入し、ＵＮＧルミノメーターの非計画試験モードを用いてＲＬＵ測定値を１０秒間隔で記録する。ＲＬＵ測定値をＲＬＵの数がプラトーに達するまで収集する。データをＮＧルミノミーターとともに提供されるソフトウェアを使用してダウンロードする。このデータは、微生物細胞がマイクロスフェアによって濃縮され、ヒドロゲルによって細胞抽出剤が放出され、この細胞抽出剤が細胞からのＡＴＰの放出を引き起こし、かつ細胞から放出されたＡＴＰがＡＴＰ検出系によって検出されることを示すものである。
（実施例４）
ＡＴＰ生物発光検出系を利用した一体型試料調製及び検出装置による微生物細胞の検出
この実施例では、図３に示されるような一体型試料調製及び検出装置３００を使用する。弁アクチュエータ３７２は、使用に先だって、弁キャビティ３７４が第１の貯留部３２０と流体連通するように配置されている。装置は、第１の貯留部３２０に約１０ｍｇのオートクレーブしたＣＭ−１１１ ３Ｍ Ｃｏｓｍｅｔｉｃ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓを備える。第２の貯留部３２４は、約０．６ミリリットルのＣＬＥＡＮ−ＴＲＡＣＥ表面ＡＴＰシステムからのルシフェラーゼ／ルシフェリン液体試薬溶液からなる液体検出試薬３６５を備える。ＢＡＲＤＡＣ ２０５Ｍビーズは、ＰＣＴ国際公開特許ＷＯ ２０１０／０３９６２７の調製例５に従って作製される。１０ミリリットルの滅菌脱イオン水を、使用直前に一体型装置３００の第１の貯留部３２０に加える。
大腸菌の一晩培養物を実施例２で述べたようにして調製する。この細菌培養物を、Ｂｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ緩衝液中で約１０６又は１０５ＣＦＵ／ｍＬに希釈する。１００マイクロリットルの希釈懸濁液を一体型装置３００の上側貯留部３２０に直接ピペットで加えることによって、それぞれ１０ミリリットル中に約１０５ＣＦＵ又は１０４ＣＦＵの懸濁液を得る。キャップ３７８を使用してハウジング３１０を閉鎖し、細菌懸濁液を室温でマイクロスフェア（細胞濃縮剤３３０）と混合して弁キャビティ３７４内に沈降させる。キャップ３７８を外して、２個のＢＡＲＤＡＣ ２０５Ｍビーズ（放出要素３６２）をハウジング３１０の中に落とす。ビーズが弁キャビティ３７４内に沈降した直後に、弁アクチュエータ３７２を回して弁キャビティ内の液体試料の部分（細胞濃縮剤３３０及び放出要素３６２を含む）をＡＴＰ検出試薬の入った第２の貯留部３２４内に移す。一体型装置を直ちにルミノメーター（例えば、ＮＧルミノメーターＵＮＧ２）の読み取りチャンバに挿入し、ＵＮＧルミノメーターの非計画試験モードを用いてＲＬＵ測定値を１０秒間隔で記録する。ＲＬＵ測定値をＲＬＵの数がプラトーに達するまで収集する。データをＮＧルミノミーターとともに提供されるソフトウェアを使用してダウンロードする。このデータは、微生物細胞がマイクロスフェアによって濃縮され、放出要素によって細胞抽出剤が放出され、この細胞抽出剤が細胞からのＡＴＰの放出を引き起こし、かつ細胞から放出されたＡＴＰがＡＴＰ検出系によって検出されることを示すものである。
（実施例５）
検出装置の調製：
Ｉ型の装置：これらの検出装置では、以下に述べる相違点を有する以外は図１０Ａのハウジングと同様のハウジングを構成した。以下の参照符合は、図１０Ａの対応する部材を示す。ハウジング１１００の上側部分１０１２及び下側部分１０１４は、３Ｍ Ｃｌｅａｎ−Ｔｒａｃｅ（商標）表面ＡＴＰ試験（３Ｍ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｂｒｉｄｇｅｎｄ，ＵＫ）から入手）から類似構成要素を使用して得た。破断可能なシール１０６８が結合された回収要素１０６７を、下側部分１０１４の上側部分に、破断可能なシール１０６８がハウジング１１００の下側部分１０１４に面するようにして圧入した。上側部分１０１２は、ヒートガン（Ｍａｓｔｅｒ Ａｐｐｌｉａｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ，Ｒａｃｉｎｅ，ＷＩ）を使用してｂｕｙｈｅａｔｓｈｒｉｎｋ．ｃｏｍより入手した、３：１ポリオレフィン２重壁の接着剤でライニングされた熱収縮フィルム（部品番号＿ＨＳＣ３Ａ−０５０−ｃｃ、直径１．５ｃｍ）の２ｃｍの切片を用いて下側部分１０１４と連結した。
これらの検出装置では、図２Ａのプランジャと同様のプランジャを構成した。以下の参照符合は、図２Ａの対応する部材を示す。３Ｍ Ｃｌｅａｎ−Ｔｒａｃｅ（商標）表面ＡＴＰ試験からのポリオレフィン製プラスチックハンドル（２５２）の一部、真鍮製金属シャフト（２５１）及びアセタール製穿孔部材２５９を用いてプランジャ（２５０）を組み立てた。ハンドル２５２及び穿孔部材２５９は、ネジによる連結によって真鍮シャフトの両端に取り付けた。真鍮製金属シャフトは、長さ１１．５ｃｍ及び直径３．９ｍｍであった。旋盤を使用してシャフトの両端に６ｍｍの６〜２３のネジ山を切った。穿孔部材２５９は、１０インチ（２５．４ｃｍ）のサウスベンド旋盤を使用して１／２インチ（１２．７ｍｍ）のアセタールコポリマーロッド（部品番号８４９７Ｋ２１１、ＭｃＭＡＳＴＥＲ−ＣＡＲＲ（Ｓａｎｔａ Ｆｅ Ｓｐｒｉｎｇｓ，ＣＡ）より入手）から作製した。下側シール２５６としてＯリング（ＭｃＭＡＳＴＥＲ−ＣＡＲＲより入手したＢｕｎａ Ｎ ＡＳ５６８Ａ−０１０）を使用し、プランジャ２５０の穿孔端２５９の約１１．５ｍｍ上に取り付けた。プランジャは、１回の使用毎に表面を滅菌した。
ＩＩ型の装置：これらの検出装置は、図６Ａに示されるものと同様の先端部を有する図５Ａで図示及び説明したものと同様のプランジャを使用して組み立てた。ハウジングは、Ｉ型の装置について述べたのと同様に構成した。プランジャの先端部は、１０インチ（２５．４ｃｍ）のサウスベンド旋盤を使用して１／２インチ（１２．７ｍｍ）のアセタールコポリマー製ロッド（部品番号８４９７Ｋ２１１、ＭｃＭＡＳＴＥＲ−ＣＡＲＲ（Ｓａｎｔａ Ｆｅ Ｓｐｒｉｎｇｓ，ＣＡ）より入手）から作製した。ダックビル型一方向弁及びプラスチック製保持ワッシャを、プランジャの先端部の本体の陥凹した開口部内にプレス嵌めした。フィルタは、ＰＯＲＥＸフィルタ（Ｐｏｒｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｆａｉｒｂｕｒｎ，ＧＡ）より入手される部品番号Ｘ６８５４）を図６Ａに示される形状に機械加工し、一端を先端部の陥凹した開口部に圧入し、弁及び保持ワッシャを定位置に保持するような寸法に形成することによって作製した。プランジャは、１回の使用毎に表面を滅菌した。
ＩＩＩ型の装置：以下に述べる相違点を有する以外は図１０Ａに示されるものと同様の検出装置を構成した。以下の参照符合は、図１０Ａの対応する部材を示す。ハウジング１１００の上側部分１０１２及び下側部分１０１４は、３Ｍ Ｃｌｅａｎ−Ｔｒａｃｅ（商標）表面ＡＴＰ試験（３Ｍ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｂｒｉｄｇｅｎｄ，ＵＫ）から入手）から類似構成要素を使用して得た。破断可能なシール１０６８が結合された回収要素１０６７を、下側部分１０１４の上側部分に、破断可能なシール１０６８がハウジング１１００の下側部分１０１４に面するようにして圧入した。上側部分１０１２は、ヒートガン（Ｍａｓｔｅｒ Ａｐｐｌｉａｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ，Ｒａｃｉｎｅ，ＷＩ）を使用してｂｕｙｈｅａｔｓｈｒｉｎｋ．ｃｏｍより入手した、３：１ポリオレフィン２重壁の接着剤でライニングされた熱収縮フィルム（部品番号＿ＨＳＣ３Ａ−０５０−ｃｃ、直径１．５ｃｍ）の２ｃｍの切片を用いて下側部分１０１４と連結した。
３Ｍ Ｃｌｅａｎ−Ｔｒａｃｅ（商標）表面ＡＴＰ試験からのポリオレフィン製プラスチックハンドル（１０５２）の一部、真鍮製金属シャフト（１０５１）及び先端部１０９０を用いてプランジャ（１０５０）を組み立てた。ハンドル１０５２及び先端部１０９０は、ネジによる連結によって真鍮シャフトの両端に取り付けた。真鍮製金属シャフトは、長さ１１．５ｃｍ及び直径３．９ｍｍであった。旋盤を使用してシャフトの両端に６ｍｍの６〜２３のネジ山を切った。先端部１０９０は、１０インチ（２５．４ｃｍ）のサウスベンド旋盤を使用して１／２インチ（１２．７ｍｍ）のアセタールコポリマー製ロッド（部品番号８４９７Ｋ２１１、ＭｃＭＡＳＴＥＲ−ＣＡＲＲ（Ｓａｎｔａ Ｆｅ Ｓｐｒｉｎｇｓ，ＣＡ））より入手）から作製した。Ｏリング１０８６を先端部１０９０に取り付けた。先端部は、図１０に示されるような保持部材１０８７を含むように機械加工した。厚さ１ｍｍのポリウレタンゴムの小片を打抜き、これを保持部材１０８７内に滑り込ませることによってスクレーパーを構成した。スクレーパー１０８６の外径は、ハウジング１０１０の内側に緊密に嵌合するような寸法に構成した。プランジャは、１回の使用毎に表面を滅菌した。
（実施例６）
Ｉ型装置を使用した、スパイク水からの粒子状濃縮剤による大腸菌の捕捉
トリプシン処理大豆寒天プレート（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ）から単離した大腸菌（ＡＴＣＣ ５１８１３）の単離されたコロニーを使用して５ｍＬのトリプシン処理大豆ブロス（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ）に植菌し、３７℃のインキュベーター内で一晩インキュベートした。約１０９個のコロニー形成単位／ｍＬ（ＣＦＵ／ｍＬ）を含む一晩培養物をフィルタ滅菌した１８メガオームの水で１：１０，０００に希釈した（約１０５ＣＦＵ／ｍＬにまで、以後、「初期希釈懸濁液」と呼ぶ）。５００マイクロリットルの希釈培養液を５０ｍＬのフィルタ滅菌した１８メガオームの水に移し、約１０００個／ｍＬの最終濃度とした。
１００倍の吸着緩衝液（ｐＨ ７．２）の一定分量（０．５ｍＬ）を、上記の５０ｍＬの希釈した大腸菌懸濁液に加えた（以後、「スパイク水試料」と呼ぶ）。内容物を約１分間、手動で混合した。
１０ｍｇの蒸気滅菌したＣＭ−１１１を秤量し、実施例５で述べたようにして調製したＩ型装置に加えた。体積１０ｍＬのスパイク水試料をそれぞれの装置に加え、表面滅菌したパラフィルムで装置をキャップした。内容物を室温（２５℃）で約約３０秒間、手で振盪することによって混合した。
混合後、それぞれの装置を、Ｔｈｅｒｍｏｌｙｎｅ Ｖａｒｉ Ｍｉｘ（商標）ロッキングプラットフォーム（Ｂａｒｎｓｔｅａｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｏｗａ、１４サイクル／分）上で異なる時間（それぞれ１、５、１０及び２０分間）インキュベートした。インキュベート後、それぞれの管をベンチトップに１０分間置いて粒子状の濃縮剤ＣＭ−１１１を沈降させた。沈降後、パラフィルムのラッピングを外し、予め滅菌したプランジャ装置を使用して箔シールに穿孔し、沈降したＣＭ−１１１剤を装置の下側部分内に堆積させた。ピペットを用いて上清を除去し、カミソリ刃を用いて装置の下側部分（細胞濃縮剤が入った）を装置の上側部分から分離した。沈降したＣＭ−１１１濃縮剤（約１００マイクロリットルの水中）を装置から取り出し、滅菌水で１：１００に希釈し、希釈した濃縮剤の１ミリリットルの一定分量を、製造者の指示に従って３Ｍ（商標）Ｐｅｔｒｉｆｉｌｍ（商標）Ａｅｒｏｂｉｃ Ｃｏｕｎｔプレート（３Ｍ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ）上にプレートした。
コントロールとして、初期希釈懸濁液を滅菌水で１：１０００の希釈度で更に希釈し、製造者の指示に従って３Ｍ（商標）Ｐｅｔｒｉｆｉｌｍ（商標）Ａｅｒｏｂｉｃ Ｃｏｕｎｔプレート（３Ｍ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ）上にプレートした。滅菌性のコントロールとして、粒子状物質も３Ｍ（商標）Ｐｅｔｒｉｆｉｌｍ（商標）Ａｅｒｏｂｉｃ Ｃｏｕｎｔプレート上にプレートした。それぞれのプレートを３７℃のインキュベーター（ＶＷＲ Ｏｒｂｉｔａｌ Ｓｈａｋｅｒ Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ，ＶＷＲ，Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）内で一晩インキュベートした。
すべてのプレートを、製造者の指示に従って３Ｍ（商標）Ｐｅｔｒｉｆｉｌｍ（商標）プレートリーダー（３Ｍ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ）により分析し、コロニーのカウントを得た。結果を表２に示す。結果は、下式によって計算した。
捕捉効率＝（濃縮剤上のコロニー数）／（スパイクコントロール中の全コロニー数）×１００
（実施例７）
ＩＩＩ型装置を使用したＣＭ−１１１による大腸菌の濃縮
単離した大腸菌（ＡＴＣＣ ５１８１３）のコロニーをストリークプレートから５ｍＬのトリプシン処理した大豆ブロス（ＴＳＢ、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ））に植菌し、３７℃で１８〜２０時間インキュベートした。約１０９個のコロニー形成単位／ｍＬのこの一晩培養物をフィルタ滅菌した脱イオン水（ＭｉｌｌｉＱ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＭＡ）中で希釈し、１０ｍＬのフィルタ滅菌した脱イオン水中でスパイクして１×１０３個／ｍＬ及び１×１０４個／ｍＬ（全体で約１×１０４／ｍＬ ｃｆｕ及び約１×１０５／ｍＬ ｃｆｕ）の最終濃度を得た。スパイクした水を、１０ｍｇの予め滅菌した（１２１℃、１５分）ＣＭ−１１１（Ｃｏｓｍｅｔｉｃ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ−１１１、３Ｍ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ Ｐａｕｌ）の粉末及び１００マイクロリットルの１００倍吸着緩衝液（ｐＨ ７．２）の入ったＩＩＩ型装置のハウジングに加えた。ハウジングを表面滅菌したパラフィルムで密封し、ロッキングプラットフォーム上に置いた。次いで、キャップした装置を、Ｔｈｅｒｍｏｌｙｎｅ Ｖａｒｉ Ｍｉｘ（商標）ロッキングプラットフォーム（Ｂａｒｎｓｔｅａｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｏｗａ、１４サイクル／分）上で５分間の接触時間にわたって室温（２５℃）でインキュベートした。次いで装置を振盪させずに（重力によって粒子を沈降させるため）５分間静置し（ロッキング及び沈降の全経過時間＝１０分間）、パラフィルムを取り外して、ＩＩ型装置のプランジャをハウジングに挿入し、ハウジングの底の方向に押し込むことによってバルク試料からＣＭ−１１１粒子を分離した。プランジャが破断可能なシールを破ると、約０．１ｍＬの液体試料に懸濁されたＣＭ−１１１粒子は、ハウジングの第２の貯留部に移された。ＣＭ−１１１粒子を第２の貯留部から回収して、１．５ｍＬの滅菌した微小遠心管に移した。体積１００ｍＬのＢａｃＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）をペレットに加え、ＶＷＲ Ｆｉｘｅｄ Ｓｐｅｅｄ Ｖｏｒｔｅｘミキサー上で５秒間（３２００ｒｐｍで５秒）ボルテックスして混合し、卓上型ルミノメーター（ＦＢ１２シングルチューブ型ルミノメーター、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＵＳＡ（Ｏａｋ Ｒｉｄｇｅ，ＴＮ））上で読み取った。大腸菌細胞の１×１０５個／ｍＬ及び１×１０６個／ｍＬの懸濁液から１００マイクロリットルの体積を試験することにより、ポジティブコントロール（「１００％シグナル」）を調製した。結果は、下式によって計算し、下記表３にまとめた。
ＡＴＰシグナル捕捉効率（％）＝（ＣＭ−１１１ペレットのＲＬＵ／１００％シグナルからのＲＬＵ）×１００
ＲＬＵ＝相対ルシフェラーゼ単位
Ｎ＝２、標準偏差＜１０％。データは、大腸菌コントロールについては水のみ（１６，４６４ＲＬＵ）のバックグラウンドに対して標準化し、細菌と接触させたＣＭ−１１１ペレットについては未反応のＣＭ−１１１（４１，４２４ＲＬＵ）のバックグラウンドに対して標準化した。
上記実施例から、粒子状の捕捉剤を使用して水性試料から細菌を濃縮できることが分かる。
（実施例８）
ＩＩ型装置を使用したＣＭ−１１１による大腸菌の濃縮。
単離した大腸菌（ＡＴＣＣ ３３０９０）のコロニーをストリークプレートから５ｍＬのトリプシン処理した大豆ブロス（ＴＳＢ、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ）に植菌し、３７℃で１８〜２０時間インキュベートした。約１０８個のコロニー形成単位／ｍＬのこの一晩培養物をフィルタ滅菌した脱イオン水（ＭｉｌｌｉＱ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＭＡ）中で希釈し、１０ｍＬのフィルタ滅菌した脱イオン水中でスパイクして１０３個／ｍＬ（全体で約１０４ｃｆｕ）の最終濃度を得た。スパイクした水を、１０ｍｇの予め滅菌した（１２１℃、１５分）ＣＭ−１１１（Ｃｏｓｍｅｔｉｃ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ−１１１、３Ｍ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ Ｐａｕｌ）の粉末及び１００マイクロリットルの１００倍吸着緩衝液が既に入っている装置に加えた。装置を表面滅菌したパラフィルムで密封し、ロッキングプラットフォーム上に置いた。キャップした装置を、Ｔｈｅｒｍｏｌｙｎｅ Ｖａｒｉ Ｍｉｘ（商標）ロッキングプラットフォーム（Ｂａｒｎｓｔｅａｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｏｗａ、１４サイクル／分）上で１分及び９分間（全経過時間＝２分及び１０分間）室温（２５℃）でインキュベートした。
インキュベートの後、パラフィルムを取り外し、プランジャを破断可能なシールと接触するまでハウジング内に挿入した。プランジャを更に挿入して破断可能なシールを破ることにより、大腸菌が結合したＣＭ−１１１が約１００マイクロリットルの液体試料とともにハウジングの第２の貯留部に移された。微小粒子なしの大腸菌が入ったコントロールの管を同様に処理した。
第２の貯留部を切り開いてＣＭ−１１１ペレットを回収し、粒子を１．５ｍＬの滅菌した微小遠心管に移した。体積１００ｍＬのＢａｃＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）をペレットに加え、ＶＷＲ Ｆｉｘｅｄ Ｓｐｅｅｄ Ｖｏｒｔｅｘミキサー上で５秒間（３２００ｒｐｍで５秒）ボルテックスして混合し、卓上型ルミノメーター（ＦＢ１２シングルチューブ型ルミノメーター、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＵＳＡ（Ｏａｋ Ｒｉｄｇｅ，ＴＮ））上で読み取った。１００％シグナルについては、１０５個／ｍＬの希釈液から体積１００マイクロリットルを使用した。結果は、下式によって計算し、下記表４にまとめた。
ＡＴＰシグナル捕捉効率（％）＝（ＣＭ−１１１ペレットのＲＬＵ／約１０４個の全大腸菌からのＲＬＵ）×１００
ＲＬＵ＝相対ルシフェラーゼ単位
Ｎ＝２、標準偏差＜１０％。データは、大腸菌コントロールについては水のみ（２７，９３８ＲＬＵ）のバックグラウンドに対して標準化し、細菌と接触させたＣＭ−１１１ペレットについては未反応のＣＭ−１１１（３０，６１１ＲＬＵ）のバックグラウンドに対して標準化した。
（実施例９）
ＩＩ型装置を使用したＡＢ−ＣＭ−１１１による大腸菌の濃縮
実施例８において述べた手順を用い、ＡＢ−ＣＭ（吸着緩衝液で処理したＣＭ−１１１）の１０ｍｇの一定分量についても、１０ｍＬの水からの大腸菌の濃縮について試験を行った。接触時間を９分、１分として、ＰＯＲＥＸプランジャを使用してＡＢ−ＣＭを沈降させた。データを表５にまとめた。
Ｎ＝２、標準偏差＜１０％。データは、大腸菌コントロールについては水のみ（２０，２８１ＲＬＵ）のバックグラウンドに対して標準化し、細菌と接触させたＣＭ−１１１ペレットについては未反応のＡＢ−ＣＭ（４４，４８８ＲＬＵ）のバックグラウンドに対して標準化した。
上記実施例から、粒子状の捕捉剤を使用して水性試料から細菌を濃縮できることが分かる。
（実施例１０）
比較例−非濃縮試料における大腸菌の検出。
現時点の技術水準における水試験法として、標準的なＡＴＰ生物発光アッセイ（例えば、３Ｍ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ）より入手可能な３Ｍ ＣＬＥＡＮＴＲＡＣＥ Ｗａｔｅｒ−Ｆｒｅｅ ＡＴＰ、カタログ番号ＡＱＦ１００）を用いて１００マイクロリットルの水をＡＴＰについて試験する方法がある。
トリプシン処理した大豆ブロス中での大腸菌の一晩培養物（ＡＴＣＣ ３３０９０）を、滅菌水で希釈して２つの懸濁液を得た。懸濁液Ａは、約１０３ＣＦＵ／ｍＬを含み、懸濁液Ｂは、約１０５ＣＦＵ／ｍＬを含んでいた。
それぞれの懸濁液の１００マイクロリットルの一定分量を体積１００マイクロリットルのＢａｃＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）と混合し、生じた生物発光を実施例８で述べたようにしてルミノメーターで測定した。結果を表６に示す。
Ｎ＝２、標準偏差＜１０％
本明細書に引用するすべての特許、特許出願及び公開公報、並びに電子的に入手可能な資料の開示内容の全体を援用する。本出願の開示内容と参照により本明細書に組み込まれるいずれかの文書の開示内容との間になんらかの矛盾が存在する場合には、本出願の開示内容が優先するものとする。上記の詳細な説明及び実施例はあくまで理解を助けるために示したものである。これらによって不要な限定をするものと理解されるべきではない。本発明は、図示及び説明された厳密な詳細に限定されるものではなく、当業者には明らかな変形例は特許請求の範囲によって定義される本発明に含まれるものとする。
特に指示がない限り、明細書及び添付の特許請求の範囲に使用される成分の量、分子量を表すすべての数は、すべての例において、「約」という用語により修正されることを理解されたい。したがって、特に断らないかぎり、本明細書及び添付の特許請求の範囲に記載される数値パラメータは、本発明が実現しようとする所望の性質に応じて変わりうる近似値である。少なくとも、また、均等論を特許請求の範囲に限定しようとするものではなく、それぞれの数値パラメータは少なくとも報告される有効数字の数を考慮し、更に通常の数値の端数処理を適用して解釈されるべきである。
本発明の広義の範囲で示す数値的範囲及びパラメータは近似値ではあるが、具体例に記載される数値は可能な限り正確に報告されている。しかしながら、数値はすべて、それぞれの試験測定値における標準偏差から必然的に生じる一定の範囲を本質的に含むものである。
すべての見出しは読者の便宜のためのものであって、特に断らないかぎり、見出しの後に続く文面の意味を限定するために使用されるものではない。

Claims (51)

  1. 試料中の細胞を検出する方法であって、該方法が、
    細胞濃縮剤、細胞抽出剤を含む放出要素及び液体試料を提供することと、
    前記液体試料と前記細胞濃縮剤とを所定の時間接触させることと、
    前記液体試料の少なくとも一部から前記細胞濃縮剤を分離することと、
    前記分離された細胞濃縮剤と前記放出要素とを含む液体混合物を形成する、ここで、前記細胞抽出剤は前記混合物中に放出される、ことと、
    前記細胞からの生物学的検体を検出すること、を含む方法。
  2. 試料中の細胞を検出する方法であって、該方法が、
    試料；細胞濃縮剤；細胞抽出剤を含む放出要素；第１及び第２の貯留部を備えたハウジングと前記試料を受容するように構成された開口部とを含む検出物品；及び前記細胞濃縮剤を分離して前記ハウジング内の第１の貯留部から第２の貯留部に移動させるための手段を提供することと、
    前記ハウジングの前記第１の貯留部内の液体媒質の中で、前記試料と前記細胞濃縮剤とを接触させることと、
    前記細胞濃縮剤を分離して前記ハウジング内の前記第２の貯留部に移動させることと、
    前記分離された細胞濃縮剤と前記放出要素とを含む液体混合物を形成する、ここで、前記細胞抽出剤は前記混合物中に放出される、ことと、
    前記細胞からの生物学的検体を検出することと、を含む方法。
  3. 試料中の細胞を検出する方法であって、該方法が、
    試料；前記試料を受容するように構成された開口部と、細胞濃縮剤が収容された第１の貯留部と、細胞抽出剤を含む放出要素が収容された第２の貯留部とを有する検出物品；前記細胞濃縮剤を液体試料の少なくとも一部から分離するための手段；及び前記細胞濃縮剤を前記ハウジング内の前記第１の貯留部から前記第２の貯留部に移動させるための手段を提供することと、
    前記ハウジングの前記第１の貯留部内の液体媒質中で前記試料と前記細胞濃縮剤とを接触させることと、
    前記細胞濃縮剤を分離して前記ハウジングの前記第２の貯留部に移動させることと、
    前記分離された細胞濃縮剤と前記放出要素とを含む液体混合物を形成する、ここで、前記細胞抽出剤は前記混合物中に放出される、ことと、
    前記細胞からの生物学的検体を検出することと、を含む方法。
  4. 前記放出要素が、マトリックス、コーティングされた基材、又はシェル構造を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記生物学的検体を検出することが、生きた細胞の存在を検出することを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記生物学的検体を検出することが、検出系を使用することを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記生物学的検体を検出することが、微生物細胞に関連する生物学的検体を検出することを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 体細胞抽出剤を提供する工程と、該体細胞抽出剤を前記試料からの細胞と接触させる工程とを更に含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記生物学的検体を検出することが、前記生物学的検体の量を定量することを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記生物学的検体の量が、２回以上定量される、請求項９に記載の方法。
  11. １回目の時点において検出される前記生物学的検体の量が、２回目の時点において検出される前記生物学的検体の量と比較される、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記生物学的検体を検出することが、細胞からのＡＴＰを検出することを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記細胞からのＡＴＰを検出することが、微生物細胞からのＡＴＰを検出することを含む、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記ＡＴＰを検出することが、細菌細胞からのＡＴＰを検出することを含む、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記細胞からのＡＴＰを検出することが、ルシフェリン及びルシフェラーゼが関与する反応においてＡＴＰを検出することを含む、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. ＡＴＰを加水分解することが可能な酵素を準備する工程と、該酵素を前記試料の少なくとも一部と接触させる工程とを更に含む、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記生物学的検体を検出することが、前記生物学的検体を免疫学的に検出することを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記生物学的検体を検出することが、前記生物学的検体を遺伝学的に検出することを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記生物学的検体を検出することが、前記試料中の生きた細胞から放出される酵素を検出することを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記酵素が、アデニル酸キナーゼ酵素を含む、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記生物学的検体を検出することが、比色測定法により、蛍光測定法により、電気化学的方法により、又は光量測定法により検出することを含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 一体型試料調製及び検出装置であって、
    それらの間に通路を有する第１の貯留部と第２の貯留部とを含むハウジングと、
    ここで、前記第１の貯留部は、試料を受容するように構成された開口部と、前記第１の貯留部内に配置された細胞濃縮剤とを含み、
    ここで、前記第２の貯留部は、その内部に配置された検出試薬を含み、
    前記第１の貯留部を前記第２の貯留部から隔離するための手段と、
    前記細胞濃縮剤を前記第１の貯留部から前記第２の貯留部に移動させるための手段と、を含む、一体型試料調製及び検出装置。
  23. 前記細胞濃縮剤が、粒子状の又は分散された細胞濃縮剤を含む、請求項２２に記載の装置。
  24. 前記ハウジングの前記第１の貯留部と前記第２の貯留部とを隔離するための手段が、プランジャ、弁、又は破断可能なシールを包含する、請求項２２又は２３に記載の装置。
  25. 前記細胞濃縮剤を前記ハウジングの前記第１の貯留部から前記第２の貯留部に移動させるための手段が、プランジャ、スワブ、又は弁を包含する、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の装置。
  26. 前記第１の貯留部が、テーパ形状の内壁を含む、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の装置。
  27. 細胞抽出剤を含む放出要素を更に含む、請求項２２〜２６のいずれか一項に記載の装置。
  28. 前記放出要素が、ビーズ、繊維、リボン、又はシートを含む、請求項２７に記載の装置。
  29. 前記放出要素が、コーティングされた基材を含む、請求項２７に記載の装置。
  30. 前記ハウジングが、前記第１の貯留部と前記第２の貯留部との間に配置された第３の貯留部を更に含む、請求項２２〜２９のいずれか一項に記載の装置。
  31. 前記放出要素が、前記第３の貯留部内に配置される、請求項３０に記載の装置。
  32. 貯留部内に配置される体細胞抽出剤を更に含む、請求項２２〜３１のいずれか一項に記載の装置。
  33. プランジャを更に備える、請求項２２に記載の装置。
  34. 前記プランジャが、流体経路を含む、請求項３３に記載の装置。
  35. 前記流体経路が、その中に配置されたフィルタを含む、請求項３４に記載の装置。
  36. 前記フィルタが、微多孔性フィルタを含む、請求項３５に記載の装置。
  37. 前記プランジャが、スクレーパーを更に含む、請求項３３に記載の装置。
  38. 前記スクレーパーが、前記スクレーパーの縁部と前記ハウジングとの間に液体を通過させるように構成される、請求項３７に記載の装置。
  39. キットであって、
    それらの間に通路を有する少なくとも２個の貯留部を含むハウジングと、
    ここで、第１の貯留部は、試料を受容するように構成された開口部を含み、
    ここで、第２の貯留部は、その内部に配置された検出試薬を含み、
    前記第１の貯留部を前記第２の貯留部から隔離するための手段と、
    細胞濃縮剤と、
    前記細胞濃縮剤を前記第１の貯留部から前記第２の貯留部に移動させるための手段と、を含むキット。
  40. 前記ハウジングが、前記細胞濃縮剤を前記第１の貯留部から前記第２の貯留部に移動させるための手段を含む、請求項３９に記載のキット。
  41. 前記細胞濃縮剤が、前記ハウジングの前記第１の貯留部の中に配置される、請求項３９又は４０に記載のキット。
  42. 前記細胞濃縮剤が、粒子状の又は分散された細胞濃縮剤を含む、請求項３９〜４１のいずれか一項に記載のキット。
  43. 微生物細胞抽出剤を含む放出要素を更に含む、請求項３９〜４２のいずれか一項に記載のキット。
  44. 体細胞抽出剤を更に含む、請求項４３に記載のキット。
  45. 試料取得装置を更に備える、請求項３９〜４４のいずれか一項に記載のキット。
  46. プランジャを更に備える、請求項３９〜４５のいずれか一項に記載のキット。
  47. 前記プランジャが、流体経路を含む、請求項４６に記載のキット。
  48. 前記流体経路が、その中に配置されたフィルタを含む、請求項４７に記載のキット。
  49. 前記フィルタが、微多孔性フィルタを含む、請求項４８に記載のキット。
  50. 前記プランジャが、スクレーパーを更に含む、請求項４６に記載のキット。
  51. 前記スクレーパーが、前記スクレーパーの縁部と前記ハウジングとの間に液体を通過させるように構成される、請求項５０に記載のキット。
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